专利名称：一种井型神经芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属于神经体外电生理测量设备技术领域，具体涉及一种井型神经芯片及其制备方法。
背景技术：
神经芯片是指可以在神经细胞、组织或者系统水平多通道、实时地检测神经电生理信号或神经递质的微型装置总称，最早平面神经芯片是1972由Thomas等人报道的，用于记录体外培养心肌细胞的电活动。但是这种神经芯片面临一个问题体外培养的神经细胞会随机的粘附在基底上， 并非准确定位在电极上，造成大部分细胞与电极的贴附性较差或有距离，因此电刺激和电信号检测有可能发生在不同细胞的不同部位上。由于细胞外电极记录电信号对细胞与电极的空间位置关系非常敏感，导致获得的电信号幅值往往偏小(特别是对早期发育阶段的神经网络进行记录)，形状也较复杂，故不利于电信号的软件分选以及确定对应的神经细胞。 因此，如果能提供一种方法将细胞定位在记录电极上，将大大增强芯片的检测性能并扩大其适用范围。目前常见控制细胞定位的方法主要有两种。一种方法是通过化学修饰方法， 利用细胞在不同材料上的贴附性差异，实现细胞定位。第二种方法是通过微加工方法制作微型的凹坑、凹槽等结构。本发明旨在利用微加工的方法制作一种井型神经芯片，通过在电极上方制备神经井的方式来增强神经芯片的检测性能，其中其井壁可以允许神经突起通过的同时保证胞体位于电极上方。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以满足电极与神经细胞之间一对一的关联、研究小型神经网络电生理活动的神经芯片。本发明的目的还在于提供上述神经芯片的制备方法。—种井型神经芯片，该神经芯片由芯片单元和培养腔组成；芯片单元由基底、金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径在IOym 50μπι之间，微电极阵列为点阵，微电极数量为4 1 个，微电极与微电极之间的间距为100 μ m 500 μ m，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SiO2和Si3N4 的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径在Iym 5μπι之间。培养腔与芯片单元间的连接方式为无缝连接。一种井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行(1)选择SiA玻璃为基底，在玻璃上溅射一层1000Α ~5000人的金膜，利用 lift-off技术形成电极与引线结构；(2)在步骤⑴形成的基底上，使用等离子体增强化学气相沉积法形成SiO2-Si3N4-SiO2三明治型的绝缘层，自下而上为3000A -5000A厚的SW2层、 3000A ~5000人厚的 SiN4 层和500A ~2000人厚的 SiO2 层；(3)在电极的位置，对三明治型的绝缘层施加反应离子刻蚀，露出电极；(4)将露出的电极通过电镀法电镀钼黑；( 在步骤(4)基础上，在基底材料上旋涂光刻胶SU-8 2050，然后在每个电极上方刻蚀出一个直径为50 μ m 150 μ m、高为30 μ m 70 μ m的SU-8圆柱形空腔；(6)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，使聚二甲基硅氧烷液面高出SU-8 2050上表面 200 μ m-1000 μ m,然后在60°C中固化2 3个小时；将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-8 2050，在电极上方形成直径为50 μ m 150 μ m、高为30 μ m 70 μ m的圆柱状突起的聚二甲基硅氧烷模具；(7)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；然后将其注射入步骤(6)形成的聚二甲基硅氧烷模具中；将其植入-196°C -80°C的环境下预冻12小时以上；然后将其冷冻干燥，形成多孔壳聚糖井型墙壁；(8)除去聚二甲基硅氧烷模具，形成由多孔壳聚糖墙壁组成的井型结构；(9)将步骤⑶所得的材料，在0. IM的NaOH溶液中浸泡2_7小时，然后将其浸泡在质量浓度为 2%硼氢化钠溶液中6小时，二次冷冻干燥，制成芯片单元；(10)将无底的玻璃培养腔，使用硅酮树脂将其与芯片单元无缝粘连。本发明的有益效果本发明的优点在于神经井结构可以束缚神经元胞体，其神经井墙壁的壳聚糖网状结构可以允许神经突起通过，但神经细胞不可通过，可用于神经细胞定位电生理测量。实现了电极与神经细胞之间一对一的关联，可以为体外培养的小型神经网络研究提供一个有利的工具。
图1为井型神经芯片电极区域的剖面图；图中，IOl-SiA基底玻璃、102-金电极与金引线、103-Si02/Si3N4/Si&三明治结构的绝缘层、104-钼黑、105-神经井多孔壳聚糖墙壁。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例所使用的醋酸、戊二醛、氢氧化钠、硼氢化钠、二甲基硅氧烷均为分析纯；壳聚糖的脱乙酰度分子量大于85%，分子量约为20万；其余材料均为商业化产品。实施例1本实施例的井型神经芯片，由芯片单元和一无底的培养腔组成(如图1所示)。 芯片单元由基底、金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径为50 μ m，微电极阵列为点阵，微电极数量为16个，微电极与微电极之间的间距为500μπι，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SW2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径为5口111。该井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行1)制备微电极阵列器件的芯片单元(1)所用SW2基底清洗干净；(2)溅射金属层，金属为Au，厚度为2000 A;(3)用第一块掩模板光刻4X4矩阵测量电极测量点阵，引线，并进行刻蚀；其中共有16个微电极，微电极直径为50 μ m,电极间距为500 μ m ；(4)应用等离子增强化学汽相沉积绝缘层，此层结构为SiO2 (5000 Λ) -Si3N4 (5000 A) -SiO2 (1000 A)；(5)用第二块掩模板光刻测量电极，使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；(6)应用恒流法、在超声环境中电镀钼黑；(7)划片并去胶清洗；(8)旋涂光刻胶SU-8 2050，用第三块掩模板光刻井型结构，并进行刻蚀，形成直径为100 μ m，高为50 μ m的SU-8圆柱形空腔；(9)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，然后在60°c中固化2 3个小时；(10)将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-82050 ；(11)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；将壳聚糖溶液注射入带有井型聚二甲基硅氧烷模具中，将其植入-196°C的环境下预冻，然后将其冷冻干燥；(12)除去聚二甲基硅氧烷模具；(13)将所得的材料，在用0. IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量为 2%硼氢化钠中6小时，二次冷冻干燥。2)培养腔体的粘连利用硅酮树脂将玻璃材料的无底培养腔与芯片单元无缝连接，保证电极与神经井在腔内。实施例2本实施例的井型神经芯片，由芯片单元和一无底的培养腔组成。芯片单元由基底、 金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径为30 μ m,微电极阵列为点阵，微电极数量为32个，微电极与微电极之间的间距为300 μ m，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SiO2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径为3 μ m。该井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行1)制备微电极阵列器件的芯片单元(1)所用SW2基底清洗干净；(2)溅射金属层，金属为Au，厚度为2000 A;(3)用第一块掩模板光刻4X8矩阵测量电极测量点阵，引线，并进行刻蚀，其中共有32个电极，电极直径为30 μ m,电极间距为300 μ m,；
(4)应用等离子增强化学汽相沉积绝缘层，此层结构为SiO2 (5000 Λ) -Si3N4 (5000 A) -SiO2 (1000 A)；(5)用第二块掩模板光刻测量电极，使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；(6)应用恒流法、在超声环境中电镀钼黑；(7)划片并去胶清洗；(8)旋涂光刻胶SU-8 2050，用第三块掩模板光刻井型结构，并进行刻蚀，形成直径为50 μ m，高为70 μ m的SU-8圆柱形空腔；(9)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，然后在60°c中固化2 3个小时；(10)将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-82050 ；(11)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；将壳聚糖溶液注射入带有井型聚二甲基硅氧烷模具中，将其植入-196°C的环境下预冻，然后将其冷冻干燥；(12)除去聚二甲基硅氧烷模具；(13)将所得的材料，在用0. IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量浓度为为 2%硼氢化钠中6小时，二次冷冻干燥。2)培养腔体的粘连利用硅酮树脂将玻璃材料的无底培养腔与芯片单元无缝连接，保证电极与神经井在腔内。实施例3本实施例的井型神经芯片，由芯片单元和一无底的培养腔组成。芯片单元由基底、 金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径为30 μ m，微电极阵列为点阵，微电极数量为19个，微电极与微电极之间的间距为200 μ m，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SiO2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径为4 μ m。该井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行1)制备微电极阵列器件的芯片单元(1)所用SW2基底清洗干净；(2)溅射金属层，金属为Au，厚度为1000 A;(3)用第一块掩模板光刻六边形测量电极点阵，引线，并进行刻蚀。其中共有19个电极，电极直径为30 μ m,电极间距为200 μ m ；(4)应用等离子增强化学汽相沉积绝缘层，此层结构为SiO2 (4000 Λ) -Si3N4 (4000 A) -SiO2 (2000 A)；(5)用第二块掩模板光刻测量电极，使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；(6)应用恒流法、在超声环境中电镀钼黑；(7)划片并去胶清洗；(8)旋涂光刻胶SU-8 2050，用第三块掩模板光刻井型结构，并进行刻蚀，形成直径为150 μ m高约为30 μ m的SU-8圆柱形空腔；
(9)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，然后在60°c中固化2 3个小时；(10)将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-82050 ；(11)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；将壳聚糖溶液注射入带有井型聚二甲基硅氧烷模具中，将其植入-120°C的环境下预冻，12小时以上；然后将其冷冻干燥；(12)除去聚二甲基硅氧烷模具；(13)将所得的材料，在用0. IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量浓度为为 2%硼氢化钠中6小时，二次冷冻干燥。2)培养腔体的粘连利用硅酮树脂将玻璃材料的无底培养腔与芯片单元无缝连接，保证电极与神经井在腔内。实施例4本实施例的井型神经芯片，由芯片单元和一无底的培养腔组成。芯片单元由基底、 金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径为 ο μ m,微电极阵列为点阵，微电极数量为64个，微电极与微电极之间的间距为100 μ m，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SiO2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径为2 μ m。该井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行1)制备微电极阵列器件的芯片单元(1)所用SW2基底清洗干净；(2)溅射金属层，金属为Au，厚度为2000 A;(3)用第一块掩模板光刻8X8矩阵测量电极测量点阵，引线，并进行刻蚀；其中共有64个电极，电极直径为10 μ m,电极间距为100 μ m ；(4)应用等离子增强化学汽相沉积绝缘层，此层结构为SiO2 (3000 Λ) -Si3N4 (3000 A) -SiO2 (2000 A)；(5)用第二块掩模板光刻测量电极，使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；(6)应用恒流法、在超声环境中电镀钼黑；(7)划片并去胶清洗；(8)旋涂光刻胶SU-8 2050，用第三块掩模板光刻井型结构，并进行刻蚀，形成直径为150 μ m高约为70 μ m的SU-8圆柱形空腔；(9)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，然后在60°c中固化2 3个小时；(10)将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-82050 ；(11)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；将壳聚糖溶液注射入带有井型聚二甲基硅氧烷模具中，将其植入-150°C的环境下预冻，12小时以上，然后将其冷冻干燥；(12)除去聚二甲基硅氧烷模具；(13)将所得的材料，在用0. IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量浓度为 2%硼氢化钠中6小时，二次冷冻干燥。2)培养腔体的粘连利用硅酮树脂将玻璃材料的无底培养腔与芯片单元无缝连接，保证电极与神经井在腔内。实施例5本实施例的井型神经芯片，由芯片单元和一无底的培养腔组成。芯片单元由基底、 金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径为 ο μ m，微电极阵列为点阵，微电极数量为32个，微电极与微电极之间的间距为100 μ m，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为SiO2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径为3 μ m。该井型神经芯片的制备方法，按照如下步骤进行1)制备微电极阵列器件的芯片单元(1)所用SW2基底清洗干净；(2)溅射金属层，金属为Au，厚度为2000 A;(3)用第一块掩模板光刻4X4+4X4双矩阵测量电极点阵，引线，并进行刻蚀；其中共有32个电极，电极直径为10 μ m,同一个矩形点阵中电极间距为100 μ m,俩个矩阵中心距离为3000 μ m ；(4)应用等离子增强化学汽相沉积绝缘层，此层结构为SiO2 (5000 Λ) -Si3N4 (3000 A) -SiO2 (2000 A)；(5)用第二块掩模板光刻测量电极，使用湿法、干法交替刻蚀绝缘层；(6)应用恒流法、在超声环境中电镀钼黑；(7)划片并去胶清洗；(8)旋涂光刻胶SU-8 2050，用第三块掩模板光刻井型结构，并进行刻蚀，形成直径为50 μ m，高为30 μ m的SU-8圆柱形空腔；(9)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD 184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，然后在60°c中固化2 3个小时；(10)将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-82050 ；(11)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液；在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；将壳聚糖溶液注射入带有井型聚二甲基硅氧烷模具中，将其植入-196°C的环境下预冻，然后将其冷冻干燥。(12)除去聚二甲基硅氧烷模具；(13)将所得的材料，在用0. IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量浓度为为 2%硼氢化钠中6小时，二次冷冻干燥。2)培养腔体的粘连利用硅酮树脂将玻璃材料的无底培养腔与芯片单元无缝连接，保证电极与神经井在腔内。
权利要求
1.一种井型神经芯片，其特征在于，该神经芯片由芯片单元和培养腔组成；芯片单元由基底、金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成；基底为玻璃；金属引线为金；基底上有微电极阵列，微电极的直径在10 μ m 50 μ m之间，微电极阵列为点阵，微电极数量为4 1 个，微电极与微电极之间的间距为IOOym 500μπι，微电极表面进行钼黑处理，绝缘层为 SiO2和Si3N4的混合层；每一个神经井对应一个微电极；神经井的墙壁由壳聚糖多孔网络组成，孔隙率大于90%，孔径在Iym 5μπι之间。
2.根据权利要求1所述一种井型神经芯片，其特征在于，培养腔与芯片单元间的连接方式为无缝连接。
3.—种如权利要求1所述井型神经芯片的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行(1)选择SiO2玻璃为基底，在玻璃上溅射一层1000Α~5000Α的金膜，利用lift-off 技术形成电极与引线结构；(2)在步骤(1)形成的基底上，使用等离子体增强化学气相沉积法形成SiO2-Si3N4-S^2 三明治型的绝缘层，自下而上为3000A~5000A厚的SiO2层、3000A~5000A厚的3丨队层和500A ~2000人厚的SiO2层；(3)在电极的位置，对三明治型的绝缘层施加反应离子刻蚀，露出电极；(4)将露出的电极通过电镀法电镀钼黑；(5)在步骤(4)基础上，在基底材料上旋涂光刻胶SU-82050，然后在每个电极上方刻蚀出一个直径为50 μ m 150 μ m、高为30 μ m 70 μ m的SU-8圆柱形空腔；(6)在室温条件下将二甲基硅氧烷与SYGARD184有机硅弹性体按照质量比为 10 1的比例混合均勻，倒入上述样品中，使聚二甲基硅氧烷液面高出SU-8 2050上表面 200 μ m-1000 μ m,然后在60°C中固化2 3个小时；将上述样品放入等离子发生器中，利用氧等离子体氧化清除掉SU-8 2050，在电极上方形成直径为50 μ m 150 μ m、高为30 μ m 70 μ m的圆柱状突起的聚二甲基硅氧烷模具；(7)将壳聚糖溶于质量浓度为2%的醋酸溶液中，形成质量浓度为2%的壳聚糖溶液； 在其中加入质量浓度为0. 25%的戊二醛，搅拌交联；然后将其注射入步骤(6)形成的聚二甲基硅氧烷模具中；将其植入-196°C -80°C的环境下预冻12小时以上；然后将其冷冻干燥，形成多孔壳聚糖井型墙壁；(8)除去聚二甲基硅氧烷模具，形成由多孔壳聚糖墙壁组成的井型结构；(9)将步骤(8)所得的材料，在0.IM的NaOH溶液中浸泡2-7小时，然后将其浸泡在质量浓度为 2%硼氢化钠溶液中6小时，二次冷冻干燥，制成芯片单元；(10)将无底的玻璃培养腔，使用硅酮树脂将其与芯片单元无缝粘连。
全文摘要
本发明公开了属于神经体外电生理测量设备技术领域的一种井型神经芯片及其制备方法。该神经芯片由芯片单元和培养腔组成，芯片单元由基底、金属引线、微电极、绝缘层和神经井组成。该神经芯片的制备方法在基底上溅射形成金属引线层；使用等离子体增强化学气相沉积法形成绝缘层；施加反应离子刻蚀露出电极；给电极电镀铂黑；在电极上方制备聚二甲基硅氧烷模具，将壳聚糖溶液注射入模具中，通过冷冻干燥获得多孔井型墙壁，将聚二甲基硅氧烷模具揭下，形成芯片单元；最后将培养腔与芯片单元无缝连接。本发明的神经井墙壁的壳聚糖网状结构可以允许神经突起通过，但神经细胞不可通过，可用于神经细胞定位电生理测量。
文档编号G01N33/48GK102360007SQ20111017256
公开日2012年2月22日 申请日期2011年6月24日 优先权日2011年6月24日
发明者杜芝燕, 林秋霞, 段翠密, 王妍, 王常勇, 陈威震, 韩尧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所