专利名称：一种检测结核潜伏感染状态的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测结核潜伏感染的方法和试剂盒，还涉及一种该方法中使用的检测试剂。
背景技术：
结核病又称痨病、白色痕疫,是由结核杆菌(tubercle bacillus)感染引起的慢性传染病，是一种古老的疾病，已有几千年的历史，曾经是危害人类的主要杀手。虽然50年代以来，不断发现有效的抗结核药物，使流行得到了一定的控制，但是，近年来，由于不少国家对结核病的忽视，减少了财政投入、再加上人口的增长、流动人口的增加等因素使结核病流行下降缓慢，甚至有的国家和地区还有所回升，所以，世界卫生组织(WHO)于1993年宣布“全球结核病紧急状态”，确定每年3月24日为“世界防治结核病日”。在我国，结核病也是 当今一个主要的公共健康问题，据第四次全国流行病学调查显示，我国每年新发病例约100万例，受感染人数超过4亿，每年有13万人死于结核病。结核控制的一个重要难题是结核的潜伏感染。在与患者接触的人群中约有2(Γ30%人为结核潜伏感染者，他们身体健康并没有临床症状，也不属于疾病状态，细菌处于潜伏状态中。虽然其中绝大部分人终身不会患病，但是仍然大约会有10%的感染者会在未来若干年中发展成为活动性结核。因此，结核感染状态的检测和辨别对与预防结有着非常重要的作用。目前，检测结核感染的实验室方法有许多种，包括传统的痰抗酸菌涂片、分枝杆菌快速培养、结核特异性核酸片断扩增(定量与定性)、结核菌素皮试(pro)和τ细胞免疫的释放Y-干扰素的方法(IGRA)等。pro方法是基于机体对结核抗原的IV型迟发免疫反应的强弱来诊断结核感染的状态；IGRA是使用结核特异的抗原刺激人外周血淋巴细胞，结核感染者的T淋巴细胞由于已被激活，会分泌大量Y-干扰素，然后通过不同方法检测其中的Y -干扰素来诊断结核感染；使用该方法的诊断试剂盒有QuantiFERON-TB Gold In-tube(Cellestis, Australia)和 T-SPOT. TB (Oxford Immunotech, UK) PPD和IGRA方法均属于基于细胞免疫诊断方法，虽然该类方法已经广泛使用，但是存在一个明显的缺陷并一直无法解决，它们所诊断的是并不是结核病而是结核感染。这意味着它们无法鉴别活动性结核患者与结核潜伏感染者，两类人群使用上述方法结果均呈阳性并且无法区分。虽然活动性结核患者有临床症状，但当临床症状不典型、疑似结核的患者需要诊断或者在潜伏感染率较高的地区使用时，往往不能准确诊断，影响了该方法的应用价值。结核感染后潜伏是由于宿主的保护性免疫反应而引起的，相对于活动性肺结核在宿主免疫反应中也存在很大差异，所以，潜伏感染与活动性疾病状态的鉴别可以通过使用新的免疫分子标记得以改进。因此，考虑到我国结核感染人群基数的庞大、潜伏感染率较高，寻找一种能够准确鉴别潜伏感染状态和活动性结核的方法或试剂盒具有重大价值的。
发明内容
针对现有细胞免疫技术鉴别结核潜伏感染和活动性结核方面存在的缺陷，本发明提供了一种非侵入的方法，通过检测生物样品中的单个核细胞与结核菌素接触后的特定基因表达量的改变，从而判断生物样本是否存在结核潜伏感染，为了实现本发明的方法，还提供了一种该方法中使用的检测试剂盒。本发明第一个目的是提供一种检测生物样品结核潜伏感染的方法；使结核菌素与生物样本中分离的单个核细胞相接触，然后抽提细胞总核糖核酸(RNA)，通过反转录方法将所述的RNA合成为cDNA，而后通过实时定量荧光扩增方法定量检测特征性基因的含量，最后通过比较分析使用结核菌素和不使用结核菌素基因表达量的差异倍数来判结核潜伏感染状态。其中，所检测的特征性基因可以是
i)SEQ ID No. Γ4中的任意核苷酸序列或所述核苷酸序列的任意组合；
ii)SEQ ID No. Γ4中任意核苷酸序列的互补序列或互补序列的任意组合；
iii)与上述核苷酸序列或上述互补序列在严格条件下杂交的任意多核苷酸，优选地，所述杂交的多核苷酸为至少15个连续核苷酸。其中核酸荧光定量PCR检测每个基因时都包括可与靶基因结合的寡核苷酸引物，引物的设计是根据SEQ ID No. f 4为模板，以行业内公知的方法设计引物。其中，本发明所检测的生物样品可以是来源于人的样本，也可以是来源于其他哺乳动物的样本，其特征是包含活的单个核细胞。几种较普遍的可以检测的生物样本包括外周血、淋巴液、胸水、胸腔积液、结巴节、肝脏、脾脏、肺脏和其他器官等。一个优选实施方案检测的是通过分离纯化人外周血的单个核细胞。根据本发明的一个优选实施方案，其中所用的寡核苷酸引物分别是SEQ IDNo. 5-12所述的寡核苷酸序列。根据本发明基因芯片的一种优选实施方式，其中，所述定量检测的特征性基因包括 SEQ ID No. I、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4。更优选为 SEQ ID No. I 和SEQ ID No. 4 的组合。结核感染后潜伏是由于宿主的保护性免疫反应而引起的，相对于活动性肺结核在宿主免疫反应中也存在很大差异，所以，潜伏感染与活动性疾病状态的鉴别可以通过使用新的免疫分子标记得以改进。本发明的实施效果是能够检测结核潜伏感染所特有的免疫反应，进而通过免疫反应将潜伏感染状态与活动性疾病状态相区别，发明包含两个非常重要的技术环节，其一是使用结核菌素生物样本中单个核细胞进行接触并孵育。作为潜伏感染的结果，在受到结核菌素刺激后，一些特定免疫分子的表达会改变。其二是对特定分子的定量检测和比较，如前所述，SEQ ID No. f4所代表的基因即是所发现的特定分子，通过检测这些分子的表达变化，可以间接获得结核感染状态的信息，在结核的控制和诊断上具有重要的参考作用。上文所述单个核细胞与结核菌素的孵育一般为2 12小时，一种比较有代表性的孵育时间是实施里中所述的4个小时。本发明所述基因表达量的差异倍数的判定标准是根据基因在活动性结核和潜伏感染两组人群中进行接受者操作特性曲线分析(R0C曲线)，选择最优值作为该基因区分活动性结核和结核潜伏感染的阈值。如实施例中，四个基因优选判定标准为SEQ ID No. I的表达差异倍数〈I. 77，SEQ ID No. 2的表达差异倍数>0. 896，SEQ ID No. 3的表达差异倍数<1.088, SEQ ID No. 4的表达差异倍数>2. 222，均可判定为潜伏感染。本发明另一个目的是提供一种检测结核潜伏感染状态的试剂盒，具体而言，该试剂盒包含但不局限于(1)结核菌素、细胞培养板、RNA抽提液、逆转录酶反应体系、real-PCR扩增反应体系和引物、阴性对照样品、阳性对照样品、RNA阳性对照品，和(2 )分隔并集中包装试剂瓶或管的包装盒。本发明用于检测结核感染状态的试剂盒，所述引物以如下基因序列为靶基因进行设计
SEQ ID No.广4中的任意核苷酸序列、或所述核苷酸序列互补序列、或严格条件下与所述核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸中的一种或多种。本发明用于检测结核感染状态的试剂盒，所述靶基因为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 4的组合。本发明用于检测结核感染状态的试剂盒，所述引物优选为包含SEQ ID No. 5 12中的一种或多种核苷酸。本发明上述SEQ ID No. f 12序列如下，其中，NCBI为美国国立生物技术信息中心
SEQ ID No. I (NCBI 注册号ΝΜ_001565· 2)
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SEQ ID No. 2 (NCBI 注册号NM—024490. I)
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SEQ ID No. 3 (NCBI 注册号NM—006068. 2)
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SEQ ID No. 4 (NCBI 注册号NM_ 000417. I)GtacaaaaaagcagaagggccgtcaaggcccaccatggattcatacctgctgatgtggggactgctcacgttcatcatggtgcctggctgccaggcagagctctgtgacgatgacccgccagagatcccacacgccacattcaaagccatggcctacaaggaaggaaccatgttgaactgtgaatgcaagagaggtttccgcagaataaaaagcgggtcactctatatgctctgtacaggaaactctagccactcgtcctgggacaaccaatgtcaatgcacaagctctgccactcggaacacaacgaaacaagtgacacctcaacctgaagaacagaaagaaaggaaaaccacagaaatgcaaagtccaatgcagccagtggaccaagcgagccttccaggtcactgcagggaacctccaccatgggaaaatgaagccacagagagaatttatcatttcgtggtggggcagatggtttattatcagtgcgtccagggatacagggctctacacagaggtcctgctgagagcgtctgcaaaatgacccacgggaagacaaggtggacccagccccagctcatatgcacaggtgaaatggagaccagtcagtttccaggtgaagagaagcctcaggcaagccccgaaggccgtcctgagagtgagacttcctgcctcgtcacaacaacagattttcaaatacagacagaaatggctgcaaccatggagacgtccatatttacaacagagtaccaggtagcagtggccggctgtgttttcctgctgatcagcgtcctcctcctgagtgggctcacctggcagcggagacagaggaagagtagaagaacaatctaaggcctcatgggcccagctttcttgtacSEQ ID No. 5 TGCCATTCTGATTTGCTGCCTTSEQ ID No. 6 GGCTTGCAGGAATAATTTCAAGTTTTT SEQ ID No. 7 ACCGCTCCGACCACAAGATCASEQ ID No. 8 TGTCCGCAGGGAAGATTTCGTSEQ ID No. 9 TCCCATAACAGAATCCAGCTACTTGSEQ ID No. 10 CCTTGAAATCATTGAATGAGAGATCTSEQ ID No. 11 CACAGAGGTCCTGCTGAGAGCGSEQ ID No. 12 CTCTTCACCTGGAAACTGACTGGT靶基因与引物关系
扩增靶基因I上游引物 I下游引物SEQIDNo. I SEQIDNo. 5 SEQIDNo. 6SEQIDNo. 2 SEQIDNo. 7 —SEQIDNo. 8SEQIDNo. 3 SEQIDNo. 9 —SEQIDNo. 10SEQIDNo. 4 IsEQIDNo. 11 |sEQIDNo. 1
图I为实时定量荧光PCR检测活动性结核(n=25)与结核潜伏感染人群(n=36) SEQID No. f 4基因的表达差异；图中**表示差异非常显著。
具体实施例方式下面通过具体实施例，对本发明基因芯片进行详细的介绍和说明，以使更好的理解本发明范围，但是下述实施例并不限制本发明范围。本实施例中，采用本发明所述试剂盒进行结核感染状态的检测，方法如下
步骤I :单个核细胞的分离、刺激和RNA提取
采取静脉血至采血管中，3000rpm离心lOmin，吸取中间层白色细胞，重悬于8ml细胞培养基RPMI1640中。加入4ml Ficoll淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液加入淋巴细胞分离液上层。3000rpm 室温离心 20min。
吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min。弃上清,加入5ml红细胞裂解液,室温孵育lOmin。加入RPMI1640重悬,混勻，2000rpm离心5min,弃上清。重悬细胞于培养基中，将细胞分成两组，一组加入10 mg/ml结核菌素，另一组加入培养基作为对照。使用TRIzol试剂抽提单个核细胞总RNA。步骤2 :实时定量荧光PCR检测基因表达差异
使用Peverse Transcription Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA,反应体系为5XPrimeScript Buffer 2ul, RT Enzyme Mix I 0. 5ul> Oligo dT Primer 25 pmol 终浓 度，Random 6 mers 50 pmol终浓度，总RNA小于500 ng,用Rnase free水补足体系至10ul。以基于 SEQ ID No. Γ4基因而设计的 real-time PCR 引物，使用 SYBR Green PCR MasterMix试剂盒以标准的实时定量荧光程序进行SEQ ID No. 1 4和GAPDH基因(对照管家基因)的扩增，反应体系为2XSYBR Green PCR Mix 10 ul，上下游引物各8 pmol, ROX ReferenceDye 0. 4 ul,cDNA 模板 I ul,用 Rnase free 水补足体系至 20 ul。本实施例中所用的引物见表I。荧光定量PCR反应程序为2步法，在ABI 7500上进行，反应条件为95°C 2min，40个循环，每个循环包括95°C 10秒，60°C 30秒。由于荧光定量PCR采用的是双链嵌合燃料法(SYBR GreenI)，基因表达水平变化值的计算方法为相对定量法，以管家基因GAPDH的表达量作为定量参考，使用ΛΛ Ct统计方法(参考 Livak K. & Schmittgen, Methods 25，402-408 (2001))计算上述基因的相对
表达量。表I，本实施例所用弓丨物
权利要求
1.一种用于检测包含单个核细胞的生物样本中结核潜伏感染状态的方法，其特征在于，使结核菌素与生物样本中分离的单个核细胞相接触，然后抽提细胞总RNA，通过反转录方法将所抽提的RNA合成为cDNA，而后通过实时定量荧光扩增方法定量检测特征性基因的含量，最后通过比较分析使用结核菌素和不使用结核菌素特征性基因表达量的差异倍数来判结核潜伏感染状态。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述特征性基因包括SEQID No. Γ4中的任意核苷酸序列、或所述核苷酸序列互补序列、或严格条件下与所述核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸中的一种或多种基因。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述特征性基因包括SEQID No. I和4的组合。
4.一种检测结核潜伏感染状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含PCR扩增引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物以如下基因序列为靶基因进行设计SEQ ID No.广4中的任意核苷酸序列、或所述核苷酸序列互补序列、或严格条件下与所述核苷酸序列或其互补序列杂交的多核苷酸中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述靶基因序列包括SEQID No. I和4的组合。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物包括如下一对或多对引物上游引物TGCCATTCTGATTTGCTGCCTT，下游引物GGCTTGCAGGAATAAITTCAAGTTTTT ；上游引物ACCGCTCCGACCACAAGATCA，下游引物TGTCCGCAGGGAAGATTTCGT ；上游引物TCCCATAACAGAATCCAGCTACTTG，下游引物CCTTGAAATCATTGAATGAGAGATCT ；上游引物CACAGAGGTCCTGCTGAGAGCG，下游引物CTCTTCACCTGGAAACTGACTGGT。
8.根据权利要求Γ8中任意一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，还包括结核菌素、细胞培养板、RNA抽提液、逆转录酶反应体系、real-PCR扩增反应体系、阴性对照样品、阳性对照样品、RNA阳性对照品，和分隔并集中包装试剂瓶或管的包装盒。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测和鉴别结核感染状态的方法和试剂盒，通过实时定量荧光扩增方法定量检测特征性基因的含量，最后通过比较使用结核菌素和不使用结核菌素特征性基因表达量的差异倍数来判结核潜伏感染状态。
文档编号G01N21/64GK102925541SQ20111022922
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者张文宏, 陈嘉臻, 路蝉伊, 张颖, 吴晶, 邵凌云, 王森 申请人:复旦大学附属华山医院