专利名称：一种基于细胞荧光图像的药物筛选方法
技术领域：
本发明属于药物筛选与新药发现研究领域，涉及应用荧光探针特异性标记细胞、 细胞显微图像自动获取技术、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取心血管 疾病治疗作用的相关指标并用于外源物质(如中药材、中药复方、活性化合物等)心血管保 护药效的筛选和评价，对于药物发现与药效评价具有重要意义。
背景技术：
冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔阻塞，导致心肌缺 血，缺氧而引起的心脏病，属中医“胸痹” “心痛”范畴；它和冠状动脉功能性改变(痉挛) 一起统称为冠状动脉性心脏病，亦称缺血性心脏病。世界各国、特别是发达国家患病率甚高，我国近年来亦有上升的趋势。人们迫切需 要研究冠心病的发病机制、影响因素和合理疗法，以便早期诊断、早期治疗。目前对于冠心病发病机制的研究主要集中在缺血再灌注损伤方面。缺血再灌注是 机体所产生的一个自我修复过程，同时又是动脉粥样硬化疾病进展成继发性心血管疾病如 急性心梗(AMI)、充血性心力衰竭、心律不齐等的共同病理基础与必经阶段，是影响冠心病 预后的重要环节。心脏缺血达到一定程度，会引起心肌组织细胞的损伤。血液的重新灌注是防止损 伤，使组织细胞存活下来的必要措施。但近年来越来越多的研究表明，再灌注不一定使缺血 损伤的组织细胞得到恢复，在一定条件下反而加重了损伤，由此逐渐形成了缺血一再灌注 损伤概念(ischemia-reperfusion injury, I-RI)。心肌是发生IRI的最常见组织之一，其发生机制可能与多种因素有关。近年已有 一些实验和临床研究发现，细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发病机制中的重要环节之 一。造成心肌细胞凋亡的原因主要是心肌缺血再灌注后，大量氧自由基的产生、钙内流增加 以及线粒体膜电位的改变等。中医治疗冠心病的历史悠久，中药尤其是中药复方具备多层面多靶点的整体治疗 优势。然而，虽然现在市场上广泛应用的中成药临床效果显著，但其对缺血心肌的心脏保护 的有效成分以及作用机制还不明确。因此，对这些天然产物进行有效成分的筛选和评价，将 有望从传统中药中找出新的心血管疾病治疗药物。目前，对于心肌保护组分的筛选主要是体外针对抗氧化活性的筛选，如DPPH法， MTT法、SOD以及LDH等酶活测定。但这些方法存在着作用时间久、灵敏度低等缺陷，不足以 满足化合物库以及中草药中多组分大量筛选的要求，因此，基于细胞荧光图像的高通量筛 选方法成为研究热点，期望能够通过荧光标记细胞或者亚细胞器观察细胞形态学以及细胞 器功能的改变，从而定量评价物质的心肌保护效果，从而快速筛选心血管疾病治疗药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，是一种基于荧光标记线粒体膜电位的心肌保护药物活性组分筛选和药效评价方法，可用于心血管疾 病治疗药物发现。该药物筛选方法通过控制荧光倒置显微镜上的高精度可控电动平台精确 走位，应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成， 通过分析图像信息来获取心肌细胞保护作用的相关指标，用于外源物(药材以及复方)的 心肌保护作用的筛选和评价；具体通过以下步骤实现1.本发明筛选和评价系统所涉及的硬件系统由一台荧光倒置显微镜及电脑构成， 其中荧光倒置显微镜部件包括A.荧光倒置显微镜主体，B.高精度可控电动平台，C.平台控 制器，通过接线与A相连，D.电荷耦合器(CXD)，通过接口 C-moimt与显微镜相连，其获取的 图像信息则进一步经由IEEE1394连接卡上传至电脑储存(IEEE1394连接卡购自于Leica 公司，用户自己买)，E.汞灯，F.汞灯控制器，通过接线与显微镜相连，用于控制荧光发光调 节，G.粗调节螺旋，H.手动操纵杆，通过接线与A相连。软件系统主要包括高精度可控电 动平台控制与图像采集控制系统，图像拼接系统，图像识别系统。2.罗丹明123(Rhodamine123)染色特异性标记线粒体膜电位罗丹明123 (Rhodamine 123)是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线 粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光 强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引 起线粒体跨膜电位(ΔΨπι)的降低，罗丹明123重新释放出线粒体，从而发出强绿色荧光， 可用荧光显微镜、荧光光度计或流式细胞仪检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电 位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。准确称取罗丹明1235mg溶于ImL 二甲基亚砜(DMS0，Merck公司)中配成5mg/mL 储备液，分装于0. 6mL离心管中，置于-20°C避光储存，临用前，用PBS稀释储备液500倍待 用。(I)Rhodamine 123最佳浓度的确立在96孔板中接种H9C2大鼠心肌细胞，5000个/孔，只种96孔板中间60孔，置于 细胞培养箱中过夜使细胞贴壁完全。第二天，在暗室中，弃去每孔中培养液，加入IOOyL/ 孔含系列浓度梯度罗丹明123的PBS，置于室温(25°C )孵育15min，接着用100 μ L/孔PBS 漂洗两遍，吸干，在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。荧光拍摄参数为绿色荧光滤光 片(激发光460-500nm、发射光512-542nm)，曝光时间1000ms，物镜放大倍数2. 5倍。每孔 拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，选择最 佳FDA染色浓度，罗丹明123浓度梯度为2. 5，5，10，15以及20 μ g/mL,每个浓度6复孔。(2)罗丹明123荧光染色损伤模型的建立a.最佳损伤时间的选择H9C2细胞种于96孔板内60孔，5000个/孔，37°C孵育24h使其贴壁。24h后洗 去上清液，并用PBS洗涤一遍，分别加入100、200、400、600 μ mol/L的H2O2孵育15、30、90以 及120min。孵育以及细胞染色条件同(1)。扫描所得图像经过荧光图像拼接、识别软件处 理并进行统计。通过绘制相对荧光强度的时效曲线确定最佳损伤时间。b.最佳损伤浓度的选择H9C2细胞种于96孔板内60孔，5000个/孔，37°C孵育24h使其贴壁。
24h后洗去上清液，并用PBS洗涤一遍，分别加入100、200、300、400以及 50(^!1101/1的!1202孵育301^11。孵育以及细胞染色条件同(1)。扫描所得图像经过荧光图 像拼接、识别软件处理并进行统计。通过绘制相对荧光强度的量效曲线确定最佳损伤浓度。 该最佳浓度即作为心肌细胞损伤模型应用于心肌保护物质筛选。2.筛选系统应用于阳性化合物Vitamin C的心肌保护作用评价接种H9C2细胞于96孔板上，5000个/孔，24h让其贴壁充分，用已知的心肌保护 化合物VitaminC为阳性损伤对照，分别取9. 375、18. 75,37. 5,75,112. 5以及150ymol/L, 并取0. 5% DMSO(ν/ν)作为阴性对照，每个浓度6复孔，每孔加入100 μ L培养液，细胞培养 箱中孵育12h，接着弃去每孔中培养液，并用PBS洗涤一遍加入含300 μ mol/L H2O2的培养 液孵育30min。之后弃去上清液，每孔加入罗丹明123的PBS溶液，避光室温孵育15min，孵 育以及细胞染色条件同(1)。扫描所得图像经过荧光图像拼接、识别软件处理并进行统计。 通过公式计算保护率并绘制保护率对浓度的量效曲线并计算Vitamin C的IC50值。计算
公式为
权利要求
一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，其特征是通过控制荧光倒置显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取心肌细胞保护作用的相关指标筛选和评价活性组分，具体通过以下步骤实现(1)建立筛选模型接种H9C2细胞于48孔板或96孔板，使其贴壁后以H2O2孵育，H2O2孵育时间为15、30、90以及120分钟，使用荧光染料标记细胞后读取荧光图像，荧光拍摄参数为绿色荧光滤光片或者红色荧光滤光片，扫描所得图像经过荧光图像拼接、识别软件处理并进行统计，通过绘制相对荧光强度的时效曲线确定最佳损伤时间，通过绘制相对荧光强度的量效曲线确定最佳损伤浓度，该最佳浓度即作为心肌细胞损伤模型，最佳染色浓度为10μg/mL；(2)筛选和评价接种H9C2细胞于96孔板，贴壁后加药保护一定时间，用(1)所述的筛选模型进行损伤并检测荧光强度，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计，计算公式为其中Fm为模型组即损伤组的荧光强度，f为加药保护组的荧光强度，Fc为正常未处理组的荧光强度；在筛选中设定正常细胞组、阳性对照组及溶剂对照组，通过计算保护率为正即判断具有保护作用，超过50％即判断具有较强的保护作用。FSA00000294414100011.tif
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，其特征在 于，步骤(1)所述标记细胞的荧光染料为线粒体膜电位探针Rhodamine123。
3.根据权利要求1所述的一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，其特征 在于，步骤(1)所述荧光拍摄选用Rhodamine123拍摄，参数为绿色荧光滤光片，激发光 460-500nm、发射光 512_542nm。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，其 特征在于，所述活性组分为黄芪、丹参、三七、降香药材中的心肌保护活性组分。
5.根据权利要求1所述的一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法在定量筛 选评价心血管疾病治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种基于细胞荧光图像的药物活性组分筛选方法，通过控制荧光倒置显微镜上的高精度可控电动平台精确走位，应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取心肌细胞保护作用的相关指标筛选和评价活性组分。本发明能够在活细胞内通过标记线粒体荧光强度来测量心肌细胞的活力状态从而对活性物质的保护效果进行评估，并能够对细胞的形态结构和分布进行实时监测，具有快速、经济、高通量的特征，可在定量筛选评价心血管疾病治疗药物中的应用。
文档编号G01N21/64GK101982775SQ201010500640
公开日2011年3月2日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者王毅, 程翼宇, 赵筱萍 申请人:浙江大学