专利名称：：鉴别籼稻和粳稻品种的方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于鉴别水稻品种的方法，具体地说，涉及一种鉴别水稻中籼稻品种和粳稻品种的方法。属于生物鉴别
技术领域：
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背景技术：
：栽培稻是世界最重要的粮食作物之一。其中，籼稻和粳稻是亚洲栽培稻(0ryzasativaL.)的两个最重要的遗传分化类群，典型的籼稻和粳稻之间存在明显的生殖隔离，因此，在分类上通常将它们作为两个亚种处理，即籼稻亚种(0.sativasubsp.indica)和梗禾舀亚禾中(0.sativasubsup.j即onica)。为了适应不同的环境，籼稻和粳稻在形态、生理生化性状和品质方面都产生了很大的差异，籼稻适合于低纬度和低海拔的热带和亚热带区域，而粳稻更适合于高纬度和高海拔的冷凉环境。正因为两个亚种之间存在着显著的遗传差异，利用两者之间强大的杂种优势，对杂交稻的育种具有重大的应用价值。除了典型的籼稻和粳稻以外，籼稻和粳稻品种之间存在着一些较原始材料、或者由于遗传渗透和有性杂交，导致一些中间类型的出现。这些中间类型的品种可能具有籼稻的某些典型特征，也具有粳稻品种的某些典型特征，对品种鉴定带来了很大的困难。目前，用来进行籼稻和粳稻鉴定的有效和常用方法为"程式指数法"，包括稃毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比这6个性状。随着分子生物学的发展，近年也出现了应用同工酶和分子标记进行鉴定的方法，例如申请号为200810056529.X和200910077797.4公开了采用单个引物进行鉴定，申请号为200810037114.8其公开了利用34对Indel标记区分籼粳稻品种。但是未曾有人发现过籼粳稻品种糙米中棉籽糖含量存在显著差异，并且利用这个特性来进行籼粳稻的区分。
发明内容本发明的目的在于提供一种鉴别水稻中籼稻品种和粳稻品种的方法，其利用籼粳稻品种糙米中棉籽糖含量存在显著差异来对水稻品种进行鉴别，该方法操作简单准确，快捷高效。本发明研究人员经过大量的分析研究，发现籼稻糙米中棉籽糖含量会显著高于粳稻糙米中的含量，可以以珍汕97B中棉籽糖含量作为一个临界点，来鉴别籼粳稻品种。为了实现本发明目的，本发明所述的一种鉴别水稻中籼稻品种和粳稻品种的方法，其采用以糙米中棉籽糖含量高低来区分籼稻和粳稻品种。具体地说，以珍汕97B中棉籽糖含量作为参照品，待测品种棉籽糖含量高于珍汕97B的，判断为籼稻品种，低于珍汕97B棉籽糖含量90X以下的，判断为粳稻品种，棉籽糖含量在珍汕97B棉籽糖含量90%_100%之间，判断为籼粳稻中间类型或者无法判定。其中，棉籽糖(Raffinose)是植物中广泛存在的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，分子式为C18H32016，分子量504。它也被称为蜜三糖、蜜里三糖、棉子糖，通过HPLC(高效液相色谱法)、GC(气相色谱)和酶反应试剂盒等都能检测棉籽糖的含量。珍汕97B是一个商业上应用广泛的水稻品种，属于典型的籼稻品种，其种子样品可从种子公司购得。所述棉籽糖含量的检测方法为HPLC(高效液相色谱法)、GC(气相色谱和棉籽糖检测试剂盒。对水稻中棉籽糖含量进行检测时，一般会先将水稻种子干燥，去壳，磨粉，过筛，以备使用。再经加水和有机溶剂提取，不同的检测方法，处理手段各不相同。前处理的方法，可根据含量的高低和采用的不同检测手段自行调整，但因为在水稻糙米中含量较低，所以在提取时都需要浓縮。HPLC和GC等色谱类的方法在提取时，一般会将样品初提液蒸干，然后用少量溶剂重溶，以定容和提高浓度；试剂盒检测时，需要用小型的旋转蒸发等设备浓縮提取液，以提高浓度。另外，GC检测需要将化合物衍生，使其容易气化；棉籽糖试剂盒检测时，需要严格调节反应液的PH值，严格按照说明书进行操作；HPLC检测可基本参照袁美兰(2003，中国食品添加剂)中的方法，除此之外，其他一般都按照各自常规的检测要求提取分析。总之，本发明所指的检测方法均采用本领域常规的方法和设备进行。棉籽糖的检测手段有多种，应用不同的前处理和检测方法，检测同一个样品得到的结果都略有差异，所以必须以同等条件下的珍汕97B作为参照。因此在对待测品种进行鉴别过程中，不管采用哪种检测方法，必须在同等条件下以珍汕97B作为参照品进行检测，如果待测品种的含量高于珍汕97B，则判定为籼稻；如果含量低于珍汕97B棉籽糖含量的90%，该品种则判定为粳稻；待测品种棉籽糖含量在珍汕97B棉籽糖含量90%-100%之间，判断为籼粳稻中间类型或者无法判定。本发明研究人员利用籼粳稻品种糙米中棉籽糖差异显著的特性，对水稻品种进行鉴别，本发明的鉴别方法对于水稻功能基因和两个亚种的分化研究具有重大的指导作用，可以大大促进水稻乃至作物的进化以及环境适应等方面的科学研究。因此，对于水稻品种的准确鉴定的研究，在水稻选育和遗传改良中具有重要的应用价值，同时在水稻的进化和遗传研究中也具有重大的理论意义。本发明以糙米棉籽糖含量鉴定水稻中籼粳稻品种的方法，具体以下优点1.该方法操作简单准确，快捷高效；2.该方法检测耗时少，不需要种植植株；3.鉴别过程中需用样品量少。4.本发明首次提出以棉籽糖化合物含量来区分籼、粳稻品种，用作水稻亚种分类的指标，在水稻分类、进化和基因功能研究、在水稻育种上具有参考和应用价值，为水稻籼粳分化和亚种间杂种优势利用等科学研究领域开启了新的思路。具体实施例方式下面实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。说明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件和说明书的要求，例如GC-MS(气质联用仪)，比色法测含量等常规的化学含量检测方法。实施例1采用GC-MS的方法检测水稻糙米样品中棉籽糖含量，发现典型籼稻与典型粳稻品种之间棉籽糖含量的显著差异，选定临界值对照品种。表1实施例1所用实验材料类型及其棉籽糖含量<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>利用GC-MS对水稻糙米进行代谢组分的分析，按照常规方法进行前处理、定性和定量，最后以标样验证。样品脱壳，粉碎，过60目筛。称取300mg米粉，加100iiL内标(0.2993Mg/mL癸酸溶液)，4:1甲醇/水溶液3mL，涡旋混匀，浸泡30min，超声60min;12000g离心10min，取2mL上清，冷冻干燥12h，冻干的残留物加入90yL衍生试剂BSTFA和80iiL吡啶，水浴75t:水浴衍生45min。提取样品，为进样分析做好准备。本实验气相色谱部分使用安捷伦公司6890N气相色谱仪(美国)，质谱部分为飞行时间质谱仪(LECO公司，美国)，型号Pegasus4D。色谱条件载气高纯氦(纯度99.9995%)，流速1.5mL/min(恒流模式)。进样口温度285。C，进样lyL，分流比10:1。色谱柱DB-5(30mX0.25mmX0.25iim)。柱温6(TC恒温4min后以8°C/min升到17(TC再以4°C/min升到285。C恒温12min。质谱条件传输线温度285°C，离子源温度220°C。溶剂延迟330s，质谱扫描范围m/z40-700，采集频率5Hz。EI源电离电压70eV，检测电压1400V。上述实验共用了48个来自全国各地的水稻品种，检测到了41个准确的化合物。并用常规的程氏六性状和分子标记对这48个品种进行籼粳分类。经过以上2个实验，发明人20黑粳2号21黎明B22郑稻5号23粳87-30424立新粳25湘恢9126926珍汕97B*27金南特B28湘矮早1029金南特43B30G珍汕97B31矮脚南特32加巴拉33沪科3号34朝阳1号B35须谷糯36陆财号37竹珍B38广陆矮1539湘早籼7号40L301B41广陆矮4号42细白粘4380B44紫糯45成都矮3号46南京1147公居7348古15411.7713.8414.1515.1817.7526.0627.6029.4530.3931.8342.0643.4645.2548.2350.5151.4453.3454.8758.0659.0659.6764.0966.1466.8767.3477.8089.6892.20123.46型型类类稻稻稻稻稻间稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻稻间稻稻稻稻粳粳粳粳粳中籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼籼中籼籼籼籼^宁南南川南西南南南川东藏川南南建南西南南东川南南川苏南巴g辽河湖四湖江湖湖湖四广西四湖湖福湖广湖湖广四湖云四江云古发现了一个规律，就是棉籽糖的含量在籼粳稻中存在显著的差异性，典型的籼稻品种糙米中含有的棉籽糖都比粳稻品种要高。珍汕97B的含量与籼粳稻品种棉籽糖含量差异的临界值比较接近，本发明把"珍汕97B"用作参照品种。除了中间类型外，糙米中棉籽糖含量高于珍汕97B的判定为籼稻品种，棉籽糖含量低于珍汕97B含量90%的判定为粳稻品种，这与用传统的形态指标和分子标记鉴别的结果基本是一致的。实施例2随机挑选来自世界各地的24个水稻品种，用棉籽糖试剂盒来检测其糙米中的棉籽糖含量，以珍汕97B作为参照，对这些品种进行籼稻和粳稻的判别，其结果与分子标记鉴别结果高度匹配。表2.实施例2鉴定所用材料类型和棉籽糖含量^^，，_(分子标记)_(mg/100g)用试剂盒(R-Biopharm，德国产，可购得)的方法检测糙米粉中棉籽糖的含量取干燥的种子，脱壳，磨粉(旋风磨)，干燥(10(TC，24h)。称取干粉，加水，在6(TC水浴中加7126789101112131415161718192021222324有芒铁壳红谷子Cypress建阳早水原352隆化毛葫Aus43ITA408小飞来风台中65号台东陆稻珍汕97B小黄芒秃头糯稻麻麻谷Kasalath班毛占秋前白梅花糯黄丝桂占矮沱谷9311白壳早禾6.027.1210.4110.9012.9816.2717.9818.7222.7425.1925.1929.0930.5636.9037.6442.2846.4352.6552.7756.3157.5367.9170.4785.37孟加拉尼曰利亚江苏山东湾湾西苏苏川本徽徽川东川苏南台台江江江四日安安四广四江湖型类稻稻稻稻稻司稻稻稻稻粳粳粳粳粳中粳粳粳粳型型型类类类■司司稻稻稻稻司稻稻稻稻稻稻稻、ni、—■一_/nv,,nv一7、—ifvlt1/iT1V17irv,17.p.nl山山山山.p山山山山山山山idl.tll茅米茅茅.th茅茅利茅茅利利粳粳籼偏偏偏苏川国西国北江四美江韩河热30min，不时震荡。加入CarreZ(卡瑞试剂)溶液澄清，参照说明书附录，离心(4000RPM，12min)取上清，干燥定容过滤待测。检测方法参照说明书，用棉籽糖的标样配置溶液制作标准曲线，比色获得各品种糙米中棉籽糖含量。对表2所示的24个材料用棉籽糖试剂盒进行棉籽糖的测定，以珍汕97B作为参照，对这些材料进行籼粳分类，高于珍汕97B的为籼稻，低于珍汕97B含量的90%的为粳稻。另外，按照分子标记和常规的方式对这些材料也进行了分类，发现它们二者之间的分类结果高度吻合。此结果说明了用不同的检测手段在不同的材料中也能得到同样的区分效果，也表明本发明方法的可行性和可靠性，是区分籼稻与粳稻品种的一种有效方法。尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，作各种变化或修正是显然的。权利要求一种鉴别籼稻和粳稻品种的方法，其特征在于，其采用以糙米中棉籽糖含量高低来区分籼稻和粳稻品种。2.根据权利要求1所述鉴别方法，其特征在于，其以珍汕97B中棉籽糖含量作为参照品，待测品种棉籽糖含量高于珍汕97B的，判断为籼稻品种，低于珍汕97B棉籽糖含量90%以下的，判断为粳稻品种，棉籽糖含量在珍汕978棉籽糖含量90%-100%之间，判断为籼粳稻中间类型或者无法判定。3.根据权利要求1或2所述鉴别方法，其特征在于，所述棉籽糖含量的检测方法为高效液相色谱法、气相色谱法和棉籽糖检测试剂盒。4.根据权利要求3所述鉴别方法，其特征在于，所述水稻中棉籽糖的提取方法为将水稻种子干燥，去壳，磨粉，过筛，加水和有机溶剂进行提取。全文摘要本发明提供了一种鉴别籼稻和粳稻品种的方法，其采用以糙米中棉籽糖含量高低来区分籼稻和粳稻品种。本发明的鉴别方法以珍汕97B中棉籽糖含量作为参照品进行鉴别，操作简单准确，快捷高效。本发明首次提出以棉籽糖化合物含量来区分籼、粳稻品种，用作水稻亚种分类的指标，在水稻分类、进化和基因功能研究、在水稻育种上具有参考和应用价值，为水稻籼粳分化和亚种间杂种优势利用等科学研究领域开启了新的思路。文档编号G01N21/78GK101726549SQ20091019900公开日2010年6月9日申请日期2009年11月19日优先权日2009年11月19日发明者梅捍卫,楼巧君,罗利军,许国旺,马晨菲申请人:上海市农业生物基因中心;中国科学院大连化学物理研究所