专利名称：：重组人干扰素a2b的基因优化及高效表达的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体地涉及重组人干扰素a2b编码基因的优化、高效可溶性表达及高活性纯化。
背景技术：
：重组人干扰素a2b具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用，是治疗急慢性病毒性肝炎的首选治疗药物。但是，重组人干扰素a2b存在表达效率不高、且目的蛋白多为包涵体等工业化生产的制约因素。目前工业化生产重组人干扰素a2b的表达量约为20%30%,表达形式为包涵体蛋白，必须经过变性剂溶解包涵体，然后除去变性剂使包涵体蛋白复性等工艺步骤，获得的蛋白活性低，比活仅为2.0x10sIU/mg。解决该问题的有效途径之一就是通过基因序列修饰以提高表达水平并增加蛋白的可溶性表达，提高纯化后蛋白的活性。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供重组人干扰素a2b编码基因的优化序列，本发明的又一目的是提供一株高效可溶性表达重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌。(二)技术方案本发明提供了一株高效表达可溶性重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌(Esc/zeWc/n'aco/z〕CGMCCNo.2827。该菌株已于2008年12月25日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2827。本发明提供了两条重组人干扰素a2b编码基因的大肠杆菌密码子优化序列IFN-a2b及hlFN-a2b，其核酸序列分别如SEQIDNo:l及SEQIDNo:2所示。本发明公开了两条大肠杆菌密码子优化序列IFN-a2b及MFN-a2b以及高效表达可溶性重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌(Esc/^Wc/n'aco//)CGMCCNo.2827在工业化生产重组人干扰素a2b中的应用。(三)有益效果本发明提供的高效表达可溶性重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌(&c/zm'c/^co/z〕CGMCCNo.2827，其重组人干扰素a2b基因序列是经由大肠杆菌密码子优化的序列，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的50%以上，且90%以上以可溶性蛋白的形式存在。蛋白的纯化，经过常规离子交换、分子筛等纯化步骤，无需变性复性，获得的蛋白活性高，达到4.Oxl08lU/mg。本发明所述的菌株于2008年12月25曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2827。图1是重组人干扰素a2b编码基因的特异性扩增片段凝胶电泳图，泳道l为大肠杆菌密码子优化后的IFN-a2b基因扩增结果(520bp),泳道2为大肠杆菌密码子优化后的WFN-a2b基因扩增结果(520bp),M为DNA分子量标记DL2000;图2是重组质粒A^M与五coRI双酶切鉴定图，泳道1为pET43.1a-IFNa2b(505bp+5612bp)，泳道2为pET43.1a-hlFNa2b(505bp+5612bp)，M为DNA分子量标记DL15000;图3是重组人干扰素a2b诱导表达后的SDS-PAGE检测图，泳道1表示重组质粒pET43.1a-IFNa2b在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中未进行诱导表达的结果，泳道2和3表示重组质粒pET43.1a-IFNa2b在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的诱导表达结果，泳道4和5表示重组质粒pET43.1a-hlFNa2b在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的诱导表达结果，泳道6表示重组质粒pET43.1a-hlFNa2b在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中未进行诱导表达的结果，Ml和M2为蛋白分子量标记；4图4是重组人干扰素a2b蛋白的可溶性表达分析图，泳道1表示超声破碎后离心的沉淀物，泳道2表示超声破碎后离心的上清液，M为蛋白分子量标记；图5是重组人干扰素a2b蛋白纯度检测分析图，泳道l、2表示离子交换层析后层析主组分电泳纯度，泳道3、4表示分子筛层析纯化后主组分电泳纯度，M为蛋白分子量标记；具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1重组人干扰素a2b编码基因的优化及克隆构建根据人干扰素IFN-a2b公布的氨基酸序列进行基因序列优化设计。IFN-cc2b前体的天然氨基酸序列如下丄環丄Z^LSC腐C^GCDLPOTHSLGS。其中，斜体字部分的17个氨基酸表示信号肽，从第18个氨基酸序列开始为成熟的人干扰素IFN-a2b蛋白。根据《分子克隆(第三版)》的经典操作对重组人干扰素a2b编码基因按大肠杆菌密码子偏爱性进行优化，优化设计得到的两条基因序列分别命名为IFN-a2b及MFN-a2b，其核酸序列分别如SEQIDNo:1及SEQIDNo:2所示。通过引物两两搭接的方式进行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的合成，设计的引物序列如表l所示表1重组人干扰素a2b编码基因优化修饰引物设计表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>IFN-a2b-F055，-CCGGTGCTGCATGAGATGATCCAGCAGATTTTCAATCTGTTTAGCACGAA-3，IFN-a2b-F065，-AGATAGCAGCGCCGCCTGGGATGAAACCCTGCTGGATAAATTTTATACC-3'IFN-a2b-F075，-GAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGTGTGATTCAGGGTGT-3，IFN-a2b-F085'-TGGCGTGACGGAGACCCCGCTGATGAAAGAAGATAGCATCCTGGCGGTG-3'IFN-a2b-F095,-CGTAAATATTTCCAGCGCATTACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATATAG-3'IFN-a2b-F105，-CCCGTGTGCCTGGGAAGTTGTGCGTGCGGAGATTATGCGCAGCTTTAGC-3，IFN-a2b-Fll5，-CTGAGCACCAATCTGCAGGAAAGCCTGCGTAGCAAAGAATAATgaattcc-3'IFN-a2b-R015，-GGAATTCATTATTCTTTGCTACGCA-3'IFN-a2b-R025，-GGCTTTCCTGCAGATTGGTGCTCAGGCTAAAGCTGCGCATAATCTCCGC-3'IFN-a2b-R035，-ACGCACAACTTCCCAGGCACACGGGCTATATTTCTTTTCTTTCAGGTACA-3'IFN-a2b-R045，-GGGTAATGCGCTGGAAATATTTACGCACCGCCAGGATGCTATCTTCTTT-3，IFN-a2b-R055，-CATCAGCGGGGTCTCCGTCACGCCAACACCCTGAATCACACACGCTTCCA-3，IFN-a2b-R065'-GATCGTTCAGCTGCTGATACAGTTCGGTATAAAATTTATCCAGCAGGGT-3，IFN-a2b-R075，-TTCATCCCAGGCGGCGCTGCTATCTTTCGTGCTAAACAGATTGAAAATCT-3，IFN-a2b-R085'-GCTGGATCATCTCATGCAGCACCGGAATGGTTTCCGCTTTCTGAAACTG-3'IFN-a2b-R095'-GTTGCCAAATTCTTCCTGCGGGAAACCAAAATCATGGCGATCTTTCAGGC-3'IFN-a2b-R105，-AGCTAAACAGGCTAATACGGCGCATCTGCGCCAGCAGCATCAGGGTACG-3，IFN-a2b-Rll5'-ACGGCTGCCCAGGCTATGGGTCTGCGGCAGATCGCACATATGGGATCCCG-3，hIFN-a2b-F015,-GGAATTCCATAtgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctga-3'将表1中设计合成的22条引物(IFN-a2b-F01到IFN-a2b-Fll共11条，IFN-a2b-R01到IFN-a2b-Rll共11条)混合后进行PCR预反应，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反应体系如下10xPCRBuffer5単dNTPmix(2.5mMeach)4.0^1上述22条引物(10nM)各1.5(xlTaqDNAPolymerase(5U/nl)l.OplddH207.0nlTotalVolume50.0nl用bio-radPTC-240PCR仪进行反应，PCR循环条件为195。C3min295°C30s365。C30s472°Clmin5Step2~45cycles695°C30s760。C30s6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以PCR预反应的产物为模板，进行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的扩增，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反应体系如下1OxPCRBuffer5.0|xldNTPmix(2.5mMeach)4.0^1IFN隱a2b-F01或WFN-a2b-F01(10pM)2.(^1IFN-a2b-R01(10nM)2.0^1TaqDNAPolymerase(5U/nl)1.OnlddH2036.0nlTotalVolume50.0^1用bio-radPTC-240PCR仪进行反应，PCR循环条件为195°C3min2950C30s360°C30s472°Clmin5Step2~430cycles672°ClOminPCR分别扩增获得大小约为520bp的特异性扩增产物片段，即大肠杆菌密码子优化后的IFN-a2b基因和hlFN-a2b基因，如附图1所示。用QIAquickGelExtractionKits(QIAGEN)分别对PCR产物进行切胶回收纯化。纯化后的片段用肠I(Takara,CatalogNo.D1161A)和i"coRI(Takara，CatalogNo.D1040A)双酶切，重组表达载体pET43.la质粒(Novagen，CatalogNo.70939-3)同样用WeI和I双酶切，酶切体系如下Totalvolume50.0|a1Totalvolume50.0nl将酶切纯化后的片段IFN-a2b或hlFN-a2b与相同酶切的原核表达载体pET43.la用T4DNA连接酶(Takam，CatNo.D2011A)进行连接，连接反应体系如下将上述体系混匀，瞬时离心，16。C连接过夜。连接产物转化co/z'DH5a感受态细胞(TIANGEN,Cat.No.CB101-02)，涂含lOOmg/LAmp的LB筛选平板，挑取单克隆在培养扩增后用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN，Cat.No.27106)进行抽提，用AfcfeI和I进行双酶切鉴定，大小正确的重组质粒(酶切大小为505bp+5612bp,如附图2所示)送人类基因组北方中心(诺赛基因)进行基因序列测定，测序正确的重组质粒命名为pET43.1a-IFNa2b及pET43.1a-hlFNa2b。实施例2重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)及重组人干扰素a2b的诱导表达将测序正确的重组质粒pET43.1a-IFNa2b及pET".la-hlFNa^分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(Novagen,CatalogNo.69450)的感受态细胞，涂布含100mg/LAmp的LB筛选平板，表达菌株分别命名为BL21(DE3)10xT4DNAligasebufferIFN-a2b或hlFN-a2bpET43.1aT4DNAligaseddH20_Totalvolume载体酶切体系10xHbuffer5単逊I1.0|il五coRIl.OulpET43.1a15.0nlddH2028単片段酶切体系10xHbuffer敲IIFN-a2b或hIFN-a2bddH20<q<q<q刀<qolLiooooo<r8/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-h顾a2b。在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表达菌BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的单克隆接入5ml含100mg/LAmp的LB液体试管培养基中，37°C、200rpm条件下培养至OD值约为0.8(大约4-5h),加入IPTG(终浓度为lmM)在3(TC、150rpm条件下进行诱导表达。同时设置未加IPTG的对照菌，6小时后，以6000rpm离心3min收获菌体。用PBS的洗两遍后加入蛋白上样缓冲液，沸水洛煮沸5min,12000rpm离心2min后，用上清液进行SDS-PAGE检测。配制12%的聚丙烯酰胺凝胶，加入上述处理后的样品，上层胶以8V/cm的电压，分离胶以15V/cm的电压进行电泳，至溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳，切下分离胶，考马斯亮蓝染色lh后用脱色液进行脱色，待蛋白条带清晰后进行拍照。SDS-PAGE检测结果如附图3所示未诱导的表达菌(泳道1和泳道6)未能检测到重组人干扰素a2b蛋白的表达;IPTG诱导表达6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b菌体(泳道2和泳道3)中能检测到重组人干扰素a2b蛋白的表达(表观分子量约19kD,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的15%);IPTG诱导表达6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b菌体(泳道4和泳道5)中能检测到重组人干扰素a2b蛋白的高效表达(表观分子量约19kD,目的蛋白表达量大于菌体总蛋白的50%)本发明所述的菌株BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b于2008年12月25日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2827。实施例3重组人干扰素a2b蛋白的可溶性表达分析在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表达菌BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的单克隆接入20ml含100mg/LAmp的LB液体三角瓶培养基中，37°C、200rpm条件下培养过夜，以1:200的比例转接于4L含新鲜9LB液体培养基(100mg/LAmp)的发酵罐中，37。C培养至OD600达0.6时，加IMIPTG至终浓度为lmM进行诱导表达6h，在4。C，6000rpm条件下离心15min收集菌体。用0.9。/。NaCl溶液洗涤菌体，在4。C，6000rpm条件下离心15min收集沉淀。按照lg菌体对应10111188^1"17.2)的比例加入？88缓冲液，充分混句，在冰水洛中，使用600W(超声频率)，5s(超声时间)，15s(间歇时间)进行超声破菌15min。吸取lml的超声破碎液于4°C,13000rpm条件下离心5分钟，吸出上清100pl加入IOOmI的蛋白上样缓冲液，沉淀用PBS洗涤1次后再用lOOjil的PBS重悬并加入100ial的蛋白上样缓冲液，沸水洛煮沸5min后，各取15样品进行SDS-PAGE蛋白电泳以检测重组人干扰素a2b蛋白的可溶性。SDS-PAGE检测结果如附图4所示超声破碎后的沉淀物(泳道1)和上清(泳道2)中均有重组干扰素a2b蛋白的表达(表观分子量19kD处)，且在相同上样体系(15jil)条件下，超声破碎后上清中重组干扰素a2b蛋白的表达量要高于超声破碎后的沉淀物。由于上清液(lml)与沉淀物(IOOmI)的体积比为10:1。所以在诱导后的表达菌株中，重组人干扰素a2b蛋白的90%以上以可溶性蛋白的形式存在。实施例4重组人干扰素a2b蛋白的表达纯化及活性测定实施例3中菌体超声破碎后上清液，经离子交换层析、超滤浓缩、分子筛层析纯化后，获得纯度99。/。以上重组人干扰素a2b蛋白。电泳纯度检测结果见附图5。离子交换层析后层析主组分(泳道l、2)，电泳纯度98%;分子筛层析纯化后(泳道3、4)，电泳纯度99%以上。经细胞病变抑制法测活，比活达到4.0x108IU/mg。10序列表序列表<110〉北京凯因科技股份有限公司<120>重组人干扰素a2b的基因优化及高效表达〈130>kawin0812〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.2〈210>1<211>520<212>腿<213〉大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)<400>1cgggatcccatatgtgcgatctgccgcagacccatagcctgggcagccgtcgtaccctga60tgctgctggcgcagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgatt120ttggtttcccgcaggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcgg犯accattccggtgc180tgcatgagatgatccagcagattttcaatctgtttagcacgaaagatagcagcgccgcct240ggg3tg犯3Ccctgctggataaat111ataCCg犯Ctgt3tcagcagctgaacgatctgg300aagcgtgtgtgattcagggtgttggcgtgacggagaccccgctgatgaaagaagatagca360tcctggcggtgcgtaaatatttccagcgcattaccctgtacctgaaagaaaaga犯tat3420gcccgtgtgcCtgggElElgttgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctgagcacca480atctgcaggaaagcctgcgt犯tg犯ttcc520<210>2<211>502<212〉腿〈213〉大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)<400〉2atgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctgatgctgctggcg60cagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgattttggtttcccg120caggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcggaaaccattccggtgctgcatgagatg180atccagcagattttcaatctgtttagcacga犯gatagcagcgccgcctgggatgaaacc240ctgctggataaattttataccgaactgtatcagcagctgaacgatctggaagcgtgtgtg300attcsgggtgttggcgtgacggagaccccgCtg3tg犯3g犯gatagcatcctggcggtg360cgt犯atatttccagcgcattaccctgtacctg犯aga^agaaatatagcccgtgtgcc420tggg犯gUgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctctgcaggaa480agcctgcgtagca犯gaataat5021权利要求1、两条重组人干扰素a2b编码基因的大肠杆菌密码子优化序列IFN-a2b及hIFN-a2b，其核酸序列分别如SEQIDNo1及SEQIDNo2所示。2、一株高效表达重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌(Esc/7er/c/2/aco//)CGMCCNo.2827。3、根据权利要求1所述的大肠杆菌密码子优化序列IFN-a2b及MFN-a2b在工业化生产重组人干扰素a2b中的应用。4、根据权利要求2所述的大肠埃希氏菌在工业化生产重组人干扰素a2b中的应用。全文摘要本发明提供了两条重组人干扰素a2b编码基因的优化序列，以及一株高效表达重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌。本发明提供的高效表达重组人干扰素a2b的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCCNo.2827，其重组人干扰素a2b基因序列是经由大肠杆菌密码子优化的序列，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的50％以上，且表达的蛋白更易于纯化并具有更高的活性。文档编号C12P21/02GK101508994SQ20091007777公开日2009年8月19日申请日期2009年2月19日优先权日2009年2月19日发明者春吉,周德胜,张春丽申请人:北京凯因科技股份有限公司