专利名称：用于鉴别和计数表达特定标志物的颗粒的多频阻抗方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗设备、医疗诊断及颗粒计数的领域，及更特别地涉及一种用于鉴另Ij (discriminating)、鉴定(identifying)和计数不同颗粒的方法和装置，所述颗粒包括细菌、病毒、非生物颗粒和细胞。一个实例可为例如表达特定标志物的血细胞，例如用于鉴另IJ、鉴定和计数人类血液中的⑶4+ T淋巴细胞。另一个实例可为表达不同表面标志物的细菌或病毒。另一个实例可为带有表面标志物的的固体颗粒，所述标志物可以是抗体，或DNA 或肽的片段。
背景技术：
微流体系统已在研究细胞功能、细胞和组织工程学、疾病诊断、血液样品制备和药物发现中显示出独特的前景。最近微流体用于从全血中分离纯的白细胞群或白细胞亚群的用途已吸引了许多对于即时诊断的兴趣。作为实例，免疫缺陷疾病(主要是HIV)的诊断用血液分析进行。测定血液中辅助性 T淋巴细胞的浓度对于检测HIV感染的进程是很重要的。因此重要的是检测⑶4+和⑶8+T 淋巴细胞的存在和对其计数。根据WHO的指导方针，血液中CD4+T细胞计数少于200细胞 /μ 确定为AIDS阳性诊断，并且在多数情况下被用作需要应用抗病毒治疗的指示。在CD4+ 计数降至200细胞/μ 以下之前开始抗病毒治疗，例如从350细胞/μ 的阈值开始，是被推荐的，并且⑶4+计数500细胞/μ 的阈值被广泛用于增加患者临床监控的频率。用以荧光为基础的流式细胞术(FACS)定量⑶4+Τ淋巴细胞的水平是目前的金标准。以荧光为基础的流式细胞术复杂并且设备昂贵，因此尚未进入资源匮乏的地区，如撒哈拉以南非洲。对便于使用的即时的CD4+T细胞计数系统存在需求，例如对用于发展中世界。阻抗频谱法(IS)已被广泛用于测量细胞的电介质性质，提供膜电容、膜电阻、细胞质传导率和介电常数的值。其也可被认为是“无标记”的分析方法。通常细胞以悬液形式被测量，并且所述数据代表了种群的平均值。单个细胞的电性质最初的高速测量由Coulter 于20世纪50年代进行的。显示的是使用用单一低频(或DC)电信号进行的电体积测量法单独的血细胞可被计数和鉴别。在20世纪70年代Hoffman和Britt发展了用于单个细胞的同时的低和高频阻抗分析的宏观系统，使用微型的具有放置于流体通道中的电极的流通池。X. Cheng 等人 在"Cell detection and counting through cell lysate impedance spectroscopy in microfluidic devices，，Lab Chip, 2007，7，746-755 中描述了计数细胞的电方法，所述方法以测量从微流体通道内表面被固定的细胞释放的离子引起的周围介质传导率的变化为基础。被固定的细胞用低传导率、低渗的介质裂解，导致的阻抗变化用表面加工(patterned)的电极测量以检测和定量细胞数。如上描述的细胞裂解的方法对于检测20细胞μΓ1是足够灵敏的，并提供了简单有效的方法在很多应用中用于检测和列举在微流体装置中的细胞，包括在资源有限的地区HIV患者的CD4细胞计数的测量。
阻抗频谱法通常在大的细胞群上进行，所述细胞通常是混合型的。在其他细胞的悬液中的CD4+细胞的分析因此不可能使用该方法。CD4+细胞可被固定在基质上并通过显微镜计数，但其不是很可靠。虽然细胞分离方法背后的原理可容易地适于临床应用的宽谱，但是检测这些分离的细胞仍旧是需要解决的技术挑战。
发明内容
本发明的实施方案的目的是提供好的用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的方法和装置，所述颗粒例如细菌、病毒、非生物颗粒或细胞，例如血细胞。根据本发明的实施方案的好的方法和装置是精确的，因为鉴定的表达特定标志物的颗粒的数量可被精确地测定。另外根据本发明的实施方案的好的方法和装置也可被用在资源匮乏的地区而不在那里受限制。应用的其他范围包括用于普通分析和鉴定表达不同标志物的不同细胞的PoC装置。上述目的通过根据本发明的方法和装置来完成。本发明提供了一种通常的方法和装置，用于鉴别、鉴定和计数表达特定标志物的颗粒，在具体的实施方案中是血细胞，所述标志物例如是特定的抗原标志物。这通过使用阻抗标记联合复频(两个或更多频率)阻抗细胞计数来获得，任选地用于疾病的诊断。在第一方面，本发明提供用于鉴定和计数表达特定标志物或其他抗体的颗粒的分析方法，所述颗粒例如细菌、病毒、非生物颗粒或细胞，例如血细胞。仅作为实例，所述方法可被用于鉴定和计数血液中的CD4+T淋巴细胞，所述方法包括
获得悬液中的颗粒样品，例如包含血细胞的血液，
用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，例如血细胞，和
使用复频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。根据本发明的实施方案的方法的优势是允许快速、廉价并简单的分析，例如全血细胞分析(全血计数)可在几分钟内进行。根据本发明的实施方案的方法可被常规地用于临床实践。仅有限量的样品，例如血液，是需要的，因为所述分析在单独的颗粒(或单独的颗粒 /标记物复合物)上而不是在大量的颗粒群上进行。为取得计数事物的预先确定的数量，特定的样品量，例如血液，必须被使用。根据本发明的实施方案的方法不改变样品滴中颗粒的数量，例如血液滴中的细胞数。但是，本领域系统的情况使用在細1管中的静脉穿刺血，因为其被用于大的中心实验室，并且所述細1管是样品如何被送到实验室的。根据本发明的实施方案，所述方法可被用于微流体装置中，所述微流体形式允许整合样品制备，其又能够即时使用，因此允许立即使用样品无需将其储存。刺破指尖取的血中包含足够的细胞使计数有统计意义的事实允许使用仅刺破指尖取血而不是細1管。在根据本发明的实施方案的分析方法中标记表达特定标记物的颗粒可在微流体系统中进行。在具体的实施方案中，所述方法可被用于例如微流体系统中的血液细胞。所述细胞仅需要被加入到微流体系统中，裂解和标记可被顺序地完成。在根据本发明的实施方案的分析方法中，测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒的步骤可包括使所述被标记的样品分离为包含单个颗粒的液滴，至少在第一频率和第二频率可选地在多于两个频率测定所述单个颗粒的阻抗，所述第一频率低于第二频率，将在第一较低频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度被定义为第二较高频率阻抗与第一较低频率阻抗的比值，以及从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。在根据本发明的实施方案的分析方法中，标记样品可包括使所述样品与用针对所述特定标志物的抗体包被的珠子温育。根据本发明的实施方案的方法可进一步包括在测量被标记的样品之前进行裂解步骤。这样的裂解步骤允许更容易地鉴别表达特定标志物的细胞。特别有优势的是裂解步骤可在微流体装置中进行。在所述样品是血液的情况下，所述裂解步骤可包括红细胞裂解步骤。这样的红细胞裂解步骤可包括使所述血液样品暴露于皂苷的有机酸溶液。在本发明的实施方案中，测量所述被标记的样品可在样品流中进行，例如在微流体装置中。在第二个方面，本发明提供根据本发明的实施方案的方法用于鉴定和计数样品中的颗粒的用途。在第二个方面的具体实施方案中，本发明提供根据本发明的实施方案的方法用于检测和计数CD4+T淋巴细胞的用途。这样的计数是有优势的，因为其帮助诊断HIV。 在本发明的实施方案中单独的CD4+细胞的数量是从单个细胞的阻抗信号中估计出的。在第三个方面，本发明提供用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的装置，所述装置包含用于包含样品流的微通道(所述样品流，例如悬液中的颗粒，包含表达特定标志物的被标记的颗粒)；至少一对电极，电子电路，例如函数发生器(function generator)，用于将至少在第一频率的第一 AC信号和至少在第二频率的第二 AC信号应用至所述至少一对电极，所述第一频率低于第二频率；及计算单元，用于测定所述电极对之间存在的颗粒的阻抗，所述计算单元被配置为适于测定至少在第一较低频率和第二较高频率的所述颗粒的阻抗，适于将在所述第一较低频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度被定义为所述第二较高频率阻抗与所述第一较低频率阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。根据本发明的实施方案的这样的装置与现有技术不同，现有技术中表达特定标志物的颗粒，例如血细胞，是被固定在固定的基质上的，因此微通道不包括样品流。根据本发明的实施方案的装置可另外包含被配置为适于发挥参考电极的功能的第二对电极。根据本发明的实施方案的装置可另外包含放大器电路，被配置为适于对在电极对中的一对之间存在的颗粒进行微分测量。这样，提供了微流体单个细胞阻抗细胞计数器，能够进行微分计数，例如在所述样品是血液样品的情况下，对白细胞微分计数。在根据本发明的实施方案的装置中，微通道可被配置为适于接收悬液中的颗粒流并适于将所述悬液中的颗粒流导向所述至少一对电极之间，以鉴定和计数在悬液中的颗粒流中那些表达特定标志物的颗粒。在根据本发明的实施方案的装置中，所述低频测量能力可被扩展以便允许通过修改用于标记颗粒的功能化珠子的阻抗性质检测存在于样品中的生物颗粒，例如DNA、病毒、 蛋白质等。根据本发明的实施方案，微流体装置可被缩小规模到允许检测生物颗粒，例如 DNA、病毒、蛋白质等，与功能化的纳米尺度的珠子的结合。
本发明的实施方案的优势是其可被用于CD4+ T淋巴细胞的计数。本发明的实施方案的优势是其便于操作、快速、精确并且廉价。本发明特别并优选的方面在所附的独立和从属权利要求中陈述。从属权利要求中的特征可与独立权利要求的特征和其他从属权利要求的特征组合，其为恰当的并不仅仅在权利要求中明确陈述。参考下文中描述的实施方案，本发明的以上及其他方面将是显而易见的并被说明。
图1为根据本发明的实施方案的微阻抗细胞计数器系统的示意图，实现双频阻抗测量。图2 (a)为根据本发明的实施方案的阻抗检测系统的简化的示意图，其显示了微分检测系统。左侧的电极对说明电极之间没有细胞的等效电路模型(ECM)，右侧的电极对在电极之间有细胞存在。图2 (b)说明了聚合体珠子和近似大小的细胞之间的典型的频率依赖性阻抗幅度信号的对比。图3提供了实验数据，显示对于(a) 5. 62Mm直径的乳胶珠子和(b) MACS纯化的T 淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞群，阻抗幅度(magnitude of the impedance)相对于频率。每一个点包含约1500个事件并显示测量数据的均值和标准差。虚线显示PSpice电路模拟，将用于含有细胞(或珠子)的检测区域的等效电路模型与微分的放大电子技术结合。图4 (a)是散点图，显示了对于T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和5. 62Mm直径的乳胶珠子群的混合物，不透明度(|z| i 1707 kHz / Z i 503 kHz)相对于低频(503 kHz)阻抗幅度的绘图。图4 (b)显示低频阻抗幅度的柱状图。图4 (C)显示不透明度的柱状图。图4 (d)说明相同样品的FACS分析，显示了细胞(无珠子)的前和侧散射性质。图5 (a)到(c)是FACS散点图，显示了荧光标记(抗-CD14-FITC和抗-CD16-AleXa700)的皂苷/甲酸处理的全血的荧光和前光散射性质。所有事件在FSC信号上触发， 细胞群根据其荧光信号被鉴定。图5 (d)到(f)为(相同样品的)散点图，显示荧光和如用微阻抗细胞计数器测量的低频(503 kHz)阻抗幅度性质。数据显示两个系统都可清晰地分辨(resolve)嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三个细胞群。图6(a)为散点图，显示对于皂苷/甲酸处理的全血和7. ISMm直径的乳胶珠子群， 不透明度(|Z @ 1707 kHz / Z @ 503 kHz)相对于低频(503 kHz)阻抗幅度。图6 (b)显示低频阻抗幅度的柱状图。单独群的数据符合正态分布(灰色曲线)。图6 (C)显示了不透明度的柱状图。单独群的数据符合正态分布(灰色曲线)。图6 (d)是相同样品的FACS分析，显示了细胞(无珠子)的前和侧散射性质。图7说明用皂苷/甲酸裂解溶液处理后的白细胞的典型微分散点图。图中的椭圆说明二维高斯概率分布和相应的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群是从这些概率分布中获得的。在此微分散点图中的数据如图8中被分析。
图8说明作为从参考全血分析器中获得的测量的函数的相应WBC分布的相关性。 从根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器和参考装置中获得的结果间的协方差因素在图例中说明。对一个样品，相同的实验重复5次，每次准备新的裂解产物和完全干净的芯片。图9显示⑶4+群如何由于用抗体包被的珠子标记来鉴定。淋巴细胞和单核细胞在阻抗图上被清晰地鉴别。图10和图11显示了来自实验数据的实例。图10显示了标记前的淋巴细胞和嗜中性粒细胞的图。图11显示了用CD4抗体功能化的珠子标记后的血细胞图。图12为裂解的全血和与⑶4珠子温浴的裂解的全血的FACS散点图。椭圆显示了带有附着的乳胶珠子的CD4+T淋巴细胞群的位置。图13显示了来自裂解的全血样品的FACS数据，所述全血用荧光抗体(抗⑶4和 ⑶14)标记并与⑶4珠子温浴。图14 为不透明度(|Z i 10007 kHz / Z i 503 kHz)对低频幅度(503 kHz)的 IS散点图，显示了不同的群。图15显示根据本发明的实施方案的阻抗微细胞计数器的校准数据。附图仅为示意而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的大小可被夸大或未按照比例绘制。权利要求中的任何参考标记不应作限制所述范围解释。在不同的附图中，相同的参考标记涉及相同的或类似的元件。
具体实施方案在一方面，本发明提供廉价的简单阻抗流式细胞计数分析方法结合阻抗标记的应用以鉴定和计数表达特定标志物的细胞，例如血细胞，例如以鉴定和计数人类血液中⑶4+T 淋巴细胞。下文中将给出鉴定和计数血液中CD4+T淋巴细胞的具体实施方案的详细描述；但是本发明不局限于此而包括了通常的颗粒鉴定、鉴别和计数，所述颗粒可包括(非穷尽的列出)细菌、病毒、非生物颗粒、细胞、解离的组织、病毒附着的纳米珠子。通常地血液和具体地人类血液，包含血细胞，其可归入以下三类中的任意一类用于运输氧气到身体组织的红细胞(red blood cells或erythrocytes)，用于产生抗体以防护机体对抗感染和外源材料的白细胞(white blood cells或leukocytes)，用于血液凝结的血小板或凝血细胞。所述三类血细胞悬浮在血浆中。血浆中有90%的水，血浆组成约55% 的血液体积并包含多种蛋白(例如白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白和其他凝结蛋白)。存在5种不同且多样的白细胞类型嗜中性粒细胞(40-75%的白细胞)、嗜酸性粒细胞(0-7%的白细胞)、嗜碱性粒细胞(0-1%的白细胞)(这三类被归到粒细胞名下)、淋巴细胞(20-45%的白细胞)和单核细胞(3-11%的白细胞)。血液中白细胞的数量通常是疾病的指示。通常在一升血液中有4xl09到1. IxlO10白细胞。淋巴细胞包括自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞和B细胞。T细胞和B细胞的功能是在被称为抗原呈递的过程中识别特异性的“非自身”抗原(细菌中的抗原)。一旦T细胞和 B细胞鉴别了入侵者，其产生特异性的反应，被调整以最大程度地消除特异性病原体们或病原体感染的细胞。当B细胞中和外源目标如细菌和病毒时，B细胞通过产生大量抗体对病原体产生应答。应答病原时一些称为辅助T细胞的T细胞产生引导免疫应答的细胞因子， 同时其他称为细胞毒性T细胞的T细胞产生引起病原体感染的细胞死亡的毒性颗粒。分化簇，也称为指定簇，并通常缩写作⑶，是用于鉴定和研究白细胞上存在的细胞表面分子的方法。约有250种不同的CD蛋白质。所述CD系统通常用作细胞标志物，允许根据其表面上存在的什么分子来鉴定细胞。这些标志物通常被用于将细胞和特定的免疫功能关联。使用不同的方法包括流式细胞术，CD分子被用于细胞分类中。细胞群通常使用 “ + ”(阳性)或“_”(阴性)符号来定义以指示某些细胞部分是否表达或缺乏⑶分子。两种通常使用的CD分子是CD4和CD8，其通常分别用作辅助和细胞毒性T细胞的标志物。人类免疫缺陷病毒(HIV)结合辅助T细胞表面上的CD4和趋化因子受体以获得进入。血液中CD4 和⑶8 T细胞的数量通常用于监控HIV感染的进程。HIV感染导致拥有⑶4受体的T细胞数量逐渐减少。因此，医疗人员参考⑶4的量以决定何时开始HIV感染患者的治疗。CD4测试测量在其表面表达CD4受体的T细胞的数量。正常的血液值是大于1X109/L。结果通常以每微升血液的细胞数表达。当⑶4量达到低值，约200-350细胞每微升时，患者通常进行治疗。流式细胞术是用于研究，例如计数、分类和检查显微颗粒(例如细胞，悬浮在流体流中)的化学和/或物理性质的技术。本发明的实施方案利用流式细胞术进行阻抗频谱。图1显示了根据本发明的实施方案的单细胞分析系统10的图表。提供了微流体装置11，包含微通道12，细胞13通过其中流动，所述细胞被悬浮在悬浮的流体中。这与现有技术分析系统不同，现有技术中细胞被固定在固定的基质上用于计数。第一对微电极14 被制作于通道12中，并且这些与小的信号AC电压相连，所述小的信号AC电压由函数发生器15产生。该施加的电压和所述测量的流经微电极14之间的微通道12的电流的比值被用于测定通过微电极14之间的单细胞13的电阻抗。如图1和图2所示，两对电极14、16被用于定义两个相近位置的检测体积，并都与相同的函数发生器15相连接，因此接收相同的AC电压，以便在单独的细胞13上进行差异测量。所述第一对电极14测量了来自所述细胞13的电信号，同时所述第二对电极16作为参考并测量来自所述含有悬浮流体但无细胞13存在的微通道12的信号。所述电信号可使用定制的电子学仪器测量。这种双重测量方法显著降低测量噪音和漂移，所述噪音和漂移可由悬浮流体的温度或组成变化引起。在使用中，使用注射泵(未图释)，将在悬液中的细胞13泵抽通过微流体装置11的微流体通道12，以预先设定的速度，例如约每秒100个细胞13的速度进行。当细胞13通过通道12时，它们扰乱检测体积的电场，因此随后产生正信号(当细胞13通过第一对电极14 时)和负信号(当细胞13通过第二对电极16时);这些信号被加工以提供阻抗。在测量的信号的两个峰值(正和负)之间的时间相当于细胞13在述电极14、16之间的通过时间。根据本发明的实施方案，高速阻抗分析在两个同时发生的频率上进行并且从系统10中获得的数据使用在分析装置18上运行的分析软件分析。分析装置18可包含计算单元，用于测定电极对之间存在的血细胞的阻抗，计算单元被配置为适于测定在第一频率和第二频率的血细胞的阻抗，适于将在第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为高频阻抗与低频阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的血细胞。在悬液中的细胞13的电介质性质用麦克斯韦混合物理论描述，其特征为异质系统的等效复介电常数与单独颗粒和悬浮介质的性质之间的关系。对于介质中的球形颗粒(例如细胞13)的悬液，混合物的等效复介电常数ε mix通过下式给出
权利要求
1.一种用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的分析方法，所述方法包括 获得包含颗粒的样品，用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，使用复频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中标记表达特定标志物的颗粒在微流体系统内进行。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒的步骤包括使所述被标记的样品分离为包含单个颗粒的液滴，测定至少在第一频率和第二频率的所述单个颗粒的阻抗，所述第一频率低于第二频率，将在所述第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为所述第二频率阻抗与所述第一频率阻抗的比值，从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中标记样品包括使所述样品与用针对所述特定标志物的抗体包被的珠子温育。
5.根据权利要求1所述的方法，其另外包括在测量所述被标记的样品之前进行裂解步马聚ο
6.根据权利要求5所述的方法，所述样品为血液样品，其中进行裂解步骤是进行红细胞裂解步骤，其包括使所述血液样品暴露于皂苷的有机酸溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述被标记的样品在样品流中进行。
8.根据权利要求1所述的方法用于鉴定和计数⑶4+T-淋巴细胞的用途。
9.一种用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的装置，其包含用于包含样品流的微通道，所述样品流包含表达特定标志物的被标记的颗粒， 至少一对电极，电子电路，用于将至少在第一频率的第一 AC信号和至少在第二频率的第二 AC信号施加至所述至少一对电极，所述第一频率低于第二频率，计算单元，用于测定所述电极对之间存在的颗粒的阻抗，所述计算单元被配置为适于测定至少在第一频率和第二频率的所述单个颗粒的阻抗，适于将在所述第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为所述第二频率阻抗与所述第一频率阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
10.根据权利要求9所述的装置，其另外包含第二对电极，被配置为适于发挥参考电极的功能。
11.根据权利要求10所述的装置，其另外包含放大电路，被配置为适于对在电极对中的一对之间存在的颗粒进行差异测量。
12.根据权利要求9所述的装置，其中所述微通道被配置为适于接收悬液中的颗粒流并将所述悬液中的颗粒流导向所述至少一对电极之间，以鉴定和计数在悬液中的颗粒流中表达特定标志物的颗粒。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的阻抗标记在微流体装置中进行。
全文摘要
提供了一种鉴定和计数表达特定抗原标志物的颗粒的分析方法。一个实例(但不唯一)是血液中CD4+T淋巴细胞分析。所述方法包括获得悬液形式的包含颗粒的样品，用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，以及使用双频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。所述方法允许精确计数颗粒，例如血流中的CD4+T淋巴细胞的数量。也提供了相应的装置。
文档编号G01N33/50GK102460114SQ201080034516
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月5日
发明者霍尔姆斯 D., 摩根 H. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司