线栅监视设备的制作方法

专利名称：线栅监视设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器领域，更特别地，涉及子衍射极限生物传感器。
背景技术：
生物传感器技术在本领域中是众所周知的。美国专利申请No.2003/0174992公开了 一种用于提供包括分析物的 零模式波导的方法和设备，所述分析物受电磁辐射的激励以便对该分析 物进行分析。标题为 "Luminescence sensors using sub-wavelength apertures or slits" 的WO2006/136991公开了一种具有子波长空间分辨率的生物传感器。标题为 "Luminiscence sensor operating in reflection mode ，， 的 WO2007/072415公开了 一种用于检测孔径中的分子产生的荧光辐射的方法。这种生物传感器可以包括设置在透明材料衬底上并且形成用于填 充所述分析物流体的至少 一个孔径的非透明材料。这些孔径在孔径内的 介质中具有低于激发光的衍射极限的第一平面内维度并且在孔径内的 介质中具有高于激发光的衍射极限的第二平面内维度。孔径平面由沿着 孔径的第一平面内维度定向的第一矢量和沿着孔径的第二平面内维度 定向的第二矢量限定。这种线栅具有透射轴，其中被偏振化使得电场与 由第一矢量和垂直于孔径平面的第三矢量限定的透射平面平行、以下称 为T偏振光的光基本上被透射，并且被偏振化使得电场垂直于透射平面、 以下称为R偏振光的光基本上被阻挡。分析物施加到生物传感器并且渗透进入孔径。该分析物包括待分析 的目标分子。目标分子利用发光体(luminophore )来标记，并且发光体 /目标分子的聚合体固定在孔径的衬底侧，而自由发光体和附接到目标分 子的发光体在分析物中存在于孔径的分析物侧。所述固定的发光体相应 于待分析的目标分子的定性或定量表示。来自固定的发光体的发射辐射由检测器确定。为了将所述固定的发4光体的希望的辐射与自由发光体以及用发光体标记的目标分子的背景 辐射区分开来，必须抑制背景辐射。该背景辐射可能比来自固定的发光 体的有用辐射大几个数量级。发光背景辐射的充分抑制允许实现基本上 无背景的测量，否则该测量需要沖洗，但是冲洗不可以在例如实时测量 期间发生。对于利用偏振激发光照射的实际的线栅生物传感器而言，背 景辐射的抑制限于大约三个数量级。该有限的背景抑制最终导致传感器的精度和表面特异性(surface-specificity)的降低。此外，在本领域中 需要能够使用非偏振光源的生物传感器，所述非偏振光源例如发光二极 管(LED),其更加便宜并且可以产生更大的输出功率。发明内容因此，本发明的目的是单独地或者以任何组合地緩解、减轻或消除 上述缺陷和缺点中的 一个或多个。依照本发明的 一个方面，提供了用于监视分析物流体中存在的发光 体所发射的辐射的设备，其包括生物传感器，其具有至少一个设置在 透明材料衬底上并且形成用于填充所述分析物流体的至少一个孔径的 非透明材料，所述孔径具有小于该生物传感器中的有效辐射波长的一半二;面内维度，并且具有透射平面；激^;:其用;激发所述生物传2器的分析物流体中存在的发光体；检测器，其用于检测激发时发光体发 射的辐射；以及偏振滤波器，其设置在所述生物传感器与检测器之间。 所述检测器可以设置在生物传感器的衬底侧。所述激发源可以是发射偏 振光的光源，该偏振光例如具有椭圓偏振(例如圆偏振)或线性偏振的 偏振光，或者所述激发源可以是发射非偏振光的光源。所述偏振滤波器 可以被设置用于充分地衰减其电场与孔径的透射平面平行的辐射。该偏 振滤波器可以是可旋转的。在一个实施例中，所述光源包括带通滤波器，该滤波器用于使具有阻挡具有与所述发光二的丄射波长相应'的波长的辐射。此外,波长通带 滤波器(pass filter)可以设置在检测器之前，以便使具有与所述发光体 的发射波长相应的波长的辐射通过并且阻挡所述带通滤波器通过的辐射。在另一个实施例中，所述偏振滤波器可以包括偏振分束器，该偏振 分束器向所述检测器传送具有与孔径的透射平面平行的偏振平面的辐 射并且向第二检测器反射或阻挡具有与孔径的透射平面垂直的偏振的 辐射，或者所述偏振滤波器可以包括二向色镜，该二向色镜被设置成将 所述激发辐射导向生物传感器并且将发射辐射传送到所述检测器。在另外的实施例中，来自所述光源的辐射可以被设置成在照射生物 传感器之前通过所述偏振滤波器。在又一个实施例中，所述光源可以设置在生物传感器的衬底侧，并 且在反射模式下进行检测。可替换地，所述光源可以设置在生物传感器 的分析物流体侧，并且在透射才莫式下进行检测。所述光源可以发射具有低相干长度的光，例如具有大于大约lnm的带宽的光。所述设备可以包括分析物流体并且该分析物可以在介质中包括目 标分子和发光体，例如荧光团(fluorophore),其包含在所述孔径中。捕 获分子可以设置在孔径的衬底端部分的邻近，所述捕获分子用来与所述 目标分子和发光体形成聚合体。所述分析物流体可以设置在包括所述孔 径的衬底的 一 侧上并且所迷检测器和偏振滤波器设置在衬底的另 一 侧 上。


根据以下参照附图对于本发明实施例的详细描述，本发明的另外的 目的、特征和优点将变得清楚明白，在附图中 图l为用于解释原理的示意图； 图2为生物传感器的实施例的示意图； 图3为生物传感器的另一实施例的示意图；以及 图4为生物传感器的另外的实施例的示意图 图5为本发明的又 一 实施例的示意性框图； 图6为本发明的又一实施例的示意性框图； 图7为本发明的又一实施例的示意性框图； 图8为本发明的又 一 实施例的示意性框图； 图9为本发明的又一实施例的示意性框图； 图10为本发明的又一 实施例的示意性框图；图ll包括两幅照片，其示出了具有分别与覆盖有被标记分子模式的线栅平行和垂直地设置的偏振滤波器的检测器图片。
具体实施方式
下面将参照附图描述本发明的若干实施例。描述这些实施例是出于 说明的目的，以便使得本领域技术人员能够实施本发明并且公开最佳的 模式。但是，这样的实施例并没有限制本发明。此外，在本发明的范围 内，不同特征的其他组合也是可能的。依照下面描述的实施例的生物传感器可以包括设置在孔径中的分 析物，所述孔径以对于激发光和发光中的至少 一种非透明的材料限定， 典型的实例是铝、金、银、铬，在孔径内的介质中具有低于激发光的衍 射极限的第一平面内维度并且在孔径内的介质中具有高于激发光的衍 射极限的第二平面内维度。平面内维度指的是平行于衬底的平面内的维 度。所述分析物可以包含在流体中。流体中存在的发光体将在暴露于激 发能量时发射电磁辐射。发射的辐射由检测器收集。总的发射的辐射能量，即发光体发射的单独的发光体的辐射能量之 和，与所述分析物的特性具有预定的关系，例如与所述分析物的分子的 浓度成比例。通过分析发射的辐射，可以定量地和/或定性地确定所述分 析物的特性。在下文中，将描述用于将分析物分子固定在每个孔径的底部的方 法。向每个分析物分子提供发光体，例如荧光标记。通过激发该发光体 并且收集发射的辐射，可以提供对于分析物分子的检测。该检测可以是 定性的和/或定量的。配体或捕获分子可以设置或固定在孔径的特定部分，所述配体在被 所述分析物的目标分子接触时形成发光体。发光体的这样的形成可以以不同的方式发生，例如S. Weiss的i仑文"Fluorescence spectroscopy of single biomolecules" ， Science, Vol. 283， pp 1676-1683中所描述的， 该文献的技术内容通过引用合并于此。所述配体可以使发光体固定不 动，使得它们在激发时从固定的位置发射辐射。所述配体可以固定在沟槽内，所述沟槽设置在衬底中与孔径底部相 邻的位置。可以以不同的方式激发所述发光体以便发射辐射，例如通过电能或7化学能来激发。发射的辐射可以通过不同的物理过程发生，例如发光、磷光、荧光、拉曼(Raman)散射光、超拉曼散射光或超瑞利散射光等 等。发射的辐射可以是诸如光之类的电磁辐射，包括红外光。下面将考虑利用电磁辐射激发的发光体，所述电磁辐射特别是光， 包括紫外光、可见光和红外光，其在相关介质中的波长是孔径的第一平 面内维度的至少两倍。有效波长是辐射在真空中的波长除以介质的折射 率。可以在生物传感器的任一侧检测发光体发射的发光辐射。如果前侧 存在分析物流体，那么可以在衬底的后侧检测辐射。当光源从其后侧朝 向衬底时，R偏振激发光将在孔径内建立消逝场(evanescent field), 而T偏振激发光将在孔径内建立传播波。这种消逝场可以激发孔径内存 在的与衬底侧相邻的发光体。该消逝场在孔径内从孔径的衬底侧开始将 具有指数衰减。因此，靠近孔径的衬底侧存在的发光体将比孔径的分析 物侧处或之外存在的发光体更有效地被激发。非偏振的激发光或者具有 其他偏振状态的激发光，例如圆偏振光、椭圆偏振光或者线性偏振光(其 是R和T偏振光的线性组合)，可以分解成R和T偏振光并且将导致 孔径内消逝激发光和传播激发光的组合。所产生的发光辐射通常将具有带有R和T偏振分量二者的偏振状 态。该发光的T偏振部分将基本上被孔径透射，而R偏振分量将基本上 -故孔径抑制。在许多应用中，大约1000的背景衰减将是足够的，但是人们宁愿 使用非偏振光源，例如发光二极管(LED),其通常不比激光器昂贵并 且仍然可以提供需要的激发功率。图1公开了依照第 一 实施例的系统。该系统包括例如 WO2007/072241中公开的类型的线栅生物传感器。生物传感器1包括若干设置在透明衬底2上的"导线"3。该衬底 可以由玻璃、硅石或者诸如丙烯酸玻璃、环氧树脂、聚氯乙烯(PVC) 之类的其他类似材料制成。为了充分透明，该材料应当具有虚部小于 10~4的折射率。所述导线可以由诸如金、铝、银、铬之类的金属制成， 其经过腐蚀或电镀以便获得希望的结构，即多个孔径4。这样的导线和 线栅的形成在本领域中是已知的，参见例如WO2006/136991。多个孔径4在导线3之间形成。孔径在第一平面内方向上具有子衍射极限维度。该第一平面内维度小于激发辐射的有效波长的一半。如果孔径中存在水(n=1.3)并且激发辐射在真空中具有633nm的波长，那 么有效波长将是487nm并且孔径的第一平面内维度小于该有效波长的 一半(243nm)。该第 一平面内维度可以小于有效波长的0.25倍或者 121nm。该第一平面内维度可以小于有效波长的0.2倍或者97nm。该第 一平面内维度可以小于有效波长的0.15倍或者73nm。孔径的第二平面 内维度大于有效波长的一半，例如有效波长的至少0.5倍或者至少 243nm。该第二平面内维度可以为有效波长的10-100倍或者4.9-49pm。 该第二平面内维度可以为有效波长的100-1000倍或者49-490|um。该第 二平面内维度可以为有效波长的至少1000倍或者至少490|tim。可以在生物传感器的孔径中引入分析物流体5。该分析物可以包括 目标分子7,所述目标分子设有能够在激发时发射电磁辐射的发光体或 焚光团8的标记。衬底2可以设有捕获分子或配体6,所述捕获分子或配体表现出和 目标分子7的亲和性并且在孔径的底部或衬底侧固定在所述衬底2的表 面上。当目标分子7充分靠近配体6时，该目标分子被配体捕获并且形 成包含配体6、目标分子7和荧光团8的聚合体9。所述目标分子和附 接于其上的标记或荧光团变成固定在靠近孔径4的衬底侧的位置处。生物传感器1暴露于来自外部辐射源的激发辐射10,该激发辐射包 括例如大约700nm的波长的光。也可以使用其他波长的辐射，例如微波、 红外光、近红外(NIR)光、可见光、紫外光、X射线等等。在圆偏振光的情况下，所述激发辐射可以分解成(大约)50°/。的T 偏振辐射和(大约)50%的R偏振辐射。结果，(大约)50%的激发辐 射基本上被透射并且另外(大约)50%的激发辐射在孔径内产生消逝场， 该消逝场呈指数衰减并且基本上不被透射。因此，远离线栅的样本小平 面(facet)的位置的激发光的充分抑制要求光基本上是R偏振的。所述生物传感器可以工作于反射模式。该生物传感器暴露于朝向孔 径的衬底端的激发辐射10。邻近衬底侧固定的包含荧光团8的聚合体9将吸收激发能量并且在 所有方向发射荧光辐射，取决于跃迁偶极矩的方向，荧光在某些方向更 显著或更不显著，如箭头lla和llb所示。发射的辐射的一部分lla朝 向设置在衬底2之下的检测器12,而另一部分llb朝向孔径的分析物侧。9即使当使用了适当偏振的激发光时，激发光的一小部分ri (对于如 上所述的典型孔径，透射的R偏振激发光是入射的R偏振激发光10的 1/1000)仍然被孔径透射。该透射的部分ri可以被流体5中存在的、孔径 的分析物侧的荧光团8吸收并且激发这些荧光团发射辐射，如箭头14a 和14b所示。发射的辐射通常具有T偏振分量和R偏振分量。所述流体 可以包含设有荧光团8的自由目标分子7以及自由荧光团8。所述辐射 的箭头14a所示的部分将穿过孔径，与R偏振分量形成对照的是，该辐 射的T偏振的部分将被孔径透射并且？I起不希望的背景辐射。如果在流体5中孔径的分析物侧存在未与配体6结合的大量外部荧 光团8,那么这种背景辐射将是大的。这样的外部荧光团可以通过沖洗 来减少，但是沖洗不可以在例如实时测量期间发生。应当指出的是，通常，来自流体5中分析物侧存在的荧光团并且穿 过衬底侧的孔径的辐射14a的最大部分是T偏振光。穿过孔径的辐射14a 的一小部分(其大约为0.5*")为R偏振光。偏振滤波器33设置在检测器12之前。该偏振滤波器对于T偏振光 具有高的抑制，其等于或优于孔径的抑制1/t),例如超过10000。因此， 来自流体6中存在的荧光团的辐射14a的大部分将被滤波器33阻挡。 因此，取决于滤波器33的抑制，背景辐射将按照0.5^与ri之间的因子 减少，这是相当大的减少。有用的辐射或者待检测的辐射lla也会被减 少，但是只按照小的因子减少。因此，借助于滤波器33获得了 0.5/"与 1 /r|之间的信号-背景比的改善。滤波器33可以具有至少与所述线栅衰减因子ri相同的衰减因子，但 是可以具有还要更大的超过大约10ri的衰减因子。这样的偏振滤波器可 在商业上获得，例如具有典型的衰减因子100000的格兰激光 (Glan-laser)偏振器。偏振滤波器33可以是与生物传感器1类似的线栅，在该情况下， 偏振滤波器33具有与所述线栅相同的抑制ri。在这种情况下，抑制将仅 仅为理论上最大的可获得改进的50%。背景辐射的进一步减少可以通过使用R偏振激发辐射来获得。在这 种情况下，激发辐射将在穿过孔径时按照所述衰减因子ri衰减，这意味 着到达检测器12的背景辐射将按照因子0.5*t)a2到"a2来减少，这取决 于滤波器33的衰减因子，即在上面所示的情况下按照因子500000来减少。相同的偏振滤波器33可以用于激发辐射以及用于阻挡背景辐射到 达检测器，如图1中的虚线33a所示。从衬底2和线栅反射的激发辐射也将作为背景辐射到达检测器。这 种激发背景辐射可以通过不同的措施来减少，例如借助于仅让荧光发射 的辐射通过的滤波器来减少。也可以使激发辐射以 一 定角度朝向所述生 物传感器，使得反射的辐射不到达检测器。在这种情况下，朝向检测器 的散射的激发辐射可以由透射荧光辐射并且阻挡激发辐射的波长滤波 器37去除。图2公开了一个实施例，其包括设有诸如铝、金、银、铬之类的金 属的线栅3的玻璃衬底2。所述线栅包括狭槽形式的孔径，所述狭槽具 有小于衍射极限宽度270nm的第一平面内维度(宽度)，例如70nm。 所述狭槽具有大于衍射极限宽度的第二平面内维度(长度)，例如lmm。 具有荧光团20的目标分子固定/结合在孔径的村底端，并且另一荧光团 21存在于流体5中且存在于孔径的分析物端。箭头10b所示的激发辐射，例如在真空中具有大约700nm的波长的 光，从源导向二向色镜31。从二向色镜31开始，激发辐射穿过所述偏 振滤波器33到达用于将经过偏振的激发辐射10b聚焦到生物传感器表 面的透镜32。激发辐射影响荧光团发射辐射。来自孔径的衬底侧存在的荧光团20 的发射的辐射20a将穿过透镜32并且穿过偏振滤波器33,从而仅让R 偏振辐射20b通过。通过的辐射20b将由二向色镜31反射到透镜34和 检测器22。孔径的衬底侧的R偏振激发辐射10b在孔径内形成具有指数衰减的 消逝场。该激发辐射将按照所述衰减因子ri衰减，并且只有一小部分激 发辐射将到达孔径的分析物侧的荧光团21。荧光团21将发射辐射21a, 该辐射将穿过孔径并且到达透镜32和偏振滤波器33。来自荧光团21的 辐射的T偏振分量21b将穿过孔径，但是将被偏振滤波器33阻挡。来 自荧光团21的辐射的R偏振分量在穿过孔径时将按照所述衰减因子ri 衰减并且将穿过透镜32、偏振滤波器33并由二向色镜31导向透镜34 和检测器22。因此，与没有偏振滤波器33的情形相比，来自荧光团21 的背景辐射将按照因子riA2衰减。可以在装配生物传感器时通过测量孔径的分析物侧的激发辐射的水平来将偏振滤波器33与线栅对准。当这种方式测量的激发辐射水平 最小时，偏振滤波器33与线栅对准，这意味着偏振滤波器仅让具有与 线栅垂直的偏振的辐射通过。通过旋转偏振滤波器，可以使得背景的减少是可变化的。这提高了 灵活性，因为可以旋转外部偏振滤波器的取向，其允许不仅抑制背景而 且测量背景并且确定结合的荧光团的偏振状态。图3公开了另一个实施例，其中偏振滤波器24仅被荧光团发射的 辐射穿过。在这种情况下，偏振滤波器24不必对于激发辐射透明，其 对于具有大的斯托克斯位移(Stokes shift)(例如大于100nm)的荧光 团可能是有意义的。激发辐射可以具有圆偏振。可替换地，激发可以是 线性偏振辐射，在这种情况下，偏振应当如上所示地对准。图4公开了另外的实施例，其中图3的实施例的偏振滤波器24被 偏振分束器35代替。偏振分束器35将R偏振辐射20b传送到透镜34 和检测器22,同时偏振分束器35将T偏振辐射20c和21b导向第二透 镜36和第二检测器23。因此，可以估计背景信号。图5示出了生物传感器1的另一个实施例，该生物传感器暴露于来 自外部辐射源的激发辐射10,所述激发辐射包括例如紫外光、可见光或 红外光。辐射源包括在检测设备30中，该检测设备与上面限定的生物 传感器1是分开的。在该实施例中，4吏用了非偏:派光源，例如一个或多个LED。与激光 光源相比，这种光源可以发射更大的激发辐射功率并且便宜得多。光源单元40包括一个或多个发射大约630nm波长的辐射的LED 41、透镜42以及用于通过激发光并且用于去除与荧光标记的发射带和 发射滤波器54的通带重叠的光的通带滤波器43。因此，该滤波器可以 具有通常为20-30nm宽的通带并且透射与荧光标记的吸收带或激发带重 叠的光10。这些LED的适当通带波长范围的实例是620-650nm;适当 的通带滤波器是可从Omega Optical公司获得的3RD Millenium 620-650 滤波器。光从衬底侧以一定角度被导向生物传感器，并且光部分地被线栅反 射，如光束15所示。因此，基本上没有激发光到达传感器71。只有一 小部分散射的激发光被导向传感器71,如虚线16所示。12成像功能框50与生物传感器基本上成直角地设置在生物传感器的 后侧。该成像功能框50包括用于经由偏振器53将发射辐射17导向检 测器71的第一透镜51和第二透镜52以及一个或多个发射滤波器54, 所述发射滤波器通过发射辐射17并且阻挡激发辐射16 (如果有的话)。 对于诸如具有频语宽度大约为50nm、分别以700nm的波长和650nm的 波长为中心的发射频谱的atto-680染料或氟石633染料之类的荧光标记 而言，发射滤波器54的适当的透射波长具有660nm或者更大的最小透 射波长，例如可从Omega Optical公司获得的695AF55 Emitter XF3076 滤波器，其具有665nm的最小透射波长。检测器71可以是照相机，包括CCD或CMOS检测器。另外的可替 换方案在下面给出。在非偏振光的情况下，激发辐射可以分解成T偏振辐射和R偏振辐 射。结果，大约一半的激发辐射基本上透过线栅，另一半激发辐射在孔 径内产生呈指数衰减的消逝场并且基本上不被透射。只有一小部分R偏 振辐射将穿过孔径。因此，线栅基本上作为偏振滤波器而工作。通过线栅的辐射与撞击线栅的辐射之比称为消光比，并且对于典型 的线栅而言对于R偏振辐射通常约为0.001。所述辐射将激发荧光标记发射荧光辐射。对于荧光团集合而言，所 述标记可以发射大约75%的与激发辐射偏振相同的偏振。孔径中位于孔径的衬底端邻近的焚光标记61由具有T偏振和R偏 振的激发辐射激发，其中对于非偏振激发光而言T通常近似等于R。总 的激发辐射为T+E，其导致来自标记的荧光发射。该发射将沿所有方向 并且假设50%将导向检测器。孔径外位于生物传感器的前侧或样本侧邻近的荧光标记62将由几 乎无衰减地通过线栅的激发光的T分量激发。此外，激发光的R分量将 按照消光因子n衰减。因此，T分量和R分量将导致发射辐射。该发射 将沿所有方向并且假设50%将朝着检测器重新进入孔径。然而，R分量 将按照消光因子n衰减。最后，偏振滤波器将按照因子N减少T分量。 偏振滤波器之后的检测的来自标记61和62的荧光之比为(N + 1) / [(N*3/4 + n*l/4) + n*(n*3/4+N*l/4)] 如果假设N=n,那么该比值将为l/n，其证明本发明的第一实施例导致 与线栅的消光比类似的背景抑制。如果N n,那么所述比值将大约为4/n。线栅的典型消光比为n=0.001。偏振滤波器53可以具有至少与所述线栅消光因子n相同的消光因 子N，但是可以具有还要更小的小于大约0.1*n的消光因子。这样的偏 振滤波器在商业上可获得，例如具有典型的消光因子10A-5的格兰激光 偏振器。偏振滤波器53可以是与线栅1类似的线栅，在这种情况下，偏振 滤波器53具有与该线栅相同的消光因子n。从衬底2和线栅散射的激发辐射也将作为背景辐射到达检测器。这 种激发背景辐射由发射滤波器54减少，所述发射滤波器衰减波长短于 发射波长的光并且因而基本上阻挡了激发光。依照图5的实施例工作于反射模式，其中光源和检测器都设置在生 物传感器的后侧并且待检测的流体在衬底上的导线的相对侧。光以大于 第一透镜51的数值孔径的角度被导向衬底以便以不同于朝向检测器的 另 一方向反射。图6公开了另一实施例，线栅具有与第一实施例类似的孔径，工作 于透射模式，其中光源设置在生物传感器的前侧并且检测器设置在生物 传感器的后侧。操作与依照图5的实施例类似。LED 41发射的光由透镜42聚焦并且在通过通带滤波器43之后照射 栅格的某个孔径或多个孔径。具有T偏振的激发光将基本上无衰减地通 过孔径，而具有R偏振的激发光将基本上被阻挡。穿过孔径的激发光将基本上是T偏振激发光，其基本上被偏振滤波 器53阻挡。任何仍然穿过偏振滤波器53并且按照消光比N衰减的T偏 振激发光以及任何仍然穿过线栅并且按照消光比n衰减的R偏振激发光 在到达检测器71之前将被通带滤波器54阻挡，该通带滤波器可以包括 若干级联的滤波器。位于孔径的衬底端的焚光标记61将基本上仅由激发光的T分量激 发，这意味着它将发射图5中的第一实施例的发射辐射的大约一半。孔径外位于孔径的样本端邻近背景标记62将发出发射辐射。T分量 将通过并且R分量将按照消光因子n减少。因此，到达检测器的衬底端标记61和样本端标记62的发射之比将为(N*3/4+l/4+n*3/4+N*n*l/4) / (N+n)如果N二n并且rK〈l(n的典型值为0.001 ),那么该比值将大约为l/(8*n)。 如果11<<1并且N"^cn(换言之，偏振器53具有远小于线栅的消光比)， 那么该比值将大约为l/(4*n)。在另一个实施例中，激发辐射基本上与衬底平行地被导向线栅，如 图7所示。二向色镜91设置在例如LED光的光路中并且将光重定向成 垂直于衬底。该二向色镜被设计成反射波长为620-650nm的激发光并且 通过波长大于670nm的发射光。因此，可以如图7所示省去发射滤波器 54,但是如果二向色镜仍然通过一小部分激发光，那么可以包括发射滤 波器54。可以在装配生物传感器时例如通过从样本端(即从上面经由流体) 照射线栅并且最小化检测器71上的功率来将偏振滤波器53与线栅对 准。当这种方式测量的功率最小时，偏振滤波器53与线栅对准，即设 置成垂直于线栅，这意味着该偏振滤波器仅通过具有与线栅的透射平面 垂直的R偏振的辐射。通过旋转偏振滤波器，可以使得背景的减少是可变化的。这提高了 灵活性，因为可以旋转外部偏振滤波器的取向，其允许不仅抑制背景而 且测量背景并且确定结合的荧光团的偏振状态。图8公开了另外的实施例，其中与图5的实施例相比，偏振滤波器 93设置在另一个位置，即设置在成像功能框50与衬底2之间。此外， 偏振滤波器93设置在光单元40与衬底之间，使得来自LED 41的光在 到达衬底之前穿过该偏振滤波器93。因此，从LED到衬底的激发光以 及来自荧光标记的发射光穿过相同的偏振滤波器93。该偏振滤波器设置 在这样的位置，使得非偏振的激发光穿过偏振滤波器93,所述偏振滤波 器93通过R偏振辐射但是按照因子N衰减T偏振辐射，所述因子N可 以是10~3到10A-6。位于孔径的衬底端的荧光标记61以及位于孔径的 样本端的荧光标记62将发出发射辐射。当向后穿过孔径时，R分量将 进一步按照因子n衰减，并且当穿过偏振滤波器时，T分量将按照因子 N衰减。偏振滤波器之后来自标记61和标记62的发射辐射之比为(3/4+N*l/4) + (N*N*3/4+N*l/4) /(n*n*3/4+N*n*l/4) + (N*N*3/4+n*N*l/4) 如果N二n,那么该比值将为3/(8*n*n) 如果lsK〈n,那么该比值将大约为l/(n*n)。偏振滤波器93被设置成偏振方向垂直于线栅的方向。如果偏振滤 波器93是线栅，那么该滤波器的栅格方向应当垂直于所述线栅的栅格 方向。如图9所示，图7的实施例的偏振滤波器53可以被偏振分束器92 代替。该偏振分束器92将R偏振辐射18传送到检测器71,同时该偏振 分束器92将T偏振辐射19导向第二检测器94。因此，可以测量背景信 号。偏振分束器92也可以在依照图1和图2的实施例中代替偏振滤波 器53。图10示出了与图7或图9类似的另外的实施例，其中偏振滤波器 设置在与图8的实施例相同的位置，即靠近衬底。因此，来自非偏振的 光源41的激发光被导向二向色镜91并且经由偏振滤波器93反射到衬 底，所述偏振滤波器93基本上只通过R偏振辐射。该激发辐射导致来 自荧光团标记61的荧光发射辐射，其穿过偏振滤波器93、 二向色镜91 到达检测器71,所述激发辐射还导致来自荧光团标记62的荧光发射辐 射，其穿过孔径、偏振滤波器93、 二向色镜91到达检测器71。来自荧 光标记61和62的发射辐射之比的计算与图8的实施例相同。在上述实施例中，可以使用具有简单而廉价的构造的线栅生物传感 器，这意味着所述线栅可以是一次性的。偏振滤波器设置在生物传感器之外并且可以多次使用。偏振滤波器 被设置成不与待检查的分析物接触。偏振滤波器总是设置在透明衬底与 传感器之间。因此，可以使用功能更多的偏振滤波器，导致非常大的背 景辐射衰减，而基本上不增加每次分析的总成本。光源单元40和成像功能框50的不同元件可以以不同于以上所示的 其他顺序设置。因此，激发辐射通带滤波器43可以设置在光源41与透 镜42之间。在图7的实施例中，二向色镜可以设置成实现通带滤波器 43的操作，该通带滤波器变得多余并且可以省略。在成像功能框50中， 元件的顺序可以不同。例如，偏振滤波器可以设置在衬底与检测器71 之间的任何位置。依照图5的实施例用于具有以下特性的测试环境中为了展示背景抑制，已经通过在线栅上喷溅棋盘模式的Si02间隔 材料、接着在与孔径4重叠且不被间隔材料覆盖的透明衬底2部分上固 定用氟石633染料标记的蛋白质来制造具有蜂巢模式的被标记蛋白质的样本。在制造的样本之上附接了 0.5mm厚的杂化室，这些杂化室填充了 非常高浓度(例如4.5微摩尔)的染料溶液，例如可以从Atto-TecGmbH 获得的atto-680染料。这些样本的特征在于与图l的设置类似的设置， 使用4个光谱滤波的红色LED来将激发波长限制在620-650nm之间。 通过旋转偏振器的透射轴，有可能将检测体积从基本上消逝场或近场切 换到基本上整个杂化室。图11示出了测量的焚光图像在左边，对应与线栅的透射轴平行 的偏振器的测量的荧光图像，在右边，则对应与线栅的透射轴垂直的偏 振器的测量的荧光图像。检测体积限于基本上仅仅孔径的衬底端的被标 记蛋白质以及高度仅为20-30nm的染料溶液的小消逝体积。左图的积分 时间约为右图的1/500。由图ll显然可知，线栅上面的荧光流体产生的 背景可以有效地被抑制。左图的积分时间大约小500倍这一事实清楚地 证明，抑制比信号大得多的背景荧光是可能的。此外，在依照图5的实施例中，使用了线栅的暗场照射，其中入射 光的入射角大于与用于在检测器上成像的集光透镜的数值孔径相应的 角度。通过这种方式，镜面反射的光没有成像到检测器上。当前的实施例具有 一 个或多个以下优点不再需要激发源的偏振轴与线栅的透射轴之间的严格对准。在先前 的实施例中，源的偏振轴必须调整成与线栅的透射轴垂直以便在导线之 间的空间中产生完全的消逝场。激光器通常比非偏振源更昂贵。对于诸如荧光之类的应用而言，标 记分子的吸收带非常宽，这允许使用LED。 LED是特别吸引人的，因为 它们在低得多的成本下提供与激光器类似的功率水平。此外，可以预期 的是，将来LED的光功率将显著增大。典型激光器的偏振纯度为100:1，而线栅生物传感器概念中使用的 线栅的典型消光优于1000。这意味着每个激光器需要其消光等于或优于 线栅的消光的专用偏振器。激光器的长相干长度意味着散斑并且这限制了照射的均匀性。在当 前的实施例中，使用了具有低相干长度的光源，例如带宽大于lnm(请 回顾该部分)。这些实施例可以用在不同的应用中，例如高背景环境中的测量所需 的用于测量的具有高表面特异性的光学生物传感器，所述高背景环境例如具有高复用数的DNA杂化试验。这些实施例可以用作显微镜，其中传感器71实际上由用户的眼睛代替。尽管上面已经参照特定实施例描述了本发明，但是其并不意在限于 本文所述的特定形式。确切地说，本发明仅由所附权利要求所限制，并 且不同于以上特定实施例的其他实施例同样可能处于这些所附权利要 求的范围之内。在权利要求中，措词"包括/包含"并没有排除存在其他的元件或步 骤。此外，尽管被单独地列出，但是多个装置、元件或方法步骤可以由 例如单个单元或处理器来实现。另外，尽管单独的特征可能包含在不同 的权利要求中，但是这些特征可能有利地加以组合，并且包含在不同的 权利要求中并不意味着特征的组合不是可行的和/或有利的。此外，单数 引用并没有排除复数。措词"一"、"第一"、"第二"等等并没有排 除复数。权利要求中的附图标记仅仅作为澄清的实例而被提供，绝不应 当被视为限制了权利要求的范围。
权利要求
1.一种用于监视分析物流体中存在的发光体所发射的辐射的设备，包括生物传感器，其具有至少一个设置在透明材料(2)衬底上并且形成用于填充所述分析物流体的至少一个孔径(4)的非透明材料(3)，所述孔径具有小于该生物传感器中的有效辐射波长的一半的第一平面内维度以及大于该生物传感器的有效辐射波长的一半的第二平面内维度，并且具有透射平面；激发源(10，41)，其用于激发所述生物传感器的分析物流体中存在的发光体；检测器(22，71)，其用于检测激发时所述发光体发射的辐射；以及偏振滤波器(33，53)，其设置在所述生物传感器与检测器之间。
2. 依照权利要求l的设备，其中所述检测器(22, 71)设置在所述 生物传感器的衬底侧。
3. 依照权利要求1或2的设备，其中所述激发源是发射偏振光的光源 (10),该偏振光例如具有椭圓偏振例如圆偏振或线性偏振的偏振光，或者所述激发源是发射非偏振光的光源(41)。
4. 依照权利要求l、 2或3的设备，其中所述偏振滤波器(33, 53 ) 被设置用于充分地衰减其电场与孔径的透射平面平行的辐射。
5. 依照前面的权利要求中任何一项的设备，其中所述偏振滤波器 (33, 53 )是可旋转的。
6. 依照权利要求3、 4或5的设备，其中所述光源(41)包括带通滤 波器(43 ),该《应的波长的辐射。
7. 依照权利要求6的设备，其中波长通带滤波器(54)设置在检测通过并且阻挡所述带通滤波^！ (43)通过的辐射:'、、'''
8. 依照前面的权利要求中任何一项的设备，其中所述偏振滤波器包 括偏振分束器(92),该偏振分束器向所述检测器(71)传送具有与孔 径的透射平面垂直的偏振平面的辐射并且向第二检测器(94)反射或阻挡具有与孔径的透射平面平行的偏振的辐射，或者其中所述偏振滤波器 包括二向色镜(91)，该二向色镜被设置成将所述激发辐射导向所述生 物传感器并且将发射辐射传送到所述检测器。
9. 依照权利要求3-8中任何一项的设备，其中来自所述光源(10, 41 )的辐射被设置成在照射所述生物传感器之前通过所述偏振滤波器(33, 93 )。
10. 依照权利要求3-9中任何一项的设备，其中所述光源(10, 41) 设置在所述生物传感器的衬底侧，并且在反射模式下进行检测，或者所 述光源(10, 41 )设置在所述生物传感器的分析物流体侧，并且在透射模式下进行检测。
11. 依照权利要求3-10中任何一项的设备，其中所述光源发射具有 低相干长度的光，例如具有大于大约lnm的带宽的光。
12. 依照前面的权利要求中任何一项的设备，其中该设备包括分析团，其包含在所述孔径中。、 " 〃
13. 依照权利要求12的设备，其中捕获分子设置在孔径的衬底端部 分的邻近，所述捕获分子用来与所述目标分子和发光体形成聚合体。
14. 依照权利要求12或13的设备，其中所述分析物流体设置在包 括所述孔径的衬底的一侧上并且所述检测器和偏振滤波器设置在衬底 的另一侧上。
全文摘要
用于监视线栅生物传感器的分析物流体中存在的发光体所发射的辐射的设备。该监视设备包括非偏振光源(41)，该光源用于照射线栅生物传感器以便激发设置在所述生物传感器的分析物流体中的荧光标记。检测器(71)检测激发后所述标记发射的辐射。偏振滤波器(53)设置在透明衬底与检测器之间，以便抑制来自分析物流体中位于线栅中的孔径之外的标记的背景发射辐射。
文档编号G01N21/64GK101606054SQ200880004780
公开日2009年12月16日 申请日期2008年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者D·J·W·克伦德, H·R·斯塔珀特, M·M·J·W·范赫彭 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司