专利名称：：一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。技术背景栽培稻是世界上最重要的粮食作物之一，在其11,500多年的栽培稻驯化历史中为适应不同的农业生态环境，栽培稻形成了丰富的遗传多样性和明显的遗传分化，产生了籼稻(&o^'ca)和粳稻(y邵o/^'c3)两个不同的生态型(MorishimaH,OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.XXII.NumerableevaluationoftheIndica-Japonicadifferentiation.JapaneseJournalofBreeding,1981，31:402—413;GlaszmannJC.IsozymesandclassificationofAsianricevarieties.TheoreticalandAppliedGenetics,1987，74:21-30;WangZY，TanksleySD.Restrictionfragmentlengthpolymorphismin。iyz<asa"VaL.Genome,1989，32:1113-1118;BlairMW，Panaud0,McCouchSR.Inter-simplesequencerepeat(ISSR)amplificationforanalysisofmicrosatellitemotiffrequencyandfingerprintinginrice(6ryz3sa"raL).TheoreticalandAppliedGenetics，1999，98(5):780-782.))。它们之间在许多形态和生理性状上存在着明显的差异(MorishimaH，OkaHI.Phylogeneticdifferentiationofcultivatedrice.Numericalevaluationsofthei"c/2'ca-^3;o/n'cadifferentiation.Jpn.J.Breed,1981，31:402—413;WANGXiang—Kun,CHENGKan—Sheng，HUANNai—Wei，LU0Jun，LUYi—Xuan,LIUGuang-Rong.StudyontwoimportantricetypesconcerningtheoriginanddifferentiationofAsiancultivatedrice.ActaGeneticaSinica，1987,14(4):262-270.)。然而，水稻的籼-粳分化是一个缓慢的进化过程，在许多水稻地方种中存在着典型的籼稻或粳稻，但也存在籼粳分化不明显的中间型，对于这些类型很难用传统的方法来鉴定，更难研究水稻的籼粳分化程度。因此，开发新型的Marker基因及其分子标记来准确鉴定籼稻和粳稻，并且用其研究水稻的进化非常必要。Sir2(silenceinformationregulator)基因家族是一种保守的从古细菌到哺乳动物都存在的NAD+依赖的组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。在酵母中，Sir2连同与它相互作用的几个蛋白质在基因沉默、基因组稳定性、细胞寿命以及代谢调节上起着不可缺少的作用。其主要的作用机制是热量限制降低了抑制物烟酰胺的浓度，从而激活了Sir2的组蛋白去乙酰化功能。在哺乳动物中，有7个Sir2同源基因，分别命名为SIRT1到SIRT7。其中SIRT1研究的最多，它在DNA损伤修复、细胞周期控制、抑制细胞凋亡、抵抗氧化逆境和延长细胞寿命方面起着重要作用(王丽辉，金炜元，陈勇，王君晖.Sir2基因家族的功能和作用机制.细胞生物学杂志，2006，6:822-826.)。而在植物中，SIR2基因数量较少。在水稻中仅有2个SIR2基因，即&6777和fls5Vf么2007年，HuangLM等对其中的1个SIR2基因(&577V)进行了研究，研究结果认为基因Os5V77过表达可增强水稻对氧化胁迫的抗性。关于(9s57iT2(L0C—0sl2g07950)的功能研究未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则待测水稻为候选粳稻。所述缺失具体可通过PCR扩增进行检测。所述PCR扩增具体可扩增包含GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位核苷酸序列的片段。所述PCR扩增中所用的引物，具体可为如下的引物:上游或下游引物与GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列互补或相同。其中，所用引物具体还可为如下的引物:其中的一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。实际应用中，可采用的一种具体辅助筛选籼稻和粳稻的方法如下以待测水稻的基因组DNA为模板，用核苷酸序列分别是序列表中序列3和序列4的一对引物进行PCR扩增，扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测,若产物在琼脂糖凝胶上显示为位于230-396bp之间的一条带,则待测水稻为候选粳稻，若产物在琼脂糖凝胶上显示为没有位于230-396bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。本发明的另一个目的是提供一对用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物。本发明所提供的一对用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物为其中的一条序列如序列表中序列3所示，另一条序列如序列表中序列4所示。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在发育早期筛选籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。图1为Marker基因L0C—Osl2g07950在日本晴和93-11中的基因组序列比对结果(来自TIGR网站)及引物SIR2-2、专用引物SIR2-3所在基因组序列上的位置示意图。图2A为以日本晴和93-11的基因组DNA为模板，在引物SIR2-2引导下的PCR扩增产物的带型。图2B为以日本晴和93-11的基因组DNA为模板，在引物SIR2-3引导下的PCR扩增产物的带型。图3为以16个水稻品种和地方种的基因组DNA为模板，在专用引物SIR2-3引导下的PCR扩增产物的检测结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中的水稻品种和地方种均来自国家种质资源库。实施例1、基因L0C—0sl2g07950在籼稻和粳稻中不同表达模式的发现与验证首先通过对籼粳稻在不同发育阶段和不同组织部位的芯片数据进行了挖掘分析，结果发现，基因LOC—Osl2g07950在GengChip数据中有两组探针，而且这两组探针在籼粳稻中的表达模式相反，探针P1在籼稻中表达量极低甚至不表达，而在粳稻中的表达量极高，而另一探针P2却在籼稻中的表达量极高，而在粳稻中的表达量极低。根据前人的研究结果，造成基因表达量差异的主要原因可能是碱基序列的差异(InDel)，或受其它基因的调控。因此，利用比较基因组学的方法，首先对基因L0C—0sl2g07950在籼稻品种93-11和粳稻品种日本晴中的基因组序列进行了核苷酸序列比对(Blast)分析，结果发现在93-11中，此基因3'-UTR区域存在一段序列的缺失(图1)。实施例2、用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物的设计为进一步验证93-11与日本晴间是否存在基因组水平上的差异，依据日本晴序列，在二者可能存在基因组差异的区域设计引物SIR2-2，其中一个引物序列如序列表中序列1所示，另一个引物序列如序列表中序列2所示，并分别以日本晴和93-11的基因组DNA为模板进行PCR扩增验证。PCR扩增的反应体系为水稻基因组DNA模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.10XPCR缓冲液(lOOmMTrisHClpH9.0，500mMKCl，15mMMg2+，1%TritonX-100)，IOOMMdNTPs，正向引物4mM，反向引物4MM，用DEPC水补充反应体系至20W。PCR反应条件为先94°C5min;随后94。C30sec，58°C45sec，72°Clrain30sec，共35个循环；再72°C10min。通过浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物中是否有目的条带。检测结果表明引物SIR2-2在日本晴和93-11中均有扩增产物，但产物大小略有不同，在琼脂糖凝胶上的位置显示为396-1000bp之间(图2A，M为1KbDNALadder(普博欣生物科技有限公司，产品编号PBZ0304-1)，泳道l为日本晴、泳道2为93-11)。为进一步验证日本晴和93-11中是否存在序列差异，对PCR产物进行了测序分析(测序公司北京奥科生物技术有限责任公司)，用SIR2-2扩增日本晴得到的产物的序列如序列表中序列5所示，用SIR2-2扩增93-11得到的产物的序列如序列表中序列6所示，并利用DNAStar软件对测序结果进行了比对分析，结果表明，93-11中确实存在36bp的缺失，此缺失的序列即是GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列。根据日本晴的基因组序列再次对fls577^(L0C—0sl2g07950)设计引物SIR2-3，其中SIR2-3R在此缺失区域，SIR2-3F的序列如序列表中序列3所示，SIR2-3R的引物序列如序列表中序列4所示。分别以93-11和日本晴的基因组DNA为模板，按上述条件进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示此引物仅在日本晴中有扩增产物，产物在琼脂糖凝胶上显示为230-396bp之间的一条带，而93-ll中却无扩增产物(图2B，M为1KbDNALadder(普博欣生物科技有限公司，产品编号PBZ0304-1)，泳道l为日本晴，泳道2为93-11，泳道3为阴性对照)。所以，引物SIR2-3可作为区别籼粳亚种的InDel引物。实施例3、用引物SIR2-3辅助筛选水稻籼粳亚种的可行性验证水稻品种和地方种(均来自国家种质资源库)93-11、细麻柞谷、紫糯、N印a(深水稻)、桂朝2号、Aus6538(Bamalaia)、IR24、特青、日本晴、矮大种、木理(光壳粳稻)、糯粳稻、越富、秋光、红光和云峰7号。首先利用形态指标及相关文献检索分别随机挑选秈粳亚种各8个品种和地方种，如表l:表1、16个水稻品种和地方种的籼粳亚种鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>分别提取上述不同水稻品种和地方种的基因组DNA，在引物SIR2-3的引导下进行PCR扩增。反应体系如下水稻基因组咖A模板20ng，TaqPlusDNA聚合酶0.5U，2.10XPCR缓冲液(100raMTrisHC1pH9.0，500mMKC1，15mMMg2+，1%TritonX-IOO)，100幽dNTPs，正向引物4141，反向引物4MM，用DEPC水补充反应体系至2014。PCR反应条件为先94。C5min;随后94°C30sec，58。C45sec，72。Clmin30sec，共35个循环；再72t:10min。反应结束后，利用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。实验设3次重复。三次重复实验的结果一致，检测结果如图3所示(泳道1为籼稻93-11的电泳结果，泳道2-8分别为细麻柞谷、紫糯、N印a(de印waterrice，深水稻)、桂朝2号、Aus6538(Bamalaia)、IR24和特青的扩增产物电泳结果；泳道9为粳稻日本晴的扩增产物电泳结果，泳道10-16分别为矮大种、木理(光壳粳稻)、糯粳稻、越富、秋光、红光和云峰7号的扩增产物电泳结果)。结果表明，引物SIR2-3在7个籼稻品种和地方种中，均未扩增出条带，与93-11的扩增结果相同；而在7个粳稻品种和地方种中，除地方种木理和品种越富外，均能扩增出与日本晴相同的条带，扩增产物在在琼脂糖凝胶上显示为230-396bp之间的一条带,鉴定籼稻和粳稻的准确性分别为100%和80%。以上结果表明，用引物SIR2-3进行PCR扩增来辅助筛选籼稻和粳稻是可行的。序列表<160>6<210>1<211〉24<212〉腿<213〉人工序列<220><223><400〉1ctcactgcatttctcccttgctgt24<210〉2<211>26<212〉腿<213>人工序列<220〉〈223〉〈400〉2ccttttgcaacgaagaatctgcagag26<210>3<211>20〈212>靈<213〉人工序列〈220><223><400〉3cttgctgtaatgc<210>4<211〉24〈212>廳〈213>人工序列<220><223><400>4<210>5<211>564<212〉腿<213>稻属水稻粳稻(<5r，sa"rasubsp.力/額.cs)<400〉5ctcacttgcctttctcccttgctgtaatgccaccatcttcttcagatactgcccagaata60cttcagatgggaagtctagctgtaccaaacgtaagttaagctggtgctgcgcagtcatct120ttgtcggaaaccatgtttccatgtaagaacaattctttggagaacaaaceiagtcacaagg180gaagacgaaacaatgaaagaaacttttagcaactaattaagttcagttcaactgggcaga240atatcatctccatcctgtttgcatgagatgagggagttaaccttgttaaccctgttgttg300taagtgtgtaaaccttaaccttgttaaccctgttgttgtaagtgtgtaaacctttttcag3G0tgacaattcattcaaatgtttccaaagatatggatatcccgaactgatcagcacattgaa420gaagtacaatatgctttgatagttccttgtaatgtgtcattaagcagaagttgaaaaacg480ttctagctggtccggatatttggattcatgtagtctattgtgctcttcacctgttcattt540ctgcagattcttcgtggcaaaagg564<210〉6<211>532<212>DNA<213>稻属水稻籼稻((9iTZ3saf/rasubsp.i/7o7ca)<400>6ctcactgccattctcccttgctgttatgccaccatcttcttcagatactgcccagaatac60ttcagatgggaagtctatctgt3CC333tgtg3gtt朋gC3tggtgCtgCgcagtcatct120ttgttggaaaccatgttctcatgt犯ga^caatctttggagaacaagtcaCt3ggg3卿180tgaaacaatgaaagaaacttttagctagactaattttgttcagttcaactggacagaata240tcattgccatcctgtttgcatg,tga_gggcgttaaccttgttaaccctgtgtgttgta300agtgtgtaaacctttttcagattttcagtgacaattcgttcgaatgtacccaaagatatg360gatatcccgagctgatcagcacattgaagaagtacaatatgctttggtagttccttgtaa420tgtatcattaagcagaagttgaaaaacgttctagctggttcggatatttggsttcatgt3480gtctattgtgttcttcacctgttcgtttctgcagattcttcgtggcaaaagg53权利要求1、一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5’末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则待测水稻为候选粳稻。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述缺失通过PCR扩增检测。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增为扩增包含GenBankaccessionAL731882中自5'末端第67843-67878位核苷酸序列的片段。4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增检测中所用的上游或下游引物与GenBankaccessionAL731882中自5，末端第67843-67878位的核苷酸序列互补或相同。5、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的引物，其中一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增检测中，扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，若产物在琼脂糖凝胶上显示为位于230-396bp之间的一条带，则待测水稻为候选粳稻，若产物在琼脂糖凝胶上显示为没有位于230-396bp之间的一条带，则待测水稻为候选籼稻。7、辅助筛选籼稻和粳稻的引物，其中的一条序列如序列表中序列3所示，另一条序列如序列表中序列4所示。全文摘要本发明公开了一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法是检测待测水稻中是否缺失GenBankaccessionAL731882中自5’末端第67843-67878位的核苷酸序列，若缺失，则待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则待测水稻为候选粳稻。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可用于早期籼稻和粳稻品种或地方种，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。文档编号C12Q1/68GK101215609SQ200810056530公开日2008年7月9日申请日期2008年1月21日优先权日2008年1月21日发明者刘凤霞,孙传清,张振海,徐文英,震苏,薛勇彪,谭禄宾,超邸申请人:中国农业大学