专利名称：：Prrsv经典株与高致病性变异株双重实时荧光rt-pcr鉴别检测方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体是一种用特异性引物和探针同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与高致病性变异株的方法。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的接触性传染病。PRRSV首先在荷兰和美国分离到，并分别作为欧洲型(LV)和美洲型(VR-2332)的原型毒株。目前PRRS已经遍及全球各养猪业发达的国家和地区，给世界养猪业及其相关行业带来了巨大的经济损失。近年来，我国相继分离了PRRSVCH-la、Sl、HB-1和HB-2等毒株，经鉴定均为美洲型PRRSV。2006年6月份以来，我国大多数省份的养猪场、户爆发猪"高热病"疫情，临床上以体温高、发病率高、死亡率高为特征，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年1月，农业部已确定其原发病因是PRRSV高致病性变异株，源于美洲型PRRSV，但其毒力远高于以前国内流行的PRRSV毒株。目前检测PRRSV的常用方法主要有病毒分离鉴定、血清学检测以及普通RT-PCR，但这些常规方法费时费力、敏感性低且容易出现假阳性。国内外已建立了针对所有PRRSV的实时荧光RT-PCR检测方法，但此方法只能检测是否有PRRSV感染，无法判定是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者共同感染。此外，己有的针对PRRSV高致病性变异株的实时荧光RT-PCR检测方法，只能检测PRRSV高致病性变异株，无法判定是单一PRRSV高致病性变异株感染，还是PRRSV经典株与高致病性变异株共同感染。即使将现有的两种PRRSV实时荧光RT-PCR方法联合使用，依然无法判定是否存在共同感染的问题，无法为我国快速、有效地监控PRRSV疫情提供强有力的技术支持。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的PRRSV经典株与高致病性变异株"一步"鉴别的检测方法意义重大。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法。此方法只需一次检测便能判定样本是否含有PRRSV经典株，或者含有PRRSV高致病性变异株，或者是两者共同感染。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，可以同时进行大批量的样本分析，为PRRS疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。本发明是通过以下技术方案实现的PRRSV经典株美洲型PRRSV标准毒株VR2332和国内分离株CH-la，由农业部兽医诊断中心提供。PRRSV高致病性变异株由中国动物疫病预防控制中心分离鉴定的NVDC-JXA1毒株，保藏编号为CGMCCNo.1964，涉及的专利号为ZL200710086549.7。在本发明的研究过程中用到的其他毒株包括欧洲型PRRSV标准毒株LV，马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1，PCV2)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)均由农业部兽医诊断中心提供。(1)病毒特异性引物和探针设计所述的病毒特异性引物，指的是长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，与PRRSV经典株、PRRSV高致病性变异株ORFla基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；所述的病毒特异性探针，指的是长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5'端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3'端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minorgroovebinder,MGB)分子，与PRRSV经典株、高致病性变异株ORFla基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。本文所列出的核苷酸序列，均由5'端向3'端方向书写。①用于检测PRRSV经典株的核苷酸扩增引物和探针序列包括由核苷酸序列为CGCACCAGATGGRACCTACTT的上游引物PRRSV-F2和核苷酸序列为ACGGTGTTCAGTGAGGGCTTT的下游引物PRRSV-R3组成的引物对；以及由上游引物的反向互补序列AAGTAGGTYCCATCTGGTGCG和下游引物的反向互补序列AAAGCCCTCACTGAACACCGT组成的引物对；该引物对的上游引物PRRSV-F2位置向5'端方向延伸49个碱基，下游引物PRRSV-R3位置向3'端方向延伸60个碱基以及向5'端方向延伸33个碱基区域范围内得到的引物序列及其反向互补序列。探针PRRSV-P的核苷酸序列为CCAGTCAACGCAGCG，反向互补序列为CGCTGCGTTGACTGG，以及该探针向3'端方向延伸8个碱基区域范围内得到的探针序列及其反向互补序列。②用于检测PRRSV高致病性变异株的核苷酸扩增引物和探针序列包括由核苷酸序列为AGTGGGTCGGCACCAGTT的上游引物H-PRRSV-F2和核苷酸序列为GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT的下游引物H-PRRSV-R12组成的引物对；以及由上游引物的反向互补序列AACTGGTGCCGACCCACT和下游引物的反向互补序列ATGAGCCTCTGGATTTGTCTGC组成的引物对；该引物对的上游引物H-PRRSV-F2位置向5'端方向延伸28个碱基，下游引物H-PRRSV-R12位置向3'端方向延伸39个碱基区域范围内得到的引物序列及其反向互补序列。探针H-PRRSV-P的核苷酸序列为CGTAGAACTGTGACAAC，反向互补序列为GTTGTCACAGTTCTACG,以及该探针向5'端方向延伸6个碱基和向3'端延伸12个碱基区域范围内得到的探针序列及其反向互补序列。本发明还涉及一种用于同时检测PRRSV经典株和高致病性变异株的寡核苷酸引物对和探针的组合物，包括上述的引物对以及探针。此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。进一步的，本发明还涉及试剂盒在同时检测PRRSV经典株和高致病性变异株中的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、R0X或CY5。一种利用上述组合物同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的双重实时荧光RT-PCR方法，包括(1)针对PRRSVORFla基因设计的能鉴别PRRSV经典株与高致病性变异株的特异性引物和探针序列；(2)用荧光素标记的PRRSV经典株的探针，以及通过不同检测通道检测的另一种荧光素标记的PRRSV高致病性变异株的探针；其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。(3)将用于检测PRRSV经典株或高致病性变异株的引物和探针序列，或用于鉴别PRRSV经典株与高致病性变异株的引物和探针序列，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。本发明的显著特点是充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PRRSV经典株与高致病性变异株的鉴别检测，可以确定样本是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者共同感染。具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、降低检测成本、提高检测效率等优点。图1为一步法RT-PCR方法原理图。图2为TaqMan探针法原理图。图3为双重荧光RT-PCR引物与探针优化组合筛选图(A为PRRSV经典株引物探针筛选结果，B为PRRSV高致病性变异株引物探针筛选结果)。A中曲线l、2、3、4为PRRSV经典株探针与引物对组合筛选结果。图中曲线1为引物对PRRSV-F2/PRRSV-R3和探针PRRSV-P组合的扩增结果，曲线2、3、4为其它组合筛选扩增情况。B中曲线1、2、3、4为PRRSV高致病性变异株探针与引物对组合筛选结果。图中曲线1为引物对H-PRRSV-F2/H-PRRSV-R12和探针H-PRRSV-P组合的扩增结果，曲线2、3、4为其它组合筛选扩增情况。图4为PRRSV经典株实时荧光RT-PCR检测特异性扩增曲线图。图中曲线1为PRRSV经典株VR2332特异性扩增曲线，曲线2为PRRSV高致病性变异株(JXA1)及其他病毒(LV、EAV、CSFV、JEV、PCV1、PCV2、PPV及PRV)扩增情况。图5为PRRSV高致病性变异株实时荧光RT-PCR检测特异性扩增曲线图。图中曲线1为PRRSV高致病性变异株JXA1特异性扩增曲线，曲线2为PRRSV经典毒株(VR2332、CH-la)及其他病毒(LV、EAV、CSFV、JEV、PCV1、PCV2、PPV及PRV)扩增情况。图6为PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法特异性扩增曲线图。图中曲线1为PRRSV经典株VR2332特异性扩增曲线，曲线2为PRRSV高致病性变异株JXA1特异性扩增曲线，曲线3为其他病毒(LV、EAV、CSFV、JEV、PCV1、PCV2、PPV及PRV)扩增情况。图7为用PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法检测PRRSV经典株的敏感性扩增曲线图。图中曲线l-7分别代表VR2332在浓度为TCID501055100'5时的扩增结果。图8为用PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法检测PRRSV高致病性变异株的敏感性扩增曲线图。图中曲线1-8分别代表JXA1在浓度为TCID5010561014时的扩增结果。具体实施例方式下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。实施例l标准品RNA的构建(1)实验试剂限制性酶PstI、酶切对应的缓冲液10xHBuffer以及DL2000Marker购自TaKaRa公司；pGEM-TEasy连接试剂盒、TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs购自Promega公司；DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；高效大肠杆菌感受态细胞DH5a购自北京全式金生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。(2)实验仪器TGRANDIENTPCR仪购自HYBAID公司；DYFIII2型电泳仪购自Bio-Rad公司；UVP凝胶成像分析系统购自Gene公司；SterilGARD⑧生物安全柜购自BAKER公司；恒温水浴锅购自pHaramacia公司；恒温培养箱购自Kendro公司。(3)实验步骤①在GeneBank上查找已知的PRRSV基因组序列，通过序列比对确定PRRSV经典株与高致病性变异株的ORFla基因的特异性高度保守区。设计包含PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR扩增核苷酸片段的引物，引物序列见表l。以PRRSV经典株与高致病性变异株的RNA为模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增体系和扩增条件见表2，将通过扩增得到的含PRRSV经典株或高致病性变异株的保守序列的核苷酸片段分别称为基因PRRSV-Nsp3和基因H-PRRSV-Nsp2;②将扩增得到的基因PRRSV-Nsp3和基因H-PRRSV-Nsp2核苷酸片段纯化回收，分别连接到pGEM⑧-TEasy载体(l(VL连接体系3pL基因扩增产物，1^LpGEM-TEasy载体，lpLT4DNA连接酶，5pLT4DNA连接缓冲液；4'C过夜)，然后将连接产物转化到DH5a感受态细胞。通过质粒的纯化和鉴定，将分别含有基因PRRSV-Nsp3和基因H-PRRSV-Nsp2片段的标准质粒分子命名为pGEM-T/P-Nsp3和pGEM-T/HP-Nsp2;③用PstI将pGEM-T/P-Nsp3和pGEM-T/HP-Nsp2重组质粒酶切线形化，再以线性化片段为模板进行体外转录(用PromegaRiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7试剂盒)，反应结束后向体外转录产物中加入RQ1DNA酶除去残余的DNA分子。经提取和纯化，得到标准品RNA分子。表1PRRSV标准品的扩增引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2-1PRRSV标准品的RT-PCR扩增体系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>附*所用引物与表1中的引物相对应。表2-2PRRSV标准品的RT-PCR扩增条件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2样本RNA的提取根据生产商的建议，按照常规方法，利用QIAGENRNeasyMiniKit试剂盒(购自QIAGEN公司)，或者根据GTC法(异硫氰酸胍法)(RNAgentsTotalRNAIsolationSystem试剂盒购自Promega公司)提取各种来源待检样本的RNA。实施例3PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法特异性引物和探针筛选试验(1)实验试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；PRRSV经典株与高致病性变异株TaqManMGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV经典株与高致病性变异株的引物与探针设计PRRSV经典株与高致病性变异株的特异性引物，指的是长度为20个碱基左右的寡核苷酸链，分别与PRRSV经典株、高致病性变异株ORFla基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；PRRSV经典株与高致病性变异株的特异性探针，指的是长度为13到21个碱基之间的寡核苷酸链，其5'端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3'端标记自身不发光的淬灭基团同时另增加了小沟结合物(minorgroovebinder,MGB)分子；分别与PRRSV经典株、高致病性变异株ORFla基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补。根据获得的ORFla基因特异性高度保守区域，利用PrimerExpress3.0软件设计了针对PRRSV经典株与高致病性变异株的多个实时荧光RT-PCR扩增引物对和TaqManMGB探针，引物对与探针的具体序列见表3。表3用于PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR筛选的引物和探针<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4-2PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的反应条件循环数温度(。C)时间<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(4)结果判定①结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。②结果描述及判定对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则，敏感性原则和最高效扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的PRRSV经典株与高致病性变异株鉴别检测用引物对与探针最佳组合。(5)筛选试验方法与结果引物与探针的优化筛选方法如下任意选择一对引物与一条探针进行组合(如引物对PRRSV-F0/PRRSV-R0，加上探针PRRSV-P;引物对PRRSV-F1/PRRSV-R1，加上探针PRRSV-P1;引物对PRRSV-F2/PRRSV-R2，加上探针PRRSV-P2，引物对H-PRRSV-F1/H-PRRSV-R1，加上探针H-PRRSV-P;引物对H-PRRSV-F2/H-PRRSV-R2，加上探针H-PRRSV-P1;引物对H-PRRSV-F3/H-PRRSV-R3，加上探针H-PRRSV-P2;等等)，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。通过多次重复、对比试验，选定PRRSV经典株与高致病性变异株鉴别检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果如图3A和3B，具体序列见表5。表5PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的引物和探针序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4PRRSV经典株实时荧光RT-PCR检测方法(1)实验试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；PRRSV经典株TaqManMGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计参见实施例3，具体序列见表5。②PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的优化原则是通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。a、最佳荧光引物浓度的确定荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。b、最佳探针浓度的确定探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。c、最佳镁离子浓度的确定Mg^浓度在3mM到8mM之间进行筛选。d、反转录酶的用量确定反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。e、TaqDNA聚合酶的用量确定Taq聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。f、最佳dNTPs浓度确定dNTPs浓度在100pM到500^M之间进行筛选。经过优化，PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表6-1:反应条件见表6-2。表6-1PRRSV经典株特异性荧光RT-PCR检测体系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6-2PRRSV经典株特异性荧光RT-PCR检测扩增条件<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(4)结果判定①结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。②质控标准阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；阳性对照的Ct值应〈37，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。③结果描述及判定阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无PRRS经典株病毒。阳性样本Ct值〈7，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有PRRS经典株病毒。有效原则样本Ct值在37-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值〈7时样品为阳性，否则为阴性。(5)样本检测试验及结果试验对PRRSV经典毒株(VR2332)、PRRSV高致病性变异株(JXA1)、欧洲型PRRSV标准毒株(LV)、马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1，PCV2)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)进行扩增，结果只有PRRSV经典毒株(VR2332)得到特异性的荧光扩增曲线(图4)。实施例5PRRSV高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的优化和建立(1)实验试剂—OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；PRRSV高致病性变异株TaqManMGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计PRRSV高致病性变异株特异性RT-PCR检测的引物与探针设计参见实施例3，具体序列见表5。②PRRSV高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件PRRSV经典株实时荧光RT-PCR方法的优化原则是通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。a、最佳荧光引物浓度的确定荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。b、最佳探针浓度的确定探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。c、最佳镁离子浓度的确定Mg^浓度在3mM到8mM之间进行筛选。d、反转录酶的用量确定反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。e、TaqDNA聚合酶的用量确定Taq聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。f、最佳dNTPs浓度确定dNTPs浓度在100pM到500pM之间进行筛选。经过优化，PRRSV高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表7-1;反应条件见表7-2。表7-1PRRSV高致病性变异株特异性RT-PCR检测体系反应试剂体积(pL)终浓度2xOneStepRT-PCRBufferIII12.5TaKaRaExTaqHS0.5O.lU/pLPrimeScriptRTEnzymeMixII0.5---10pMH-PRRSV-F21(HiMH-PRRSV誦R121.25500nM/eachlOpMH-PRRSV-P0.5200nM50xROXReferenceDyeII0.510ngTotalRNA2.5Ing/fiLddH206.75---Total25---表7-2PRRSV高致病性变异株特异性RT-PCR检测扩增条件循环数温度(。c)时间1425min19510sec45955S6C6034sec(4)结果判定①结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。②质控标准空白对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；阳性对照的Ct值应〈37，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。③结果描述及判定阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无PRRS高致病性变异株病毒。阳性样本Ct值《7，且出现特异性扩增曲线，表示样本中含有PRRS高致病性变异株病毒。有效原则样本Ct值在37-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值〈37时样本为阳性，否则为阴性。(5)样本检测试验及结果试验对PRRSV高致病性变异株(JXA1)、PRRSV经典毒株(VR2332，CH-la)、欧洲型PRRSV标准毒株(LV)、马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1，PCV2)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)进行扩增，结果只有PRRSV高致病性变异株(JXA1)得到特异性的荧光扩增曲线(图5)。实施例6PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法(1)实验试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；PRRSV经典株与高致病性变异株TaqManMGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV经典株与高致病性变异株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计PRRSV经典株与高致病性双重实时荧光RT-PCR方法的引物与探针参见实施例3。具体序列见表5。②PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的优化指的是通过a、最佳荧光引物浓度的确定荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。b、最佳探针浓度的确定探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。c、最佳镁离子浓度的确定M^+浓度在3mM到8mM之间进行筛选。d、反转录酶的用量确定反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。e、TaqDNA聚合酶的用量确定Taq聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。f、最佳dNTPs浓度确定dNTPs浓度在100nM到500MM之间进行筛选。经过优化，PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法的反应体系见表8-l;反应条件见表8-2。表8-1PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测体系反应试剂体积(pL)终浓度2xOneStepRT-PCRBufferIII12.5TaKaRaExTaqTMHS0.50.1U/nLPrimeScriptRTEnzymeMixII0.5---MPRRSV-F210nMPRRSV-R31.25500nM/each10nMH-PRRSV-F210nMH-PRRSV-R121.25500nM/eachIO一PRRSV-P0.5200nMlOpMH-PRRSV-P0.5200nM50xROXReferenceDyeII0.510ngTotalRNA2.5lugddH20---Total25---表8-2PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测条件<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(4)结果判定①结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。②质控标准空白对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；阳性对照的Ct值应〈37，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。③结果描述及判定阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无PRRS经典株和高致病性变异株病毒。阳性样本Ct值<37，如果出现PRRSV经典株特异性扩增曲线，表示样本中有PRRS经典株病毒；如果出现PRRSV高致病性变异株特异性扩增曲线，表示样本中有高致病性变异株病毒；如果同时出现PRRSV经典株和高致病性变异株特异性扩增曲线，表示样本中同时含有PRRS经典株和高致病性变异株病毒。有效原则样本Ct值在37-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值〈37时样品为阳性，否则为阴性。(5)样本检测试验及结果试验对PRRS经典株病毒(VR2332)、PRRSV高致病性变异株(JXA1)、马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1，PCV2)、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)进行扩增，结果只有PRRS经典株病毒(VR2332)与高致病性变异株(JXA1)得到特异性的荧光曲线(图6)。实施例7PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法敏感性试验(1)实验试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；PRRSV经典株与高致病性变异株TaqManMGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV经典株与高致病性变异株病毒样本制备使用实施例2中的RNA提取方法提取PRRSV经典株VR2332病毒细胞培养物(10"TCIDso)与PRRSV高致病性变异株JXA1病毒细胞培养物(1056TCID5o)的RNA。并对所得到的RNA分别进行10倍连续稀释。②PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法敏感性试验使用实施例6中的PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法，对PRRS经典株与高致病性变异株病毒IO倍连续稀释RNA进行检测，以判定方法的敏感性。(4)结果判定①结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。②质控标准空白对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；阳性对照的Ct值应〈37,且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。(5)梯度稀释样本检测结果由试验结果可见，PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法检测PRRSV经典株的敏感性达到3.2TCID5Q;检测PRRSV高致病性变异株的敏感性达到0.4TCID5c，敏感性很高(图7，8)。实施例8PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法与现有PRRSV实时荧光RT-PCR检测方法对比试验(1)实验试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)试剂盒购自TaKaRa公司；本发明的PRRSV经典株与高致病性变异株TaqManMGB探针及引物，现有的检测所有PRRSV毒株的TaqMan探针及引物，现有的检测PRRSV高致病性变异株的TaqMan探针及引物均由上海基康生物技术有限公司合成。(2)实验仪器AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem(3)实验过程①PRRSV经典株与高致病性变异株病毒样本制备使用实施例2中的RNA提取方法提取PRRS经典株VR2332病毒细胞培养物与PRRS高致病性变异株JXA1病毒细胞培养物的RNA。②PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法与现有PRRSV实时荧光RT-PCR检测方法对比试验査看NCBI数据库上现有的检测所有PRRSV毒株的实时荧光RT-PCR方法(Kleiboeker,S.B.，etal，2005.SimultaneousdetectionofNorthAmericanandEuropeanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirususingreal-timequantitativereversetranscriptase-PCR.JVetDiagnInvest.l7:165-170.)，和检测PRRSV高致病性变异株的实时荧光RT-PCR方法(Xiao,X丄.，etal,2008.RapiddetectionofahighlyvirulentChinese-typeisolateofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusbyreal-timereversetranscriptasePCR.JVirolMethods.149:49-55.)。按照相关材料说明的反应体系与扩增条件建立这两种方法。同时使用本发明建立的PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法、现有的检测所有PRRSV毒株的实时荧光RT-PCR方法和检测PRRSV高致病性变异株的实时荧光RT-PCR方法，对PRRSV经典株VR2332样本RNA、PRRSV高致病性变异株样本JXAlRNA及VR2332与JXA1的混合样本RNA进行检测。检测方法参见实施例6和现有的两种方法的资料。(4)实验结果利用这三种方法对这三份样本的检测结果见表9。表9三种方法对三种不同样本检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>结果:可见现有的检测所有PRRSV毒株的实时荧光RT-PCR方法只能检测是否有PRRSV感染，无法区分是PRRSV经典株感染，或者PRRSV高致病性变异株感染，或者两者共同感染；现有的检测PRRSV高致病性变异株的实时荧光RT-PCR方法只能检测是否有PRRSV高致病性变异株感染，无法检测PRRSV经典株，也无法判定是否为PRRSV经典株和高致病性变异株共同感染。因此，即使联合使用原有的两种方法，仍然无法对样本是单一PRRSV高致病性变异株感染或PRRSV经典株与高致病性变异株共同感染进行区分。而本发明建立的PRRSV经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR鉴别检测方法能通过一步反应判定检测样本是否有PRRSV经典株感染，或者PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者共同感染。权利要求1、一种用于检测PRRSV经典株的寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为CGCACCAGATGGRACCTACTT的上游引物PRRSV-F2和序列为ACGGTGTTCAGTGAGGGCTTT的下游引物PRRSV-R3组成的引物对；以及由上游引物的反向互补序列AAGTAGGTYCCATCTGGTGCG和下游引物的反向互补序列AAAGCCCTCACTGAACACCGT组成的引物对；该引物对的上游引物PRRSV-F2位置向5’端方向延伸49个碱基，下游引物PRRSV-R3位置向3’端方向延伸60个碱基和向5’端方向延伸33个碱基区域范围内得到的引物序列及反向互补序列。2、一种与权利要求l的引物对结合用于检测PRRSV经典株的探针，其特征在于，该探针为PRRSV-P，其序列为CCAGTCAACGCAGCG，反向互补序列为CGCTGCGTTGACTGG，以及该探针向3'端方向延伸8个碱基区域范围内得到的探针序列及其反向互补序列。3、一种用于检测PRRSV高致病性变异株的寡核苷酸引物对，其特征在于由序列为AGTGGGTCGGCACCAGTT的上游引物H-PRRSV-F2和序列为GCAGACAAATCCAGAGGCTCAT的下游弓|物H-PRRSV-R12组成的引物对；以及由上游引物的反向互补序列AACTGGTGCCGACCCACT和下游引物的反向互补序列ATGAGCCTCTGGATTTGTCTGC组成的引物对该引物对的上游引物H-PRRSV-F2位置向5'端方向延伸28个碱基，下游引物H-PRRSV-R12位置向3'端方向延伸39个碱基区域范围内得到的弓I物序列及反向互补序列。4、一种与权利要求3的引物对结合用于检测PRRSV高致病性变异株的探针，其特征在于，该探针为H-PRRSV-P，其序列为CGTAGAACTGTGACAAC，反向互补序列为GTTGTCACAGTTCTACG,以及该探针向5'端方向延伸6个碱基和向3'端延伸12个碱基区域范围内得到的探针序列及其反向互补序列。5、一种用于同时检测PRRSV经典株和高致病性变异株的寡核苷酸引物对和探针的组合物，包括权利要求1和3的引物对以及权利要求2和4的探针。6、一种包括权利要求5所述组合物的试剂盒。7、权利要求6的试剂盒在同时检测PRRSV经典株和高致病性变异株中的用途。8、权利要求7的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针所用的荧光素不同，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。9、利用权利要求5的组合物同时检测PRRSV经典株与高致病性变异株的双重实时荧光RT-PCR方法，包括(1)针对PRRSVORFla基因设计的能鉴别PRRSV经典株与高致病性变异株的特异性引物和探针序列；(2)用荧光素标记的PRRSV经典株的探针，以及通过不同检测通道检测的另一种荧光素标记的PRRSV高致病性变异株的探针；(3)将用于检测PRRSV经典株或高致病性变异株的引物和探针序列，或用于鉴别PRRSV经典株与高致病性变异株的引物和探针序列，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。10、权利要求9的方法，其中的探针用任意一种荧光素标记，且两种探针所用的荧光素不同，均可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。全文摘要本发明公开了一种鉴别检测PRRSV经典株与高致病性变异株的双重实时荧光RT-PCR方法，以及用于该方法的针对PRRSV经典株与高致病性变异株的RT-PCR扩增引物和探针。本发明的方法与现有技术相比，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可以同时进行大批量的样本分析，一次反应便能鉴别诊断样本是否是PRRSV经典株感染，或者是PRRSV高致病性变异株感染，或者是两者共同感染，为PRRS疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。文档编号C12Q1/70GK101643794SQ20091007770公开日2010年2月10日申请日期2009年2月12日优先权日2009年2月12日发明者振曹,王传彬,田克恭,遇秀玲,陈南华,陈西钊申请人:中国动物疫病预防控制中心