专利名称：一种体外热原的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种体外热原的测定方法。
背景技术：
所有能引起人体免疫反应的物质都被认为是具有"致热性"的，这些致热性热原包括外 原性致热原和内原性致热原。外原性致热原，如病原微生物，包括细菌、病毒、衣原体、真 菌等微生物及其产物，炎性渗出物，无菌性坏死组织，抗原抗体复合物等，其不能直接作用 于人体体温调节中枢，需通过内原性致热原发挥作用，激活中性粒细胞、嗜酸粒细胞和单核 巨噬细胞释放白细胞介素-1 (IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)和白细胞介素-6 (IL-6)等细胞因子，再通过血脑屏障直接作用于体温调节中枢，使体温调定点上升，导致 产热增加，散热减少，体温上升。
近年来，随着医学研究和医疗技术的发展，医疗器械、植入器械和新生物材料的应用越 来越广泛，这些材料要与人体组织或血液成分保持直接接触，因此它们必须要有生物相容性 并且能满足其特定的功能。因此对于这些材料组成、表面的结构、材料的稳定性以及材料表 面的污染情况的鉴定，尤其是对引起人体免疫应激反应的外原性致热原鉴定具有重要的临床 意义。
由医疗器械本身刺激引起免疫反应是先天免疫防御的一部分，主要由单核细胞、巨噬细胞和中性粒 细胞以及补体系统发动。免疫反应的严重程度与免疫细胞释放的生物介质主要是细胞因子有关，有 可能引起发红、肿胀和发热等轻微的免疫反应症状，也有可能导致严重的组织损伤。同时器械中某 些颗粒和释放的金属离子也会引起免疫反应，导致植入器械的生物相容性降低，引起骨质溶解、骨 质吸收，器械松动、手术或植入手术失败或反复进行等。
同样，免疫反应也可能由医疗器械表面某些微生物成分引起，比如G—的细胞壁成分内 毒素LPS、 G+的细胞壁成分磷壁质酸LTA、真菌、原生动物和病毒的组成成分等，这些物 质都被认为是热原物质，均可被人体白细胞上的特定受体所识别引起诸如发热反应。并且很 多研究亦指出，医疗器械经过灭菌以后仍有可能是具有"致热性"的。比如在手术中，人体 组织器官直接与医疗器械接触，如外科手术工具、皮下穿刺针以及某些情况下使用的长期 植入工具支架、动脉瘤夹和矫形装置等，尽管这些医疗器械会经过常规的灭菌消毒法消毒， 包括红外辐射、高压灭菌和气体灭菌，但热稳定的热原性物质仍有可能留在器械的表面引起 免疫反应导致组织器官损伤甚至引起器械植入的失败。
因此，随着医疗器械、植入器械和新生物材料等在人体的广泛应用，人体机体组织、血 液接触到的热原也越来越多，危害越来越大，但目前用于热原测定的方法仅有以下几种1、 将测定材料植入到兔的体内，利用兔体温的变化来显示致热反应。缺点①兔对于 某些致热性物质的反应与人体反应的灵敏性并不一样；②只能植入小型器械；③在植入的过 程中引起的组织器官损伤本身也可能引起免疫反应；④动物价格昂贵、费力、品种差异影响 显著，词养环境对于动物的体温变化也有影响，通常会因为动物体温的一点点小小异常变化 而需要反复进行验证，同时该实验也没有设阳性和阴性对照。因此不能准确反映植入材料的 致热性污染。
2、 通过给兔注射植入器械的漂洗液来分析，这种方法主要使用纯净水或油来漂洗植入 器械。缺点①提取物的效果可能与温度、振荡的剧烈程度和储存条件有关；②热原物质的 溶解性难以确定；③不能确定溶液中黏附的热原与原热原是否具有不同的致敏特性。
3、 鲎试验法，原理为鲎的血淋巴一旦与内毒素接触就会凝固。缺点①仅适用于液体 样本，因此只能分析材料的漂洗液；②通过测定LPS，仅能检测常见的热原物质，无法检测 来自G+或G—的其它热原，如脂蛋白、肽聚糖和磷壁质酸，或其它目前尚未知的化学热原成 分。但可以肯定的是，大量可以引起细胞因子释放进而引发免疫反应的微生物成分却是存在 的。
综上所述，被污染的植入器械表面的热原在一定程度上是可以提取的，但对于留在其表 面的残渣或器械的本身，已知的方法还不能将其检测到。对于植入兔体内的器械由于种属的 差异等也存在很多弊端。因此，需要建立一种更加合适的方法来进行医疗器械的热原评价， 尽量避免人与兔的种属差异、热原提取的不完整性、遗漏器械表面的残留物或其本身具有的 致热性，以确保患者的安全。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种操作简便、灵敏高、重复性 好、全方位检査热原的体外热原的检测方法。 本发明解决技术问题釆用如下技术方案
本发明体外热原的测定方法的特点是利用人静脉血液和待检样品充分接触反应，反应后 混合液体经离心得无细胞上清液，再用Elisa法检测无细胞上清液中细胞因子IL-1 e的含量； 在相同反应条件下，通过人静脉血和已知不同浓度的LPS充分混合反应，绘制标准曲线来
定量待检样品所携带的热原物质。
本发明体外热原的测定方法的特点是按如下步骤操作
a、采血采集健康者静脉血液，将所采集的静脉血液用肝素、乙二胺四乙酸盐或枸橼 酸盐进行抗凝获得抗凝血液作为备用血样；所述静脉血液是来自于单个健康体，或来自于多个健康体的混合血液，所述混合血液之间血型相同、交叉配血试验红细胞无凝集反应；
b、 将待检样品放置到反应容器中，向反应容器中分别加入RPMI 1640溶液和备用血样； 按体积比的备用血样RPMI 1640溶液的比值A为1:1 100;
c、 设置多个与反应容器相同类型的并联容器，在所述并联容器中分别加入用RPMI 1640 溶液稀释成不同浓度的脂多糖LPS溶液，所述不同浓度的脂多糖LPS溶液，其最低浓度为 Opg/ml，最高浓度为100pg/ml，最低浓度和最高浓度之间设立3~8个脂多糖LPS浓度组， 在所述并联容器中分别加入备用血样；所述加入在各并联容器中的备用血样与脂多糖LPS溶 液的体积比为比值B;所述比值B与步骤b中的比值A相等；所述反应容器和并联容器均为 PVC膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂状；
d、 封闭所述反应容器和各并联容器，于37'C、体积浓度为5。/。的C02的环境中温育24 小时后，离心2分钟，随即取出所述反应容器和各并联容器中的无细胞上清液，对所述无细 胞上清液直接通过Elisa试剂盒测定人IL-l e的含量或保存于-80'C环境中待测；
e、 以各并联容器中所测得的人il-i e的含量为纵坐标，各人il-ie含量对应的不同浓 度脂多糖LPS溶液为横坐标绘制标准曲线；再在所述标准曲线上标定出以所述反应容器中的 人il-i e的含量测定值为纵坐标的测定点，所述标准曲线上测定点的横坐标值即为待检样品 的热原含量。
本发明体外热原测定方法的特点也在于所述步骤a中备用血样的制备为
a、 按如下过程冻存血液
将所述抗凝血液在冰水中预冷15分钟后，在不断轻摇中向抗凝血液中添加二甲基亚砜 得混合液，所述混合液中的二甲基亚砜的终浓度按体积比为10%~15%;移取所述混合液至
经冰水预冷的冷冻管中，将所述冷冻管置于冷冻室内，以rc/分钟降温至-5'c得冷冻液，继
续降温使冷冻液达到结晶温度-12'C，再将冷冻液以2'C/分钟降温至-4(TC,在-40'C的状态 下放置120秒，再将冷冻液以10'C/分钟的速度降至-120 'C完成冷冻，盛有冷冻液的冷冻管 储存于液氮中；
b、 将储存于液氮中的冷冻管内冷冻液以37。C 4(TC解冻为液态得备用血样。。 在人体中，热原物质在体内被血液中的单核细胞和组织中的固有巨噬细胞所识别，这些
细胞通过释放细胞因子控制免疫反应，il-i e作为第一种对免疫刺激发生反应的细胞因子的
释放将导致体温升高。与已有技术相比，本发明有益效果体现在
1、本发明使得人的血液和待检样本发生直接接触，既可以检查待检样品本身进入人体 后是否具有致热性，也可以检查待检样本是否携带致热性污染，从而避免器械植入的过程中引起的组织器官免疫性损伤。
2、 本发明可检测的热原物质类型多，范围广，能够检测鲎试验法无法检测的来自G+或 G—的其它热原，如脂蛋白、肽聚糖和磷壁质酸，或其它目前未知的化学热原。
3、 本发明可以对测定热原进行定量，且灵敏性高、稳定性好、干扰因素少和操作简单。
4、 本发明不使用任何动物，只基于人体的发热反应，避免了人和动物的种属差异。
5、 本发明的反应容器可以制成任意形状、任意大小，满足不同形态类型的待检样品要求。
6、 本发明可在反应容器中设立对阴性或阳性对照，并联容器中放置已知不同浓度的LPS 溶液，通过绘制曲线避免实验系统误差对数据结果的影响，同样也可消除捐献个体单核细胞 数目对释放细胞因子绝对数量的影响。
7、 本发明使用冷冻静脉血或不同健康个体的混合冷冻静脉血，这对于那些不能总是获 得新鲜静脉血液供应进行分析的使用者来说非常适用，且冻存血液可进行大批量生产。
8、 本发明可应用于生产制造过程中或植入手术实施前，通过简单的测试建立免疫质量 控制来排除热原物质污染，并且对于生物材料本身引起的免疫反应的防止亦具有一定的临床 意义，比如可以防止因巨噬细胞被激活或细胞因子的释放引起的骨质重吸收而导致的髋关节 替代物松动等。
以下通过具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本实施例按如下步骤操作
1、 采血采集健康者静脉血液，将所采集的静脉血液用肝素、乙二胺四乙酸盐或枸橼 酸盐进行抗凝获得抗凝血液；静脉血液是来自于单个健康体，或来自于多个健康体的混合血 液，所述混合血液之间血型相同、交叉配血试验红细胞无凝集反应；
2、 将抗凝血液在冰水中预冷15分钟后，在不断轻摇中向抗凝血液中添加二甲基亚砜得 混合液，所述混合液中的二甲基亚砜的终浓度按体积比为10%~15%;移取所述混合液至经
冰水预冷的冷冻管中，将所述冷冻管置于冷冻室内，以rc/分钟降温至-5'c得冷冻液，继续
降温使冷冻液达到结晶温度-12。C，再将冷冻液以2。C/分钟降温至-40。C，在-40'C的状态下 放置120秒，再将冷冻液以10'C/分钟的速度降至-120 'C完成冷冻，盛有冷冻液的冷冻管储 存于液氮中；
3、 将储存于液氮中的冷冻管内冷冻液以37。C 40'C解冻为液态得备用血样；
4、 将待检样品放置到反应容器中，向反应容器中分别加入RPMI 1640溶液和备用血样；按体积比的备用血样RPMI 1640溶液为1:1 100;
5、 设置多个与反应容器相同类型的并联容器，在所述并联容器中分别加入用RPMI 1640 溶液稀释成不同浓度的脂多糖LPS溶液，不同浓度的脂多糖LPS溶液，其最低浓度为Opg/ml， 最高浓度为100pg/ml，最低浓度和最高浓度之间设立3~8个脂多糖LPS浓度组，在并联容 器中分别加入备用血样；
具体实施中，步骤4中的备用血样与RPMI 1640溶液的体积比必须与步骤5中备用血样 与脂多糖LPS溶液的体积比相等；
反应容器和并联容器均用pvc膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂状；
6、 封闭反应容器和各并联容器，于37'C、体积浓度为5%的<:02的环境中温育24小时 后，离心2分钟，随即取出反应容器和各并联容器中的无细胞上清液，对无细胞上清液直接 通过Elisa试剂盒测定人IL-1 e的含量或保存于-80'C环境中待测；
7、 以各并联容器中所测得的人il-i e的含量为纵坐标，各人il-ie含量对应的不同浓
度脂多糖LPS溶液为横坐标绘制标准曲线；再在标准曲线上标定出以反应容器中的人IL-1
e的含量测定值为纵坐标的测定点，标准曲线上测定点的横坐标值即为待检样品的热原含 量。
1、 生产过程中的污染程度评价
致热刺激物LPS来自E.coli055:B5(Sigma)。温育装置选用PVC制成的并联袋装容器。 取钛合金动脉瘤夹(济南科惠康商贸有限公司)直接进行体外热原测定。Elisa法测定
IL-ie发现，这些动脉瘤夹的致热性很低，大约只相当于10pg 20pgLPS，约0.1 0,2EEU (内毒素等价单位)，这比规定的植入性器械标准20 EEU要低得多，此结果同时也说明本
发明具有很高的灵敏度。
2、 检测热干燥处理后的钛合金动脉瘤夹
将钛合金动脉瘤夹(济南科惠康商贸有限公司)首先在25(TC条件下热干燥4小时，再向干 燥处理的动脉瘤夹上滴加1100 u L分别含有0 pg、 5 pg和40 pg从E.coli 055:B5中获得 的LPS RPMI 1640溶液，静置在反应容器中；同时设立不同LPS浓度分别为O、 3、 5、 10、 20、 40、 80pg/ml的并联容器组；2小时后在各反应容器中再加入100 uL人冷冻血液，使 最终的反应体系体积为1200 PL，忽略动脉瘤夹体积。37。C孵育24小时后，检测溶液上清 IL-ie含量。结果显示，在添加0pg/ml LPS的动脉瘤夹上没有检出IL-ie的释放，添加有 5 pg和40 pg LPS/ml的动脉瘤夹所引起的IL-1 e的释放与5 pg和40 pg LPS所引起的IL-1 e的释放无差别。因此，制作动脉瘤夹(钛合金)本身无热原性，同时亦未携带热原物质。
权利要求
1、一种体外热原的测定方法，其特征是利用人静脉血液和待检样品充分接触反应，反应后混合液体经离心得无细胞上清液，再用Elisa法检测无细胞上清液中细胞因子IL-1β的含量；在相同反应条件下，通过人静脉血和已知不同浓度的LPS充分混合反应，绘制标准曲线来定量待检样品所携带的热原物质。
2、 根据权利要1所述的体外热原的测定方法，其特征是按如下步骤操作a、 采血采集健康者静脉血液，将所采集的静脉血液用肝素、乙二胺四乙酸盐或枸橼 酸盐进行抗凝获得抗凝血液作为备用血样；所述静脉血液是来自于单个健康体，或来自于多 个健康体的混合血液，所述混合血液之间血型相同、交叉配血试验红细胞无凝集反应；b、 将待检样品放置到反应容器中，向反应容器中分别加入RPMI 1640溶液和备用血样； 按体积比的备用血样RPMI 1640溶液的比值A为1:1 100;c、 设置多个与反应容器相同类型的并联容器，在所述并联容器中分别加入用RPMI 1640 溶液稀释成不同浓度的脂多糖LPS溶液，所述不同浓度的脂多糖LPS溶液，其最低浓度为 Opg/ml，最高浓度为100pg/ml，最低浓度和最高浓度之间设立3~8个脂多糖LPS浓度组， 在所述并联容器中分别加入备用血样；所述加入在各并联容器中的备用血样与脂多糖LPS溶 液的体积比为比值B;所述比值B与步骤b中的比值A相等；所述反应容器和并联容器均为 PVC膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂状；d、 封闭所述反应容器和各并联容器，于37t、体积浓度为5%的(202的环境中温育24 小时后，离心2分钟，随即取出所述反应容器和各并联容器中的无细胞上清液，对所述无细 胞上清液直接通过Elisa试剂盒测定人IL-1 e的含量或保存于-8(TC环境中待测；e、以各并联容器中所测得的人IL-1 e的含量为纵坐标，各人IL-1 P含量对应的不同浓度 脂多糖LPS溶液为横坐标绘制标准曲线；再在所述标准曲线上标定出以所述反应容器中的人 IL-1 P的含量测定值为纵坐标的测定点，所述标准曲线上测定点的横坐标值即为待检样品的 热原含量。
3、根据权利要求2所述的体外热原的测定方法，其特征是所述步骤a中备用血样的制备 为a、 按如下过程冻存血液将所述抗凝血液在冰水中预冷15分钟后，在不断轻摇中向抗凝血液中添加二甲基亚砜 得混合液，所述混合液中的二甲基亚砜的终浓度按体积比为10%~15%;移取所述混合液至经冰水预冷的冷冻管中，将所述冷冻管置于冷冻室内，以rc/分钟降温至-5'C得冷冻液，继续降温使冷冻液达到结晶温度-12。C，再将冷冻液以2'C/分钟降温至-40'C，在-40'C的状态 下放置120秒，再将冷冻液以10。C/分钟的速度降至-120 。C完成冷冻，盛有冷冻液的冷冻管 储存于液氮中；b、 将储存于液氮中的冷冻管内冷冻液以37。C 40。C解冻为液态得备用血样。
全文摘要
本发明体外热原的测定方法，其特征是利用人静脉血和待检样品充分接触反应，反应后混合液体经离心得无细胞上清液，再用Elisa法检测无细胞上清液中细胞因子IL-1β的含量；在相同反应条件下，通过人静脉血和已知不同浓度的LPS充分混合反应，绘制标准曲线来定量待检样品所携带的热原物质。本发明方法操作简便、灵敏高、重复性好、可全方位检查热原。
文档编号G01N33/53GK101614734SQ200910144159
公开日2009年12月30日 申请日期2009年7月20日 优先权日2009年7月20日
发明者杨士友, 燕 梁, 阚红卫 申请人:安徽省药物研究所