专利名称：一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物。
背景技术：
栽培稻是世界上重要的粮食作物之一，是世界上三分之一以上人口的主要热量 来源，它的产量、品质的提高，对于国计民生、社会稳定与粮食安全都是至关重要
的。栽培稻有11500多年的栽培驯化历史，为适应不同农业生态环境产生了籼稻和 梗稻两禾中不同的生态类型(Morishima et al， Japanese Journal of Breeding, 1981， 31:402-413; Glaszmann et al， Theoretical and Applied Genetics, 1987， 74: 21-30; Blair et al， Theoretical and Applied Genetics, 1999, 98: 780-782)。 在漫长的进化过程中，籼稻和粳稻在许多形态和生理性状上产生了明显的差异
(Wang et al， Acta Genetica Sinica， 1987， 14:262-270)。然而，由于生长环 境的复杂性，在漫长的籼/粳稻分化过程中，既产生了典型的籼稻或粳稻，也同时 产生了籼粳稻分化不明显的中间类型，这些分化程度各异的水稻类型很难通过传统 的方法准确鉴定，给研究水稻起源与演化带来了困难，也给水稻新品种的培育带来 了阻碍。也给水稻新品种的选育工作增加了难度。
RNA结合蛋白是一种含有RNA结合结构域(RNA binding motif)的蛋白质，它 广泛存在于生物体中。RNA结合结构域由80—90个氨基酸残基组成，RNA结合结构 域由两个高度保守的亚序列组成。RNP1由8个氨基酸残基(K/R) G (F/Y) (G/A) FV X (F/Y)组成，而RNP2由6个氨基酸残基(L/1) (F/Y) (V/I) (G/K) (G/N) L组成。 RNP1和RNP2分别位于RRM 二级结构P 1- a 1- 0 2- P 3- a 2- P 4中0 3禾口 P 1反向 平行的片层结构中央位置(Dreyfuss et al， Trends Biochem. Sci， 1988， 13: 86-91)。 RNA结合蛋白广泛存在于人、动物、植物、真菌、细菌等不同物种中，在 进化上十分保守，是鉴定物种起源与演化及物种间亲缘关系的理想基因。RNA结合 蛋白参与RNA的合成、加工、降解和运输的全部过程。RNA结合蛋白基因是水稻中 一类大的基因家族，在水稻生长和发育中发挥着重要作用，如RNA结合蛋白AK061072
(KOME接受号)。
发明内容
4本发明的一个目的是提供一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法。
本发明所提供的辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻基因组中编码序 列表中序列4所示蛋白的基因的内含子中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺 失，则所述待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则所述待测水稻为候选粳稻
a) 序列表中序列3中自5'末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；
b) 核苷酸序列与a)限定的序列具有97%以上的同源性、且长度为134bp-144bp 的DNA片段。
其中，所述编码序列表中序列4所示蛋白的基因为如下1)或2)所示基因
1) 序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 与1)限定的DNA分子具有97%以上同源性且编码序列表中序列4所示蛋白 的DNA分子；
其中，所述缺失可以通过PCR扩增检测。
所述PCR扩增，可以在所述缺失片段的两侧设计引物，使所扩增的目的片段可 以是在上述l)或2)中所述基因中的、至少包括上述a)或b)所述片段的任一片 段。
所述PCR扩增，也可以在缺失片段内设计一条或两条引物，若扩增得到产物， 则待测水稻为候选粳稻，若扩增得到不产物，则待测水稻为候选籼稻。
所述PCR扩增中所用的引物具体可以是如下引物其中的一条引物序列如序列 表中序列l所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示。
所述PCR扩增检测中，在得到PCR.产物后，可以通过电泳、酶切、测序等方法 进一步检测产物中是否存在上述缺失；所述电泳可以是琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰 胺凝胶电泳等。
在用序列表中序列1和序列2所示的引物对扩增，并用琼脂糖凝胶电泳时，若 所述PCR扩增的产物显示为大于250bp小于400bp的条带，则所述待测水稻为候选 籼稻，若所述PCR扩增的产物显示为大于500bp小于750bp的条带，则所述待测水 稻为候选粳稻。
用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物也癘于本发明的保护范围。 所述引物可以为扩增上述l)或2)中所述基因中的、至少包括上述a)或b)
所述片段的任一片段所用的引物。
所述引物具体如下其中的一条引物序列如序列表中序列l所示，另一条引物
序列如序列表中序列2所示。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在发育早期筛选籼稻和粳稻品种或地 方种，了解秈稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、 优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成 本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种
质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。
图1为AK061072基因在日本晴和93-11中的基因组序列比对结果(来自TIGR 网站)及引物在基因组序列中位置的示意图。
图2为以日本晴和93-11的基因组DNA为模板，以RRMF1和RRMR1为引物的PCR 扩增产物的电泳图。
图3为17个水稻品种、地方种和2个野生稻基因组画A为模板，以RRMF1和 RRMR1为引物的PCR扩增产物的电泳图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 下述实施例中的水稻品种、地方种和野生稻均来自国家种质资源库。 实施例l、 KOME Accession No. AK061072的基因在籼稻和粳稻中不同表达模式 的发现
对籼稻(93-11)和粳稻(日本晴)不同发育时期叶片芯片数据进行分析，结 果基因AK061072在93-11中的表达明显低于日本晴。推断，造成基因差异表达的原 因可能是基因第一个内含子部分存在插入/或缺失(InDel)。
实施例2、用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物设计
应用比较基因组学的方法，首先对基因AK061072 (序列表中序列3所示基因) 在籼稻品种93-11和粳稻品种日本晴的基因组序列进行比对，结果发现与日本晴 相比，在93-11中基因第一个内含子中有139bp的缺失(即序列表中序列3自5， 末端第717-855位核苷酸)(图l)。
为进一步验证该差异是否真实存在，根据日本晴序列在139bp缺失的两端设计 引物RRMF1和RRMR1 (序列分别如序列表中序列1和序列2所示)，并用93-11和 日本晴的基因组DNA为模板进行PCR扩增验证。具体PCR扩增体系如下总反应体 系为25(^1，其中水稻基因组DNA模板10ng， Taq酶1U， 10xPCR缓冲液2. 5|_il， dNTP Mixture (2. 5 mM) 2. 5(il，混合引物(2. 5raM) l|il，余下体积加灭菌水补足到25|al。
6PCR反应条件如下先94。C预变性4min;然后94"C变性45S; 55。C退火45S; 72°C 延伸lmin，共32个循环；最后72"C保温10min。 PCR扩增产物通过1. 2%的琼脂糖 凝胶电泳检测扩增产物的大小。结果如图2所示，由日本晴扩增得到的产物在琼脂 糖凝胶上显示为大于500bp小于750bp的条带，由93-11扩增得到的产物在琼脂糖 凝胶上显示为大于250bp小于400bp的条带(M为DL2000标记，l为93-11， 2为 日本晴，3为水对照)。
实施例3、用引物RRMF1和RRMR1辅助筛选水稻籼、粳亚种的应用
首先通过形态指标及相关文献检索随机挑选8个籼稻和其地方种、9个粳稻和 其地方种和2个典型的粳型普通野生稻，这些材料均来自国家种质资源库93-11 (籼稻)、细麻柞谷(籼稻)、紫糯(籼稻)、桂朝2号(籼稻)、窄叶青(籼稻)、 IR24 (籼稻)、特青(籼稻)、深水稻(籼稻)、日本晴(粳稻)、越富(粳稻)、 光壳粳稻(粳稻)、云峰7号(粳稻)、台北309 (粳稻)、京系17 (粳稻)、中 花ll (粳稻)、丽江(粳稻)、沈农265 (粳稻)、东乡普通野生稻(粳型普通野 生稻)和元江普通野生稻(粳型普通野生稻)。
分别提取以上材料基因组DNA，在引物RRMF1和RRMR1的引导下进行PCR扩增， 总反应体系25pl，其中水稻基因组DNA模板10ng， Taq酶1U， 10xPCR缓冲液2. 5(il， dNTP Mixture (2. 5 mM) 2. 5jal，混合引物(2. 5慮)lfil，余下体积加灭菌水补足 到25^1。 PCR反应条件为先94。C预变性4min;然后94"变性45S; 55。C退火45S; 72-C延伸lmin，共32个循环；最后72"C保温10min。反应结束，用1. 2%的琼脂糖 凝胶电泳检测扩增产物的大小，实验设3次重复。
三次重复所得的实验结果完全一致，如图3所示，1一19编号分别为93-11、 细麻柞谷、紫糯、桂朝2号、窄叶青、IR24、特青、深水稻、日本晴、越富、光壳 粳稻、云峰7号、台北309、京系17、中花ll、丽江、沈农265、东乡普通野生稻 和元江普通野生稻。
PCR检测结果表明样品编号l-8产物在琼脂糖凝胶上显示为大于250bp小于 400bp的条带，为籼稻，而样品编号9一19产物在琼脂糖凝胶上显示为大于500bp 小于750bp的条带，为粳稻。20为水对照，则无扩增产物。
对照形态指标及相关文献结果，引物RRMF1和RRMR1辅助筛选水稻籼粳亚种、 地方种和普通野生稻的准确率为100%，因此引物RRMF1和RRMR1可用作水稻籼粳亚 种的辅助筛选标记。序列表
〈110〉中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>—种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物
〈130〉CGGNAC92083
<160>4
〈210〉1
〈211〉20
<212>腿
<220> <223〉
<400>1
g鄉a3tcca ctagatgagg 20
<210>2
〈211>20
〈212〉DNA
<220> <223〉
〈400〉2
gggagtatac tcacgtatcc 20
<210〉3
<211>2400
<212>腿
<213>水稻属水稻(C>o;za ra//vfl var. Nipponbare)
8<400〉3
CCtt3tCttC
ccaccctctt ccgcgccgcc cgccaccggc tggaggagga ttgttggtaa ccggctccgt tcatagtttc
3ttt3t3C3t
ctaggattta tsgtagttas aactacagag
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3tC"ttt3tct
gtatacaatg ttattgattg ggccatggat ttstctsccc tctgcccttt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 114〇 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 174 0 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 24 00
<210〉 4 〈211〉 264 〈212〉 PRT
<213〉 tK稻属tK稻(Oyzasaf/vavar. Nipponbare) <400〉4
Met Ala Ala Thr Leu Phe Ser Thr Ser Leu Thr Pro Thr Phe Leu Pro 15 10 15
Ala Val Pro Cys Pro Lys Pro Ala Pro Pro Ala Ser Ala Cys Phe Pro
920 25 30
Cys Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ala Leu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Leu 35 40 45
Arg Arg Arg Leu Ser Pro Val Ala Val Ala Val Ser Ser Glu Val Glu 50 55 60
Glu Glu Glu Gly Gly Ala Glu Ser Glu Gly Glu Phe Ala Glu Asp Leu 65 70 75 80
Lys Val Phe Val Gly Asn Leu Pro Phe Ser Val Asp Ser Ala Gin Leu 85 90 95
Ala Gly Leu Phe Glu Gin Ala Gly Ser Val Glu Met Val Glu Val Val 100 105 110
Tyr Asp Arg Gin Thr Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Phe Val Thr Met 115 120 125
Ser Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ala Ala lie Glu Gin Phe Asn Gly Tyr 130 135 140
Thr Phe Gin Gly Arg Pro Leu Arg Val Asn Ser Gly Pro Pro Pro Pro 145 150 155 160
Arg Asp Asp Phe Ala Pro Arg Ser Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asn Phe 165 170 175
Asp Ser Ser Asn Lys Leu Tyr Val Gly Asn Leu Ala Trp Gly Val Asp180 185 190
Asn Ser Thr Leu Glu Asn Leu Phe Ser Glu Gin Gly Thr Val Leu Asp 195 200 205
Ala Lys Val lie Tyr Asp Arg Glu Ser Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly 210 215 220
Phe Val Thr Tyr Gly Ser Ala Glu Glu Val Asn Asn Ala lie Ser Asn 225 230 235 240
Leu Asp Gly Val Asp Leu Asp Gly Arg Gin lie Arg Val Thr Val Ala 245 250 255
Glu Ser Lys Pro Arg Arg Gin Phe 260
权利要求
1、一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法，是检测待测水稻基因组中编码序列表中序列4所示蛋白的基因中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺失，则所述待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则所述待测水稻为候选粳稻a)序列表中序列3中自5’末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；b)核苷酸序列与a)限定的序列具有97％以上的同源性、且长度为134bp-144bp的DNA片段。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述编码序列表中序列4所示蛋白的基因为如下l)或2)所示基因1) 序列表中序列3所示的DNA分子；2) 与1)限定的DNA分子具有97。/。以上同源性且编码序列表中序列4所示蛋白的DNA分子。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述缺失是通过PCR扩增检测的。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，所用的引物序列位于所述基因的序列内、并且其中至少一条引物的序列位于所述片段的序列内。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中，所用的引物序列位于所述基因的序列内、并分别位于所述片段的两侧。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增中所用的引物如下其中的一条引物序列如序列表中序列l所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示。
7、 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述PCR扩增检测包括对所述PCR扩增的产物进行电泳的步骤。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述电泳为琼脂糖凝胶电泳；在所述琼脂糖凝胶上，若所述PCR扩增的产物显示为大于250bp小于400bp的条带，则所述待测水稻为候选籼稻，若所述PCR扩增的产物显示为大于500bp小于750bp的条带，则所述待测水稻为候选粳稻。
9、 用于辅助筛选籼稻和粳稻的引物，为扩增在权利要求l中所述基因中的、至少含有权利要求1中所述片段的任一片段的引物。
10、根据权利要求9所述的引物，其特征在于其中的一条引物序列如序列表 中序列1所示，另一条引物序列如序列表中序列2所示。
全文摘要
本发明公开了一种辅助筛选籼稻和粳稻的方法及其专用引物。该方法，是检测待测水稻基因组中编码序列表中序列4所示蛋白的基因中是否缺失如下a)或b)所示片段，若缺失，则所述待测水稻为候选籼稻，若不缺失，则所述待测水稻为候选粳稻a)序列表中序列3中自5’末端第717-855位核苷酸所示的DNA片段；b)核苷酸序列与a)限定的序列具有97％以上的同源性的DNA片段。本发明辅助筛选水稻籼粳亚种的方法可在发育早期筛选籼稻和粳稻品种或地方种，了解籼稻和粳稻的遗传分化程度，对籼、粳稻杂种优势的利用和培育高产、优质的杂交稻具有重要指导作用，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本，具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为水稻籼粳亚种种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法。
文档编号C12Q1/68GK101487055SQ20091007779
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者朱立煌, 李德军, 李晓兵 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所