专利名称：一种鲜活状态下海参胶原纤维的电镜观察方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋生物食品海参胶原纤维，特别是涉及一种鲜活状态下海
参胶原纤维的电镜观察方法。
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海参以其较高的营养和药学价值而被列为"海产八珍"之一，是滋补、健身、 治病、防老之佳品。海参体壁肌肉占海参总重量的85% (M/M)以上，是由真皮结 缔组织构成的，而真皮结缔组织的主要成分70%以上是胶原纤维，可以说海参的 质地特征在很大程度上是由胶原纤维的组织构造特性所决定的。所以观察鲜活状 态下海参胶原纤维的组织构造及其在体壁肌肉内的存在状态，对了解海参的食 用、营养特性及其加工制品质量品质具有重要意义。
目前针对海参胶原纤维结构的观察方法有两种， 一 种是通过Van-Gieson 、 Mallory三色等染色法对海参肌肉中各成分进行染色，根据各成分所染颜色的不 同进行区分。这种方法虽然能定性的判断肌肉组织中胶原蛋白的存在，但对其在 生体状态下的组织结构却不能进行有效的观察；另一种方法是通过对肌肉中的胶 原蛋白进行目标提取，然后观察其相应微观构造和组成，提取方法主要有酸法、 碱法、酶法、盐法和热水浸提法等。然而不管那种提取方法都会不同程度的造成 胶原蛋白变性，而且提取的单一胶原蛋白也不能反映出其在肌肉组织中的真正存 在状态。
发明内容
本发明的目的提供一种鲜活状态下海参胶原纤维的电镜观察方法，它能克服
现有技术的上述缺点。
一种鲜活状态下海参胶原纤维的电镜观察方法，其特征在于先将海参体壁肌
肉切成块状，用磷酸缓冲液洗净，-5-l(TC条件下用戊二醛磷酸缓冲液固定0. 5-5 小时，将海参样品在10-50。C条件下，用Na0H水溶液浸泡l-10小时后，用生理食 盐水洗至pH6. 0-8. 0，然后用单宁酸染色O. 5-5小时，0-10'C条件下用戊二醛磷酸 缓冲液固定10-60分钟，用浓度由低到高的酒精逐次脱水后，进行临界点干燥， 临界点温度25-40。C，压力30-50kg/cm2，镀金膜处理后用扫描电镜观察。本发明的优点是针对海参样品具有水产品易腐败，易变质，自身又具有自溶 现象的特点，在其电镜样品制备过程中增加了胶原纤维固定和传导性染色两个步 骤，可以观察鲜活状态下海参胶原纤维组织构造，获得更为理想的效果。
附图为鲜活状态下海参胶原纤维组织构造图。鲜活状态下海参胶原纤维大 致分为粗丝和细丝两类，粗丝胶原纤维呈现纵向的方向性，而细丝胶原纤维则 呈网状构造。
具体实施例方式
将海参体壁肌肉切成5X5X3mm3块状，用0. 1M pH7. 4磷酸缓冲液洗净，4'C条 件下用浓度为0.5M、 pH为7.2的戊二醛磷酸缓冲液固定2小时。将海参样品在2(TC 条件下，用2M NaOH水溶液浸泡4小时后，用质量百分浓度为5%的生理食盐水洗至 pH7.2，然后用质量百分浓度为2%的单宁酸染色1小时。4'C条件下用浓度为0. 5M、 pH为7. 2的戊二醛磷酸缓冲液再固定30分钟，用浓度由低到高的酒精50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100。/。(V/V)逐次脱水后，进行临界点干燥，临界点温度为31. 4'C 、 压力为39.5kg/cm2，镀金膜处理后用扫描电镜观察。
本发明中所述的磷酸缓冲液的浓度为0. 1 M -1M、 pH为6. 0-8. 0;所述的戊 二醛磷酸缓冲液的浓度为0. 1M -1M、 pH为6.0-8.0;所述的NaOH水溶液的浓度 为0.5M-5M;所述的生理食盐水的质量百分浓度为1%_10%;所述的单宁酸的质 量百分浓度为0. 5%-5%;所述酒精的体积百分浓度为10%_ 100% (V/V)。
权利要求
1、一种鲜活状态下海参胶原纤维的电镜观察方法，其特征在于先将海参体壁肌肉切成块状，用磷酸缓冲液洗净，-5-10℃条件下用戊二醛磷酸缓冲液固定0.5-5小时，将海参样品在10-50℃条件下，用NaOH水溶液浸泡1-10小时后，用生理食盐水洗至pH6.0-8.0，然后用单宁酸染色0.5-5小时，0-10℃条件下用戊二醛磷酸缓冲液固定10-60分钟，用浓度由低到高的酒精逐次脱水后，进行临界点干燥，临界点温度25-40℃，压力30-50kg/cm2，镀金膜处理后用扫描电镜观察。
2、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述的磷酸缓冲液的浓度为0. 1M-1M、 pH为6. 0-8. 0。
3、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述的戊二醛磷酸缓冲液的浓度为 0. 1M -1M、 pH为6. 0-8. 0。
4、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述的NaOH水溶液的浓度为0.5M -5 M。
5、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述的生理食盐水的质量百分浓度 为1%_10%。
6、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述的单宁酸的质量百分浓度为 0.5%-5%。
7、 如权利要求1所述的电镜观察方法，其特征在于所述酒精的体积百分浓度为 10%-100%。
全文摘要
一种鲜活状态下海参胶原纤维的电镜观察方法，其特征在于先将海参体壁肌肉切成块状，用磷酸缓冲液洗净，-5-10℃条件下用戊二醛磷酸缓冲液固定0.5-5小时，将海参样品在10-50℃条件下，用NaOH水溶液浸泡1-10小时后，用生理食盐水洗至pH6.0-8.0，然后用单宁酸染色，0-10℃条件下用戊二醛磷酸缓冲液固定，用浓度由低到高的酒精逐次脱水后，进行临界点干燥，镀金膜处理后用扫描电镜观察。本发明的优点是针对海参样品具有水产品易腐败，易变质，自身又具有自溶现象的特点，在其电镜样品制备过程中增加了胶原纤维固定和传导性染色两个步骤，可以观察鲜活状态下海参胶原纤维组织构造，获得更为理想的效果。
文档编号G01N1/30GK101545876SQ200910014958
公开日2009年9月30日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者张朝辉, 李昭勇, 许加超, 燕 陈, 昕 高 申请人:中国海洋大学