专利名称：：用于中药农业自毒作用评价的方法
技术领域：
：本发明为中药资源可持续发展的关键技术，具体涉及中药农业自毒作用评价方法。*
背景技术：
：1中药材连作障碍及原因药用植物栽培中，存在一个突出问题，即随着栽培年龄的增加或栽培地的连作，植株生育不良，品质和产量均大幅度下降。生产实践中发现，土壤环境恶化是药用植物栽培中普遍存在的问题，绝大多数根和根茎类药材"忌"连作。如地黄连作引起严重病毒病，药材减产，同一块地在8~10年左右不能重茬；人参栽种到5-6年后发病率急剧增加，而且连作障碍严重，老参地通常几十年不能重茬，等等。近年来，随着栽培面积的不断扩大及中药材规范化种植(GAP)的推行，药用植物栽培中的土壤环境恶化及连作障碍的危害日益突出。药用植物多为宿根植物，生长周期多为2年，几年甚至几十年。这与生长周期短的作物不同，土壤环境恶化不仅表现为重茬，还表现为随栽培年龄增加出现的一系列土壤环境问题。对于多年生或连作药用植物，由于耕作，施肥、灌溉等方式固定不变，会导致土壤理化性质恶化，肥力降低，有毒物质积累，有机质分解缓慢，有益微生物种类和数量减少。因此，土壤环境恶化是药用植物栽培中无法回避的问题，不能仅借助常规的轮作倒茬解决。而对药用植物次生代谢产物的追求加剧土壤环境恶化。引起植物连作障碍的原因主要有土壤养分失衡、土壤微生物群落结构改变、植物毒素物质增加及土壤物理化学性质改变等。2药用植物自毒作用植物在生长发育过程中不断与根际土溶液进行着物质与能量的交换，通过各种途径(如地上部分淋溶、根系分泌、植物残体分解等)进入根际区的源于植物自身的化学物质，直接影响着根际区土壤中微生物的群落结构，微生物分解代谢又会产生新的化学物质，如此不断地影响和改变着根际区微生态生境，反过来又对植物自身的生长发育产生影响。植物在长期适应环境的过程中，往往通过向环境释放化学物质来抑制种内外其它植物的生长以提高其自身的生存竞争力，这种现象被称为化感作用(Allelopathy)。自毒现象(autotoxicity)是化感作用的重要形式之一，它是指植物根分泌和残茬降解所释放出的次生代谢物，对自身或种内其它植物产生危害的一种现象，它是植物适应种内竞争的结果，许多作物的连作障碍与此相关。自毒作用是植物长期适应种内竞争的重要策略，在群体水平上实现了优胜劣汰，对物种的进化具有积极的作用。但就栽培中药材而言，植物自毒造成的经济损失是显而易见的。因此，揭示自毒作用在药用植物连作障碍中的地位具有重要意义。中药农业可采用间作套作制度、避免连作等手段来缓解甚至是克服中药的自毒现象。近年来，通过遗传育种或转基因工程的手段和方法，筛选自毒作用小的品种引起人们的重视。3药用植物化感作用及自毒作用的研究方法自毒物质的提取分离和鉴定及其生物活性的检测是研究植物化感作用的基础，通常以待测样品的植物部分，或者是与它相关的环境土壤作为提取源进行提取分离。药用植物自毒现象研究至今沿用化感作用研究方法，缺少自己独特的方法学体系。尤其是在完成化学分离鉴定后，如何评价根际土与药材中所含次生代谢产物的相似度，至今是个空白。*
发明内容本发明的目的是提供一种用于中药农业自毒作用评估的方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。本发明所述的用于中药农业自毒作用评估的方法，具体包括如下步骤1)制备样品分别取原植物根茎和根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后采用有机溶剂萃取，确定样品所含化学成分的种类及含量；2)自毒物质相似性比较利用JC系数评价原植物的自毒作用JC=c/(a+b+c)%，公式中a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分数目，c为原植物根茎与根际土中3共有组分的数目；当JC大于5(W，表示有自毒作用存在，75%在自毒作用明显，大于90%有严重自毒作用。通过种子发芽实验，在完成化感作用生物学检测的基础上，根据次生代谢指纹图谱的思路，使用不同溶剂分别提取药材及根际土溶液，利用GC-MS、HPLC-MS等化学分离鉴别手段，分别对药材及根际土所含化学物质进行分离鉴别，结合本发明所用JC系数，评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否为药用植物化感作用的主导因子。JC为JC=c/(a+b+c)%,a为药材中特有组分数目，b为根际土中特有组分数目，c为药材与根际土中共有组分的数目(a，b所代表组分归一化百分含量大于iy。，c所代表两个共有组分中至少有一个的归一化百分含量大于>1%)。*图1不同浓度苍术根茎及根际土提取液对苍术种子发芽率、胚根长及胚芽长的影响I代表误差线图2苍术根茎及根际土乙醚及乙酸乙酯萃取液GC-MS色谱图aa根茎乙醚萃取液，sa根际土乙醚粗取液，ae根茎乙酸乙酯萃取液，se根际土乙酸乙酯萃取液*具体实施例方式下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围，本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。1自毒物质的提取和试样的制备自毒物质的提取和试样的制备即是化学分析的必要步骤，也是生物学分析的基础。根据自毒物质进人环境的途径，常用水作为浸提溶剂在常温条件下提取。同时在化感作用的研究中不应使用研碎的植物材料，因为在粉碎研磨过程中很多在自然条件下不释放的酶、氨基酸、无机盐和含氮物质也释放出来，也会使提取液的渗透势异常ra值发生变化。由于自毒物质具有浓度效应，同一种自毒物质在不同浓度下其作用的程度及性质不同，浸提液的浓度应该在自然状态下可能的浓度范围内。如果将植物栽种在无菌水、培养液或固体介质中，培养一段时间后，取培养液(基)收集根系分泌物进行分析。2化感作用的生物测定生物测定(bioassay)是植物化感研究非常重要的手段。根据研究对象特点和实验条件，可选用以下一种或几种方法进行生物测定①种子萌发试验最常用的种子萌发实验是在大小合适的培养皿或三角瓶中进行，将经挑选的种子放入含有不同浓度自毒物质的滤纸或琼脂上，在有合适光照和温度的培养箱中进行培养。种子萌发的标准是胚根突破种皮l-2mm，萌发的时间根据植物的不同一般为l-7d，用种子萌发的百分率来表示。为解释自毒物质对种子萌发的延缓作用，可以采用萌发指数(I)来定量，连续5d记录种子萌发情况，I用如下方法计算:1=2(5XX1+4XX2+3XX3+2XX4+1XX5)，式中X是指每隔24h萌发的种子数；Xl=24h记录的萌发数；X2=48h记录的萌发数，依次类推。②幼苗生长发育实验它指受体植物在最初的生长发育、器官形成过程中的生物测定，逋常用胚根、下胚轴或胚芽鞘的伸长来表示，也可以通过称量叶、茎、根的干质量(生物重)来衡量自毒物质作用的强弱。幼苗生长生物测定的敏感性一般比种子发芽要好。③挥发性物质测定对于测定挥发性物质化感作用，可在密闭的容器中将植物材料或挥发性物质放在底部和上部，将无盖的培养皿放在中间进行种子萌发实验，容器必须每天通气以保证足够的氧气供应。3自毒物质分离鉴定自毒物质的分离包括各种中药化学研究中常用的萃取法、色谱法等。当前，自毒物质化学鉴别应用最多的为气质联用及液质联用技术。本发明为了评价中药自毒作用，在自毒物质的提取和制备、自毒物质的生物学评价及自毒物质的物质的分离鉴定中，均要求同时提取、分析和鉴定根际土壤及药材2套样品。4自毒物质相似性比较对于生物学检验证明根际提取物及药材提取物对该药用植物本身有明显抑制作用(自毒作用)的中药材，利用本发明所用JC系数，结合分离鉴别到的自毒物质，评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否为药用植物化感作用的主导因子及自毒作用的大小。JC为JC=c/(a+b+c)%，a为药材中特有组分数目，b为根际土中特有组分数目，c为药材与根际土4中共有组分的数目(a，b所代表组分归一化百分含量大于W，c所代表两个共有组分中至少有一个的归一化百分含量大于》1%)。当JC大于50。/。，表示有自毒作用存在，75%在自毒作用明显，大于90%有严重自毒作用。5研究实例本发明是在中药苍术自毒作用的研究中形成的。苍术为常ffl中药材，栽培苍术连作障碍严重，认为与植物自毒有关。具体操作如下-(1)自毒物质的提取和试样的制备取苍术根茎40g,加蒸馏水适量，25。C浸泡24小时，减压抽滤，定容至200mL,得到相当于苍术根茎200mg/ml的上清液，编号A200。将A200分别稀释4倍和20倍，得到相当于苍术根茎50，10mg/ml溶液，编号A50和A10。取苍术根际土200g，加蒸馏水400mL，25'C浸泡24小时，减压抽滤，得到相当于苍术根际土500mg/mli:清液，编号S500。将S500分别稀释2.5倍和10倍，得到相当于苍术根际土200、50mg/ra丄的溶液，编号S200和S50。用作苍术化感作用的生物学的研究。(2)化感作用的生物测定设水(编号CK)，AIO、A50、A200、S50、S200及S500共7个处理，每个处理3个重复。每个重复选取20粒种子，0.1%HgCl消毒lOmin，随机铺在垫有滤纸的直径为15cm的培养皿中，分别加入水、不同浓度根茎或根际土水提液各5mL,在25'C恒温培养箱内培养。不断观察，第5天测量发芽率、第7测量胚根长，第14天测量胚芽长。通过SPSS10.0软件，利用单因子方差分析结合多重比较分析种子发芽率、胚根长及胚芽长的差异。结果50mg/mL及200mg/niL根际土提取液对苍术种子发芽率、胚根长及胚芽长均无影响。500mg/mL根际土提取液对苍术种子发芽率无影响，稍抑制了苍术胚根与胚芽的伸L《但差异不显著(p>0.05，图l)。单因子方差分析结合多重比较分析表明，随苍术根茎提取液浓度的增大，其对苍术种子发芽率、胚根和胚芽伸长的抑制作用显著增大。经200mg/mL苍术根茎提取液处理的苍术种子发芽率、胚根长及胚芽长分别为对照的13%、32%及24%(p<0.05，图1，表1=。表l不同浓度苍术根茎提取液处理对苍术种子发芽率、胚根长及胚芽K的影响浓度(mg/mL)发芽率(％)胚根长(％)胚芽长(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>同一列标有不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)(3)自毒物质分离鉴定取苍术根茎及根际土样品适量，蒸馏水浸泡24小时，其间多次震摇。离心使苍术根茎及土壤沉淀，上清液抽滤。滤液加入等量乙醚萃取得到乙醚萃取液，剩余水提液再用等量乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液。所得乙醚及乙酸乙酯萃取液分别用旋转蒸发仪在4'C浓縮至干，再分别用乙醚或乙酸乙酯lmL溶解，用于GC-MS分析。乙醚及乙酸乙酯均为分析纯。气质联用仪器为TRACEGC2000，DB-5MS石英毛细管柱0.25mmlDX30raX0.25nm，进样温度250'C，程序升温从60'C到290°C，15°Cmin—'，载气为He。EI源，70ev，接口温度25(TC，源温200'C,检测温度20(TC，进样量lyl，35650全扫描。应用MAINLIB质谱数据库计算机检索系统分析质谱图，进行未知物的鉴定。结果利用GC-MS分析，从苍术根茎中共鉴定出20个化合物，根际土共鉴定出27个化合物(图2、表2)，包括烷、醇、苯、萘、酸及酯等成分。表2所列出的化合物均属GC-MS鉴定匹配度大于75呢的化合物。表2苍术根茎及根际土提取物GC-MS鉴别到的有机化合物样品成分样品成分aa2、5—二炔基十八酸Sa1、2—二苯甲酸一(1-一丁基、2—葵基)酯B-桉叶醇2、6—二丁基对羟基甲苯茅术醇十六酸十五醛十四酸三十七烷醇aea萘酚2—甲氧基一4一乙烯基苯酚3—甲基一3—苯基一2—丙烯醛2、6—二丁基对羟基甲苯柠檬烯9一烯一2—十八烷氧醇乙基异别胆烷2、3—十六二烷酸一l一羟基一丙酯十六酸十八酸十四酸1、2—二苯甲酸异丁酯1、2—苯并异噻唑9一烯一—十八酸酯l一甲基一4一异丙基一l一羟基一环己烷对甲氧基酚2、6-二叔丁基对羟基苯丙酸酯十四酸甲酯十八醛十八酸甲酯十四酸Se1、2—二苯甲酸异丁酯1、2—苯并异噻唑3、7、ll一三甲基十二垸醇4一甲基，l一(l一甲基乙基)，1-乙酸一3—环己烯酯9-十六烯酸甘菊环2、6—二丁基对羟基甲苯柠檬烯十二惊乙基异别胆垸13—十五烷基一12、13—二十五醚十六酸异丙酯十六酸2-九烯醇十八酸十四酸十四酸三甲基硅酯aa根茎乙醚萃取液，sa根际土乙醚粗取液，ae根茎乙酸乙酯萃取液，se根际十乙酸乙酯萃取液(4)自毒物质相似性比较利用本发明所用JC系数，评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否为药用植物化感作甩的主导因子。本研究中的目的，利用本发明的JC系数评价苍术的自毒作用JOc/(a+b+c)%,公式中a为苍术根茎中特有组分数目，b为苍术根际土中特有组分数目，c为苍术根茎与根际土中共有组分的数目(a，b所代表组分归一化百分含量大于1%,c所代表两个共有组分中至少有一个的归一化百分含量大于》1%)。结果计算根茎及根际土中归一化百分含量大于1%的组分的相似系数，乙醚萃取液中二者的相似系数为33.33%，乙酸乙酯萃取液中二者的相似系数为90.00%(表3)。可见，根茎与根际土乙酸乙酯萃取液中所含化合物非常相似，二者含量最大的组分一致，均为邻笨二甲酸二异—厂酯(归一化百分含量分别为35.36%、35.37%)。证明苍术有明显自毒作用。表3苍术根茎及根际土所含化合物的组分的相似度比较*样品组分数独有组分数共有组分数组分总数相似系数(％)10782433.33sa17990182090,00S6202归一化百分含量大于1%的组分。Aa根茎乙醚萃取液，sa根际土乙醚粗取液，ae根茎乙酸乙酯萃取液，se根际土乙酸乙酯萃取液实验中发现，苍术根茎水提液能显著抑制苍术种子发芽率及胚根和胚芽的伸长。实验中，从苍术根茎中共鉴定出化合物20个次，根际土中共鉴定出化合物27个次，包括烷、醇、苯、萘、酸及酯等成分，尚6不包括更多的含量低未被鉴定出的化合物。迄今为止所发现的自毒物质几乎都是植物的次生代谢产物，其中最常见的是低分子有机酸、酚类和内萜类化合物。本实验所分离鉴定到的化合物中不乏此类物质，证明苍术根茎及根际土中均含有抑制其自身生长的自毒物质，即植物自毒素。本研究表明，JC在中药自毒作用的鉴定和评价中简单有效。权利要求1.一种用于中药农业自毒作用评估的方法，其特征在于包括以下步骤1)制备样品分别取原植物根茎和根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后采用有机溶剂萃取，确定样品所含化学成分的种类及含量；2)自毒物质相似性比较利用JC系数评价原植物的自毒作用JC＝c/(a+b+c)％，公式中a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分数目，c为原植物根茎与根际土中共有组分的数目；当JC大于50％，表示有自毒作用存在，75％在自毒作用明显，大于90％有严重自毒作用。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分数目，c为原植物根茎与根际土中共有组分的数目。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于a，b所代表组分归一化百分含量大于1%,c所代表两个共有组分中至少有一个的归一化百分含量大于》1%。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用GC-MS确定样品所含化学成分的种类及含量5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述中药为苍术。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醚和乙酸乙酯。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于取苍术根茎及根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后加入等量乙醚萃取得到乙醚萃取液，剩余水提液再用等量乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液。所得乙醚及乙酸乙酯萃取液浓縮至干，再分别用乙醚或乙酸乙酯溶解。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于气质联用仪器为TRACEGC2000,DB-5MS石英毛细管柱0.25nralDX30mX0.25um，进样温度250'C，程序升温从60。C到290'C，15。Cmin1,载气为He;EI源，70ev，接口温度250。C，源温200。C，检测温度200'C，进样量lul，35650全扫描。全文摘要本发明是一种用于中药农业自毒作用评估的方法，通过仪器分析确定样品所含化学成分的种类及含量；在此基础上利用JC系数评价原植物的自毒作用评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否为药用植物化感作用的主导因子。该方法对于中药自毒作用的鉴定和评价中简单有效。文档编号G01N33/00GK101551370SQ20081024073公开日2009年10月7日申请日期2008年12月24日优先权日2008年12月24日发明者吴志刚,林淑芳,郭兰萍,黄璐琦申请人:中国中医科学院中药研究所