一种基于胶乳的三聚氰胺快速检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了包被有三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液及其制备方法，包含包被有三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液的试剂盒，以及使用包被有三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液检测样品中三聚氰胺的方法。
【专利说明】一种基于胶乳的三聚氰胺快速检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学、医学、生物学和食品安全的交叉学科领域，更具体涉及一种基于聚苯乙烯胶乳微球检测三聚氰胺的方法。
【背景技术】
[0002]在食品行业中，通过凯式定氮法(GB/T5009.5-2010 ;第一法)测定氮原子含量从而间接计算蛋白质含量。近年来，一些不法商贩将化工原料三聚氰胺添加到食品或饲料中，以求提高通过凯式定氮法测定的表观蛋白含量。三聚氰胺可导致人体泌尿系统产生结石，如膀胱结石和肾结石等疾病，因此被严格禁止添加到食品中。
[0003]目前三聚氰胺的检测方法有高效液相色谱法、液质联用、气质联用法等，这些方法虽然检测灵敏度高，但前处理步骤操作时间长，仪器价格昂贵，且需取样并送回实验室进行检测，不适合样品中三聚氰胺的现场快速筛查。目前可用于现场快速检测的方法如酶联免疫吸附试验，相较之下应用起来较灵活，但检测成本依然很贵，对技术操作人员操作也有一定的技术要求，而胶体金卡虽然操作十分简便、但只能是定性分析，不能实现准确的定量分析。
[0004]免疫比浊法(J.M.Singer et al.，Am.J.Med.21，888-92; 1956)主要用于微生物和病毒感染等的检测和临床诊断。在免疫比浊法中，将抗体包被在微球表面。当包含特定抗原的样品与乳胶悬液混合时，导致可见的凝集，增加了样品的浑浊度。通过测量样品与抗体包被乳胶悬液反应后的吸光度，并与使用已知浓度的抗原绘制的标准曲线进行比较，从而测定样品中抗原的浓度。
[0005]免疫比浊法中使用的微球包括多种类型，例如玻璃、硅石、纳米金属、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺颗粒等。可通过被动吸附或化学共价偶联，例如碳化二亚胺(EDC)法、溴化偶联等方式将抗体连接到微球上。在胶乳微球表面包被抗体的方法通常需要首先活化胶乳微球表面的官能团，使其能够与抗体蛋白反应。例如，通常使用EDC活化胶乳微球表面的羧基，使其与蛋白质的氨基偶联。
[0006]通常认为通过使用碳化二亚胺(EDC)/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的活化法更有利于蛋白质与微球之间的相互作用，因此是最为常用的偶联方法。此外，还有使用EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合物的活化法。然而，这两种方法中要先后使用两种试剂，反应系统和方法较为复杂，极易导致微球发生凝集，不利于抗体包被微球的工业化生产。
[0007]与此相比，单独使用EDC的活化法(或称作一步EDC法)的步骤较为简单且产率较高。然而，一步EDC法多用于不包含羧基的配体(例如寡核苷酸，如DNA)与表面带有羧基的微球之间的偶联。如果待偶联的配体也包含羧基基团(例如蛋白质，如抗体)，其可能被EDC活化，导致配体之间的聚合，从而无法获得期望的产物。
[0008]因此，需要开发一种避免微球或抗体之间相互凝集产生沉淀，从而适合稳定生产抗体包被微球的生产工艺，从而获得能够利用免疫比浊法快速、准确检测样品中的三聚氰胺。
【发明内容】
[0009]目前，EDC活化法中多使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)作为活化缓冲剂，但本发明人经实验发现使用MES缓冲的EDC溶液无法制备包被三聚氰胺抗体的微球溶液。本发明人经大量实验表明，在胶乳体系中，加入活化液后极易使带羧基的微球相互凝集产生沉淀，保持胶乳状态则需要改进活化缓冲液的成分。因此，本发明人对EDC活化法进行了大量研究，结果发现包含吐温20的磷酸盐缓冲液能够提供有利于抗体与微球之间偶联的最适环境，能够避免微球相互凝集产生沉淀，适合稳定生产抗体包被微球，从而完成了本发明。
[0010]在第一方面，本发明提供了一种包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液的制备方法，所述方法包括以下步骤:将表面带有羧基的胶乳微球稀释在活化缓冲液中，其中，所述活化缓冲液为包含0.5?1.0g/L吐温20的10?40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4-7.8。
[0011]在优选的实施方案中，本发明的制备方法使用一步EDC活化法活化所述胶乳微球表面的羧基。在本发明中，术语“一步EDC活化法”是指在活化过程中不使用除碳化二亚胺外的其他活化剂的EDC活化法。所述“其他活化剂”包括诸如Sulfo-NHS、NHS的试剂。
[0012]在一个【具体实施方式】中，本发明的制备方法包括以下步骤:
[0013]I)将表面带有羧基的胶乳微球稀释在活化缓冲液中，其中，所述活化缓冲液为包含0.5?L Og/L吐温20的10?40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4-7.8。
[0014]2)加入活化剂混合反应，其中所述活化剂为碳化二亚胺；
[0015]3)加入三聚氰胺单克隆抗体，进行包被反应；
[0016]4)加入淬灭液终止反应；
[0017]5)加入封闭液以封闭游离的羧基，从而获得包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。
[0018]在本发明中，所述胶乳微球可以是通常用于免疫检测的任何胶乳微球，例如聚苯乙烯微球、聚丙烯酰胺微球等。已知有很多厂商提供各种不同型号的胶乳微球，例如Microparticles GmbH,PolyMicrospheres Inc.等。本领域技术人员可以根据具体需要选择适合的表面带有羧基的胶乳微球。
[0019]在本发明中，优选使用聚苯乙烯胶乳微球。本发明所述胶乳微球的粒径可以在100-200nm之间,优选130_170nm。在本发明中，使用表面带有羧基的胶乳微球,从而通过碳化二亚胺反应与三聚氰胺单克隆抗体连接。所述胶乳微球的羧基含量为100-200 μ eq/g，优选 160 ?170μ eq/g。
[0020]在本发明中，碳化二亚胺的加入量可由本领域技术人员根据具体需要确定。例如，可以加入羧基数量15%-30%的碳化二亚胺。
[0021]本发明使用的三聚氰胺单克隆抗体可以通过本领域已知的方法制备，例如杂交瘤技术等；也可以通过商购获得，例如购自北京博奥生物技术有限责任公司(型号bsm-2182M)等。
[0022]在本发明中，胶乳微球与三聚氰胺单克隆抗体之间的比例可由本领域技术人员根据具体需要确定。胶乳微球与三聚氰胺单克隆抗体之间的比例通常在5:1至10:1之间，优选10:1。所加入的抗体过多或过少都易导致胶乳微球发生凝集。
[0023]本发明使用的淬灭液可以是通常用于终止碳化二亚胺连接反应的任何试剂，例如60-80g/L甘氨酸,优选75g/L甘氨酸。[0024]本发明使用的淬灭液可以是通常用于封闭胶乳微球游离的羧基的任何试剂，例如血清白蛋白，如180-220g/L牛血清白蛋白，优选200g/L牛血清白蛋白。
[0025]由本发明所述方法制备的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液可以现配现用。在使用时，通过离心去除上清，使用复溶液清洗胶乳微球，并定容至指定的浓度。所述复溶液可以包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L叠氮钠、8_13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和
1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2。
[0026]优选地，所述复溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L叠氮钠、10.0g/L山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
[0027]也可以将按照本发明所述方法制备的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球复溶在所述复溶液中，并在2?8° C下低温保存。
[0028]在一个实施方式中，本发明所述的制备方法包括以下步骤:
[0029]I)使用活化缓冲液将粒径130_170nm，羧基含量为160?170 μ eq/g的聚苯乙烯胶乳微球稀释1%的胶乳液，其中所述活化缓冲液包含0.5?lg/L吐温20的10?40mM磷酸盐缓冲液，ρΗ7.4-7.8 ；
[0030]2)加入羧基数量15%_30%的碳化二亚胺，混匀后反应5min ；
[0031]3)以胶乳微球与三聚氰胺单克隆抗体为10:1的比例加入三聚氰胺单克隆抗体，并在37。C、300rpm反应2-3小时；
[0032]4)加入75g/L甘氨酸，中止包被反应；
[0033]5)加入200g/L牛血清白蛋白，在37° C、300rpm反应30_60min，从而封闭游离的
竣基;
[0034]6)离心去除上清，使用复溶液清洗，其中所述复溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L 叠氮钠、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2，ρΗ8.0-8.2 ；
[0035]7)重复步骤6)三次，随后使用所述复溶液定容至胶乳浓度为0.1%，并在2-8° C下低温保存。
[0036]与常用的MES缓冲活化液相比，本发明采用的活化缓冲液提供了三聚氰胺单克隆抗体与表面带有羧基的胶乳微球进行偶联的最适离子浓度和ΡΗ，避免了在加入三聚氰胺抗体后发生不利的凝集现象。
[0037]本发明采用的复溶液提供了有利于包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液保持稳定的最适离子浓度和pH。使用所述复溶液可以将包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液在常温下保持I年以上，同时避免抗体脱落。
[0038]在第二方面，本发明提供了所述活化缓冲液用于制备包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液的用途。
[0039]在第三方面，本发明提供了一种用于检测样品中三聚氰胺的试剂盒，所述试剂盒包含以下组分:
[0040]I) Rl试剂:包含PEG6000和吐温20的磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.6 ；
[0041 ] 2) R2试剂:包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液；和
[0042]3)三聚氰胺标准品。
[0043]所述Rl试剂是通常用于免疫比浊法的缓冲剂。本领域技术人员可以根据需要配制适合的缓冲剂。在本发明中，可使用包含PEG6000和吐温20的磷酸盐缓冲液，例如包含3%PEG6000和(λ 2%吐温20的40mM磷酸盐缓冲液，pH7.0-7.6，优选ρΗ7.4。在需要长期保存的情况下，还可任选地添加0.1%叠氮钠以用作防腐剂。
[0044]所述R2试剂是包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。所述三聚氰胺抗体和胶乳微球如本发明第一方面所述。优选地，所述R2试剂是根据本发明第一方面所述制备方法制备的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。所述胶乳微球溶液的浓度可以为1%(10倍浓缩液)或 0.1%。
[0045]所述试剂盒还可任选地包含使用所述试剂检测样品中三聚氰胺的说明书。
[0046]与常规检测三聚氰胺的方法相比，本发明所述的试剂盒操作简单、成本低、检测速度快，且能定量进行分析。
[0047]所述试剂盒可用于检测样品中三聚氰胺的浓度。因此，在第三方面，本发明提供了所述试剂盒用于检测样品中三聚氰胺浓度的应用。所述样品可以为食品，特别是乳制品，如鲜奶、奶粉、奶酪，奶油和酸奶。
[0048]第四方面，本发明提供了一种用于检测样品中三聚氰胺浓度的免疫比浊方法，其包括以下步骤:
[0049]I)将所述样品与包含PEG6000和吐温20的磷酸盐缓冲液(ρΗ7.0-7.6)，混合温育；
[0050]2)加入包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液；
[0051]3)测量所得混合物在加入所述胶乳微球溶液后1s至5分钟之间任意两个时间点的吸光度差值AA54tl ；
[0052]4)根据使用三聚氰胺标准品绘制的标准曲线确定样品中的三聚氰胺浓度。
[0053]使用三聚氰胺标准品绘制的标准曲线的方法是本领域已知的。通常，将浓度已知的三聚氰胺标准品与适合的缓冲剂(例如，本发明所述的Rl试剂)混合温育，随后，加入包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液，混合后温育5分钟，并根据吸光度的变化绘制标准曲线。
[0054]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0055]本发明所述三聚氰胺检测试剂盒及其方法，通过加入Rl、R2两种试剂，根据反应前后吸光度变化而定量分析样品三聚氰胺的浓度。
[0056]本发明所有试剂配制简单、操作容易，R2试剂中偶联物不易脱落，稳定性很强，试剂制作成本低，耗时短，能够在较短时间内大量生产。对检测的技术人员的技术要求不高、检测速度快、检测全过程只需7分钟，此外，不依赖专业仪器，可以真正实现实时快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]图1为显示不同浓度的三聚氰胺标准品在反应过程中吸光度变化的反应曲线图，其中横坐标为反应时间，纵坐标为吸光度变化。
[0058]图2为不同时间下测得的标准曲线，其中横坐标为反应物浓度(ppb)，纵坐标为吸
光度变化。
[0059]图3为根据不同浓度标准品的吸光度差值绘制标准曲线，其中横坐标为反应物浓度(PPb)，纵坐标为吸光度变化。
[0060]图4为显示稳定性实验的对比结果，其中，横坐标为反应时间(min)，纵坐标为吸光度变化。检测浓度为27ppb，时间间隔为7天、在37度条件下保存。【具体实施方式】
[0061]以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些【具体实施方式】。
[0062]实施例1:缓冲剂Rl的配制
[0063]40mM、PH7.4的PBS配制:①称取磷酸二氢钠0.0624g，用超纯水定容10ml ;②称取磷酸氢二钠7.16g，用超纯水定容500ml ;③称取氯化钠0.14g，加入①试剂3.8ml和②试剂 16.2ml。
[0064]此为40mM，PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
[0065]Rl的配制:
[0066]PEG6000 0.3g
[0067]叠氮钠0.0lg
[0068]吐温-2020ul
[0069]称量好各种化学品后，用40mM、PH7.4的PBS定容至1ml。
[0070]由于PEG6000在常温下不溶解，因此将该试剂放置60度水浴锅中加热，并不断搅动混匀。溶解后的试剂为无色透明液体。
[0071]配好试剂后于2-8° C冰箱中保存，，保存期限为12个月。
[0072]实施例2:用于制备和保存包被三聚氰胺抗体的胶乳微球的试剂
[0073]活化缓冲液:
[0074]1mM的PBS (PH7.4)的准备:将实施例1制备的40mM的PBS稀释四倍，随后，在所得1mM PBS中加入0.70g/L的吐温-20。
[0075]复溶液:
[0076]甘氨酸11.3g/L
[0077]叠氮钠1.0g/L
[0078]山梨醇10.0g/L
[0079]BSA 5.0g/L
[0080]EDTA.Na2 2.0g/L
[0081]先称量各种固体化合物，然后用超纯水定容，为增加溶解速度，可置于37度温箱中。最后，加氢氧化钠溶液(20%)调PH8.00±0.08。配好的试剂为无色澄清透明的液体。配制好的复溶液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限为12个月。
[0082]淬灭液:
[0083]甘氨酸75g/L
[0084]称取甘氨酸后，用超纯水定容。混匀后，该溶液为无色透明液体。配好试剂后于2-8度冰箱中保存。保存期限为60天。
[0085]封闭液:
[0086]BSA 200g/L
[0087]称量BSA固体，用超纯水定容，放置60度水浴锅中，边加热边摇动瓶子，加速溶解。溶解后的BSA溶液为淡黄色的液体。配制好的封闭液可保存在2-8° C冰箱中，保存期限为60天。[0088]实施例3:包被三聚氰胺抗体的胶乳微球的制备工艺
[0089]反应体系为10ul。
[0090]活化
[0091]取1.5ml离心管，加入活化缓冲液70ul，用移液器取1ul的聚苯乙烯胶乳微球(购自美国PolyMicrospheres公司，粒径大小130_170nm,羧基含量160-170 μ eq/g)到此离心管中，不断吹打，使胶乳颗粒均匀的分散到活化缓冲液中，从而获得白色乳浊液。
[0092]称量固体碳化二亚胺盐酸盐(EDCA ;购自上海共价化学科技有限公司)溶于活化缓冲液中，浓度为0.001mg/ul。在上述胶乳颗粒缓冲液中加入1ul EDCA溶液，在常温下活化5min。活化好的胶乳体系仍为白色乳浊液，但粘稠度有所下降。
[0093]偶联
[0094]将活化好的胶乳体系加入三聚氰胺单克隆抗体(购自北京博奥森生物技术有限责任公司，型号bsm-2182M)，加入量为1ul (10mg/ml )，添加时应迅速用枪头吹打，尽量在短时间内快速混匀。混匀后得到白色乳浊液。将加有三聚氰胺抗体的胶乳体系置于37° C、300rpm的恒温振汤器中反应2小时。完成后体系仍为白色乳池液。
[0095]淬灭
[0096]此时三聚氰胺胶乳偶联物已形成，在体系中加入淬灭液80ul，用枪头吹打混匀，于37度、300rpm恒温振荡器中反应30min。结束后体系应无沉淀物。
[0097]封闭
[0098]加入封闭液17ul，用枪头吹打混匀，放置于30度、300rpm恒温振荡箱中，封闭时间为45min。封闭结束后,该体系为白色乳浊液,且无沉淀物。
[0099]纯化
[0100]将离心管放入冷冻高速离心机中，45000g、8min离心(注:在离心前应将离心机预冷到10度，防止高速离心时产生较高温度)，离心后，白色胶乳微球大部分都沉淀在离心管底部，上清液中含有极少量微球，但仍然看起来无色透明，倒掉上清液，或用枪头将上清液取出，加入10ul复溶液，用枪头吹打混匀，再置于超声波清洗仪中将微球分散。超声波清洗仪功率99%，时间lmin。重复此步骤三次。最后一次加入复溶液lml。
[0101]此时溶液为白色乳浊液，经检测体系中没有无颗粒状沉淀。此为R2试剂，吸光度约为0.2-0.9，如吸光度过高，可再次进行稀释。
[0102]保存
[0103]该试剂应置于2-8° C冰箱中密封保存，保存期限为12个月。
[0104]实施例4:不同EDC活化方法对胶乳系统稳定性的影响
[0105]在本实施例中，采用常规的EDC+NHS的活化方法进行胶乳微球的活化，并与本发明的活化方法进行比较。具体步骤如下:
[0106]首先，按照实施例3的描述使用EDC活化胶乳微球:
[0107]用移液器取1ul的聚苯乙烯胶乳微球(购自美国PolyMicrospheres公司，粒径大小130_170nm，羧基含量160-170 μ eq/g)到离心管中，不断吹打，使胶乳颗粒均匀的分散到本发明的活化缓冲液中，至终浓度1%。
[0108]称量固体EDCA(购自上海共价化学科技有限公司)溶于本发明的活化缓冲液中，浓度为0.001mg/ul。在上述胶乳颗粒缓冲液中加入1ul上述EDCA溶液，振荡混匀，反应5min，测吸光值I。
[0109]随后，将所得胶乳微球平均分成两份，其中一份不添加NHS，另一份加入NHS，用量约为EDC用量的2-3倍，混匀后，测量两份样品的吸光值2。
[0110]表1:不同活化方法对胶乳体系稳定性的影响
[0111]
【权利要求】
1.一种包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液的制备方法，其包括: 1)将表面带有羧基的胶乳微球稀释在活化缓冲液中，其中，所述活化缓冲液为包含0.5?lg/L吐温20的10?40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4-7.8 ； 2)加入活化剂，混合反应，其中所述活化剂为碳化二亚胺； 3)加入三聚氰胺单克隆抗体，进行包被反应； 4)加入淬灭液终止反应；和 5)加入封闭液以封闭游离的羧基，从而获得包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其中，使用一步EDC活化法活化所述胶乳微球表面的羧基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述活化缓冲液为包含0.7g/L吐温20的1mM磷酸盐缓冲液，PH7.4。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述胶乳微球为粒径为100-200nm，羧基含量为100-200 μ eq/g的聚苯乙烯胶乳微球。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤: 6)将步骤5获得的胶乳微球溶液离心去除上清，使用复溶液清洗，其中所述复溶液包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L叠氮钠、8-13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2 ；7)重复步骤6)三次，随后将溶于所述复溶液的胶乳溶液在2-8°C下低温保存。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述复溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L叠氮钠、10.0g/L 山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。
7.通过权利要求1-6中任一项所述方法制备的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。
8.用于检测样品中三聚氰胺的试剂盒，其包含: 1)Rl试剂:包含PEG6000和吐温20的磷酸盐缓冲液，ρΗ7.0-7.6 ； 2)R2试剂:权利要求7所述的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液；和 3)三聚氰胺标准品。
9.一种用于检测样品中三聚氰胺浓度的方法，其包括以下步骤:1)将所述样品与包含PEG6000和吐温20的磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.6)，混合温育； 2)加入权利要求7所述的包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液； 3)测量所得混合物在加入所述胶乳微球溶液后1s至5分钟之间任意两个时间点的吸光度差值ΛΑ540 ;和 4)根据使用三聚氰胺标准品绘制的标准曲线确定样品中的三聚氰胺浓度。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述样品选自鲜奶、奶粉、奶酪、奶油和酸奶。
【文档编号】G01N33/577GK104034893SQ201310074726
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2013年3月8日
【发明者】王琳, 张小波, 郑清林 申请人:北京普析通用仪器有限责任公司