专利名称：一种检测水体中目标汞离子的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及一种检测水体中目标汞离子的方法，具体涉及了一种基于胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)错配与目标汞离子(T-Hg2+-T)的特异性识别作用，利用两种DNA修饰的纳米金(DNAl-AuNPs与DAN2_AuNPs)作为信号放大元件而形成三维“渔网型”结构的电化学传感策略高灵敏度检测水体中汞离子的方法。
背景技术：
汞是一种对环境和人体有极大危害的物质。汞污染主要来自电厂、氯碱、塑料、电池、电子等工业排放的废水。汞有3种价态，其中水体中汞主要以二价形式存在。目前汞的检测主要依赖于分析仪器，如高效液相色谱、感应耦合等离子体质谱以及原子吸收光谱等。近年来，基于胸腺嘧啶错配与Hg2+的特异性识别与电化学方法的优点，发展了一系列DNA电化学生物传感器，而纳米金颗粒作为一种新型的纳米材料，凭借其独特的物理化学特性，如高比表面积、高表面反应活性等，在材料科学、临床医学、生命科学等领域均获得广泛的应用。功能化的纳米金可负载大量的单链DNA，用于捕捉富集水溶液中的汞离子， 起到信号放大作用。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种“渔网型”汞离子电化学生物传感原理定性定量检测水体中汞离子的方法。此方法使用两种不同的DNA功能性纳米金(DNAl-AuNPs与 DAN2-AuNPs)作为电信号放大元件，利用胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)的特异性识别来捕捉并富集汞离子，形成一种三维“渔网型”结构，高灵敏度检测目标离子。本发明的目的通过以下技术方案实现
一种检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)制备纳米金溶液。(2)用含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)错配的DNAl和DNA2序列修饰步骤(1)的纳米金溶液，得到DNA功能性纳米金溶液(命名为DNAl-AuNPs和DNAl-AuNPs)。(3)将与DNAl序列含有T-T错配的cDNA修饰于金电极上制得cDNA修饰电极。(4)得到汞离子检测标准曲线将cDNA修饰电极放置于含有梯度浓度Hg2+的 DNAl-AuNPs溶液中反应后，再加入DNA2_AuNPs溶液反应后，用超纯水清洗cDNA修饰电极后将其放置于含有的Ru (NH3) 63+溶液中进行电化学扫描，得到不同浓度汞离子对应的DPV峰电流；使用DPV峰电流作为纵坐标，汞离子浓度为横坐标，绘制汞离子的标准曲线。(5)定性定量检测样品水体中的汞离子。其中，本发明步骤(1)所述的纳米金溶液的制备方法应理解是现有技术中任意的纳米金溶液的制备方法。本发明步骤(2)所述的含有T-T错配的DNAl和DNA2序列应理解为现有技术中任何相互之间能含有T-T错配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T双链的DNA序列；同理，步骤(3)所述的与DNAl序列含有T-T错配的cDNA序列应理解为现有技术中任意与DNAl相互之间能含有T-T错配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T双链的cDNA序列；因此DNAl和DNA2序列、cDNA序列的设计相互关联配对，其三者的错配原理如图1和图2所示。例如，本发明的 DNA1、DNA2 和 cDNA 设计为
确定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) X Cm1 (DNA2)的组合设计实现cDNA_DNAl_DNA2的 T-T错配的序列；其中η为cDNA的个数，m为DNA2的个数 设计1
DNAl:HS-5'-(CH2)6-TCTGCT CTTGTTCCTΓ-3' cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTTGGTTC ATGTGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTATGGAACTTGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTTCTAGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTAGGTTCTTGTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTACTTGTGCDNA2HS-5-(CH2) 6-AAGGTT CATGTGCTGT-3 HS-5'-(CH2)6-TTGGATCTAGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-ATGGTTCTAGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-ATGGTACTTGTGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AAGGTTCTAGTGCTGT-3共有C51XC5=25 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列O
设计2DNAlHS-5-(CH2)6-TCTGCT TCTTGTCTCT-3 cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTGTGTCTΓ6ΤAGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGACTTGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCATGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCTAGTTGCHS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTAGTGTCTTGTTGCDNA2HS-5-(CH2)6-TGTGAC TAGTTGCTGA-3 HS-5'-(CH2)6-AGTGTCTTGTAGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-TGAGTCTTGATGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AGAGTCTAGTTGCTGT-3HS-5'-(CH2)6-AGTGTCAAGTTGCTGA-3共有C51XC5=25 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列O
设计3 DNAlHS-5-(CH2)6-TCTGCT TCTGTTCTCT-3 cDNAHS-5-(CH2)「AAAGCG GTAGTGTTCTGTTGC-3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC
-3' -3'HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；
HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列。本发明步骤(2)所述的DNA功能性纳米金溶液的制备方法为合成的纳米金经计算得到浓度为2. 3 nmol · L—1，取纳米金溶液在14000 rpm下高速离心20分钟，除去约80% 的上层溶液，在纳米金溶液中加入一定量的DNA (DNA1或DNA2)，使得最终溶液中纳米金溶液与DNA的浓度分别为10 nmol · L—1与3 μ M,静止M h后，再梯度加入2 mol · L—1的氯化钠与PH 7. 0磷酸缓冲溶液，24 h后使得最终溶液含有0. 2mol .L—1 NaCl与10 mmol .L—1 PB, pH 7.0，14000 rpm下高速离心20分钟，清洗，再分散于pH 7. 4,0. 2mol Γ1 NaCl与 IOmmol Γ1 PB 配制的 PBS 溶液中，最终得到 DNA-Au NPs (DNAl-Au NPs 或 DNA2_Au NPs), 置于4°C中保存。本发明步骤(3)所述的cDNA修饰电极的制备方法是金电极浸泡于体积比98% H2SO4 30 %H202=3 1溶液中20分钟，除去表面吸附的杂质，超纯水清洗后，分别用1 μ m、 0.3 μπκΟ.Οδ μπι α-Al2O3粉末打磨干净，再分别于无水乙醇和超纯水中超声清洗5分钟。 最后，得到的金电极在0. 5mol · L—1硫酸溶液中以lOOmVs—1的扫速进行循环伏安扫描，直至得到标准的循环伏安图；将处理干净的金电极浸没于分别含有1 ymol ·厂1 cDNA, pH 7.4 的10 _ol · Γ1 tris-HCl缓冲溶液和l_ol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接着再浸没在 Immol · L—1 MCH溶液中2 h，清洗后得到组装好cDNA的金电极。本发明步骤(4)中，所述的将cDNA修饰电极与含有梯度浓度Hg2+的DNAl_AuNPs溶液的反应条件为37°C下反应30min lh。所述的DNA2_AuNPs溶液的加入量为100 μ L ； 加入反应时间为30min lh。所述的Ru(NH3)63+溶液的浓度为3 10 μ mol · L—1。所述的电化学扫描是差示脉冲伏安(DPV)扫描。本发明步骤(5)中，所述的定性定量检测样品水体中的汞离子的方法是将步骤 (3)得到的cDNA修饰电极浸没于分别含有20 μ L浓度为2 mol · L—1的NaCl、80 μ L浓度 50 mmol · Γ1 的 tris-HCl、100 μ L DNAl-AuNPs 及 100 μ L 含有不同浓度的 Hg2+ 样品水体中，37°C下反应1 h，后再加入100 yL DNA2-AuNPs, 1 h后，将电极取出，用10 mol · Γ1 tris-HCl 清洗 5 分钟，然后在 Ru (NH3)63+浓度 10 μ mol Γ1 的浓度 IOmmol Γ1 的 tris-HCl 缓冲溶液中，进行电化学检测，得到的数据在步骤(4)的标准曲线上进行比对，计算得到样品水体中汞离子含量。本发明的有益效果在于
本发明利用了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶碱基错配与汞离子(T-Hg2+-T)之间的特异性识别， 再结合两种DNA修饰的功能性纳米金(DNAl-AuNPs与DAN2_AuNPs)的放大作用，层层捕捉并富集溶液中的汞离子，最终形成一种三维“渔网”型结构，静电吸附大量的电化学信号探针六氨合钌Ru (NH3) 63+。差示脉冲伏安(DPV)作为电化学检测方法。发展出的这种电化学传感策略检测汞离子具有高灵敏性，操作简单等优点。
检测金属离子的生物传感器很多，如基于有机荧光团或发色团，阳极溶出伏安法， 聚合材料，蛋白质等很多被报道，但由于其局限性(如检出限高，选择性不高，与水溶液环境不兼容)从而想找出一种检出限低、选择性高且与环境相协调的一种方法。而电化学生物传感器有着廉价、操作简易、检测时间短等优点而越来越受到人们的重视。本发明基于汞离子与胸腺嘧啶错配的高效特异识别作用，再结合纳米金的生物兼容性与放大作用，实现了高灵敏、高选择性检测水中汞离子，从而避免了复杂合成(如荧光法)、仪器昂贵(如HPLC)等缺点。且该方法检出限(7.38X10_12mol 远远低于其他电化学生物传感器，且超过其他一些如比色法、荧光法、电制化学发光法等。
图1为本发明胸腺嘧啶-汞离子-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)的特异性识别原理图1。图2为本发明原理图2。图3为15 士 nm纳米金的透射电镜图。图 4 为a)不含 Hg2+，含有 DNAl-AuNPs 与 DNA2_AuNPs ；b)含有 IOOnmol .I71 Hg2+， 不含有 DNAl-AuNPs 与 DNA2_AuNPs ；c)含有 IOOnmol · Γ1 Hg2+ 与 DNAl-AuNPs ；d)含有 IOOnmol · Γ1 Hg2+，DNAl-AuNPs 与 DNA2_AuNPs 的差示脉冲伏安(DPV)图。图5为a)裸金电极；b)金电极上组装上cDNA ;c)含有100 nmol · L—1 Hg2+； d)含有 IOOnmol · L-1 Hg2+ 与 DNAl-AuNPs ；e)含有 IOOnmol · L-1 Hg2+，DNAl-AuNPs 与 DNA2-AuNPs 在含有 5讓ο · Γ1 Fe(CN)63"4- (1:1)与 0· 1 mol · Γ1 KCl 的磷酸缓冲溶液 (IOmmol · Λ pH 7. 4)中阻抗谱图(EIS)。图 6 为分别含 Hg2+ 为 a) O nmol · Γ1 ；b) 0. 05 nmol · Γ1 ；c) 0. 1 nmol · Γ1 ；d) 0. 5 nmol · L-1 ；e) 1 nmol · L-1 ；f) 1. 5 nmol · L-1 ；g) 2 nmol · L-1 ；h) 2. 5 nmol · L-1 ； i) 5 nmol · L-1 ； j) IOnmol · L-1 ；k) 25 nmol · L-1 ；1) 50nmol · L-1 ；m) 75 nmol · L-1 ；η) IOOnmol .L—1所测得的DPV图。溶液为含有10 μ M六氨合钌的tris-HCl缓冲溶液(pH 7. 4， 10mM)。图7为汞离子的标准曲线图，其中的插图为汞离子浓度在0.05nM-2.5nM之间，与 DPV峰电流之间呈线性直线关系。图8为定性检测水中汞离子的选择性实验方法；汞离子(10 nM、100 nM)与其他金属离子(1 μ M)分别对应的DPV峰电流变化。
具体实施例方式本发明涉及的英文名词解释
Au NPs (Au Nanopartiles)纳米金溶液。T (Thymine)胸腺嘧啶。cDNA (capture DNA)，捕捉DNA，用于捕捉纳米金修饰的DNA。DNAl-AuNPs:修饰上 DNAl 的纳米金。Ru(NH3)63+ 简称六氨合钌，全称为hexaaminerutheium(III) chloride ([Ru(NH3)6JCl3)三氯化六氨合钌。DPV (Differential Pulse Voltammetry)差示脉冲伏安法。
Fe(CN) 63-74-铁氰化钾亚铁氰化钾比例为1:1。 EIS (Electrochemical impedance spectroscopy)交流阻抗谱。 TCEP, Tris (2-carboxyethyl)phosphinehydrochloride。 MCH :6_mercaptohexanolο
实施例1
本发明步骤(2)所述的含有T-T错配的DNAl和DNA2序列应理解为现有技术中任何相互之间能含有T-T错配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T双链的DNA序列；同理，步骤(3)所述的与DNAl序列含有T-T错配的cDNA序列应理解为现有技术中任意与DNAl相互之间能含有 T-T错配，即可捕捉Hg2+而形成T-Hg2+-T双链的cDNA序列；因此DNAl和DNA2序列、cDNA序列的设计相互关联配对，其三者的错配原理如图1和图2所示。例如，本发明的DNA1、DNA2 和cDNA设计为
确定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) X Cm1 (DNA2)的组合设计实现cDNA_DNAl_DNA2的 T-T错配的序列；其中η为cDNA的个数，m为DNA2的个数
设计1
-(CH2)6-TCT GCT CTT GTT CCT T-3'； -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TTC ATG TGC-3 ‘；
DNAl :HS-5' cDNA :HS-51
DNA2: HS-5'
HS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTATGGAACTTGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTTCTAGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTAGGTTCTTGTGCHS--5'-(CH2)6-AAAGCGGTTTGGTACTTGTGC6-AAGGTT CATGTGCTGT-3 HS--5'-(CH2)6-TTGGATCTAGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-ATGGTTCTAGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-ATGGTACTTGTGCTGA-3HS--5'-(CH2)6-AAGGTTCTAGTGCTGT-3
共有 C51XC51
设计 2
DNAl HS-5'
=25 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列。 -(CH2)6-TCT GCT TCT TGT CTC T-3'
cDNA:HS-5'-(CH2) 6-AAAGCG GTTGTGTCTTGTAGC-3'；HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGACTTGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCATGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTCTAGTTGC--3HS-5'-(CH2)6-AAAGCGGTAGTGTCTTGTTGC--3DNA2:HS-5'-(CH2)6-TGTGAC TAGTTGCTGA-3 HS-5'-(CH2)6-AGTGTCTTGTAGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-TGAGTCTTGATGCTGA-3HS-5'-(CH2)6-AGAGTCTAGTTGCTGT-3HS-5'-(CH2)6-AGTGTCAAGTTGCTGA-3
共有 C51XQ1=ZS 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列,
设计 3
DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT GTT CTC T-3'； cDNA: HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TTC TGT TGC -3'；
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'；
HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；
HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列。实施例2
(1) 纳米金溶液的制备
纳米金采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得(见图3)。首先，所有玻璃仪器都需要使用王水浸泡以除去玻璃容器中残留的还原性物质。准确称取HAuCl4 ·4Η20 0.0123 g于250 mL 三口烧瓶中，然后三口烧瓶中加入100 mL水。剧烈搅拌，加热沸腾回流。准确称取2水合柠檬酸钠0. 2849 g于25 mL容量瓶中。取3. 2mL柠檬酸钠溶液，水浴加热到50°C后快速加入烧瓶。15分钟后溶液从无色到浅蓝色再到紫色最后为酒红色，继续加热10分钟后停止加热，继续搅拌10分钟后冷却到室温。(2) DNA 功能性纳米金的合成(DNAl-AuNPs 与 DAN2-AuNPs)
合成的纳米金经计算得到浓度为2. 3nmol · L—1，取纳米金溶液在HOOOrpm下高速离心 20分钟，除去约80%的上层溶液，在纳米金溶液中加入一定量的DNA，使得最终溶液中纳米金溶液与DNAl的浓度分别为IOnmol · L—1与3 μ Μ，静止24h后，再梯度加入2 mol · L—1的氯化钠与磷酸缓冲(PB，pH 7. 0)溶液，24 h后使得最终溶液含有0. 2mol · Γ1 NaCl与10 mmol·厂1 PB，pH 7.0,14000 pm下高速离心20分钟，清洗，再分散于PBS溶液中(0. 2mol ·厂1 NaCl 与 IOmmol .171 PB，pH 7. 4)，最终得到 DNAl-Au NPs，置于 4°C 中保存。合成 DNA2_AuNPs 的方法与DNA2-AuNPs方法一致。(3) cDNA修饰电极的制备
金电极(2 mm直径，上海辰华)浸泡于“/^73/^^(98% H2SO4 30 %H2&=3 1(ν/ν))溶液中20分钟，除去表面吸附的杂质，超纯水清洗后，分别用1 μπι、0. 3 μπι,Ο. 05 μπι α -Al2O3 粉末打磨干净，再分别于无水乙醇和超纯水中超声清洗5分钟。最后，得到的金电极在0. 5 mol 硫酸溶液中以lOOn^Vs—1的扫速进行循环伏安扫描，直至得到标准的循环伏安图。 将处理干净的金电极浸没于分别含有1 μπιο ·!/1 cDNA, 10 mmol -L"1 tris_HCl缓冲溶液 (pH 7. 4)和Immol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接着再浸没在Immol · Γ1 MCH溶液中2 h，清洗后得到组装好cDNA的金电极。(4) 电化学检测汞离子将制备好的cDNA组装电极放置于含有一定浓度Hg2+的DNAl-AuNPs中，37°C下反应 30min lh，然后再加入100 μ L DNA2_AuNPs溶液，30min Ih后，用超纯水清洗电极，放置于含有3 10 μΜ的Ru (NH3)63+溶液中进行电化学(差示脉冲伏安，DPV)扫描，得到不同浓度汞离子对应的DPV峰电流(见图4)，然后使用DPV峰电流作为纵坐标，汞离子浓度为横坐标，绘制汞离子的标准曲线(见图5)。 (5)将步骤(3)得到的cDNA修饰电极浸没于分别含有20 μ L浓度为2 mol · L—1 的 NaCl、80yL 浓度 50 mmol .171 的 tris-HCl、100 μ L DNAl-AuNPs 及 100 μ L 不同浓度的 Hg2+样品水体中，37°C下反应1 h，后再加入100 uL DNA2-AuNPs, 1 h后，将电极取出，用 10 mol 'Γ1 tris-HCl 清洗 5 分钟，然后在 Ru (NH3)63+浓度 10 μ mol Γ1 的浓度 IOmmol .171 的tris-HCl缓冲溶液中，进行电化学检测，得到的数据在步骤(4)的标准曲线上进行比对， 计算得到样品水体中汞离子含量。
权利要求
1.一种检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备纳米金溶液；(2)用含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配的DNAl和DNA2序列修饰步骤(1)的纳米金溶液， 得到DNA功能性纳米金溶液DNAl-AuNPs和DNAl-AuNPs ；(3)将与DNAl序列含有胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配的cDNA修饰于金电极上制得cDNA修饰电极；(4)得到汞离子检测标准曲线将cDNA修饰电极放置于含有梯度浓度Hg2+的 DNAl-AuNPs溶液中反应后，再加入DNA2_AuNPs溶液反应后，用超纯水清洗cDNA修饰电极后将其放置于含有的Ru (NH3) 63+溶液中进行电化学扫描，得到不同浓度汞离子对应的DPV峰电流；使用DPV峰电流作为纵坐标，汞离子浓度为横坐标，绘制汞离子的标准曲线；(5)定性定量检测样品水体中的汞离子将步骤(3)得到的cDNA修饰电极浸没于分别含有 20 μ L 浓度为 2 mol · L—1 的 NaCl、80 μ L 浓度 50 mmol · L—1 的 tris_HCl、100 μ L DNAl-AuNPs及100 μ L不同浓度的Hg2+样品水体中，37°C下反应1 h，后再加入100 μ L DNA2-AuNPs, 1 h后，将电极取出，用10 mol吨―1 tris_HCl清洗5分钟，然后在Ru (NH3) 63+浓度10 μ mol · L-1的浓度IOmmol · L-1的tris-HCl缓冲溶液中，进行电化学检测，得到的数据在步骤(4)的标准曲线上进行比对，计算得到样品水体中汞离子含量。
2.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA设计为确定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的组合设计实现 CDNA-DNA1-DNA2的T-T错配的序列；其中η为cDNA的个数，m为DNA2的个数DNAl :HS-5' -(CH2)6-TCT GCT CTT GTT CCT T-3'；cDNA :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AAA GCG GTT TGG TTC ATG TGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA TGG AAC TTG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TTC TAG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT AGG TTC TTG TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT TGG TAC TTG TGC-3 ‘；DNA2: HS-5' -(CH2)6-AAG GTT CAT GTG CTG T-3'；HS-5' -(CH2)6-TTG GAT CTA GTG CTG Α~3'； HS-5' -(CH2)6-ATG GTT CTA GTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-ATG GTA CTT GTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AAG GTT CTA GTG CTG Τ-3'；共有 C51XQ1=ZS 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列。
3.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA设计为确定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的组合设计实现 CDNA-DNA1-DNA2的T-T错配的序列；其中η为cDNA的个数，m为DNA2的个数DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT TGT CTC T-3'；cDNA :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AAA GCG GTT GTG TCT TGT AGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG ACT TGT TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TCA TGT TGC-3 ‘； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TCT AGT TGC-3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TCT TGT TGC-3‘； DNA2: HS-5' -(CH2)6-TGT GAC TAG TTG CTG A-3'；HS-5' -(CH2)6-AGT GTC TTG TAG CTG A_3'； HS-5' -(CH2)6-TGA GTC TTG ATG CTG A_3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTC TAG TTG CTG T-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTC AAG TTG CTG A_3'； 共有 C51XQ1=ZS 种 cDNA-DNAl-DNA2 组合序列。
4.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于所述的DNA1、 DNA2和cDNA设计为确定DNAl的序列后，按照Cn1 (cDNA) XCm1 (DNA2)的组合设计实现 CDNA-DNA1-DNA2的T-T错配的序列；其中η为cDNA的个数，m为DNA2的个数DNAl HS-5' -(CH2)6-TCT GCT TCT GTT CTC T-3'； cDNA: HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTA GTG TTC TGT TGC -3'；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GAG TTC TAT TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TAC TGT TGC -3'；HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGA TGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC TGT AGC -3'； HS-5' -(CH2)6-AAA GCG GTT GTG TTC AGT TGC-3 ‘； DNA2 :HS-5 ‘ - (CH2) 6_AGA GTT CTG TAG CTG T_3 ‘；HS-5' -(CH2)6-AGT GAT CTG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CTG ATG CTG Τ-3'； HS-5' -(CH2)6-AGT GTT CAG TTG CTG Α-3'； HS-5' -(CH2)6-AGA GTT CAG TTG CTG Τ-3'； 共有 C61XQ1=SO 种 CDNA-DNA1-DNA2 组合序列。
5.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(2)所述的 DNA功能性纳米金溶液的制备方法为合成的纳米金经计算得到浓度为2. 3 nmol ，取纳米金溶液在14000 rpm下高速离心20分钟，除去约80%的上层溶液，在纳米金溶液中加入一定量的DNA，使得最终溶液中纳米金溶液与DNA的浓度分别为10 nmol · L—1与3 μ M，静止 24 h后，再梯度加入氯化钠与ρΗ 7.0磷酸缓冲溶液，24 h后使得最终溶液含有0. 2mol -L"1 NaCl与10 mmol · Γ1 PB, ρΗ 7. 0，14000 rpm下高速离心20分钟，清洗，再分散于ρΗ 7. 4， 0. 2mol Γ1 NaCl与IOmmol 'L"1 PB配制的PBS溶液中，最终得到DNA-Au NPs，置于4°C中保存。
6.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(3)所述的 cDNA修饰电极的制备方法是金电极浸泡于体积比98% H2SO4 30 %H202=3:1溶液中20分钟，除去表面吸附的杂质，超纯水清洗后，分别用1 μπι、0.3 μπι,ο. 05 μπι α-Al2O3粉末打磨干净，再分别于无水乙醇和超纯水中超声清洗5分钟；最后，得到的金电极在0. 5mol - Γ1 硫酸溶液中以100m-Vs-1的扫速进行循环伏安扫描，直至得到标准的循环伏安图；将处理干净的金电极浸没于分别含有1 μ mol · L—1 cDNA, ρΗ 7. 4的10 mmol · L—1 tris-HCl缓冲溶液和Immol · Γ1 TCEP的混合溶液中10 h，接着再浸没在Immol · L—1 MCH溶液中2 h，清洗后得到组装好cDNA的金电极。
7.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(4)中所述的将cDNA修饰电极与含有梯度浓度Hg2+的DNAl-AuNPs溶液的反应条件为37°C下反应 30min Ih0
8.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(4)所述的所述的DNA2-AuNPs溶液的加入量为100 μ L ；加入反应时间为30min lh。
9.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(4)所述的 Ru(NH3)63+ 溶液的浓度为:3 10 μ mol · L-1。
10.根据权利要求1所述的检测水体中目标汞离子的方法，其特征在于步骤(4)所述的电化学扫描是差示脉冲伏安扫描。
全文摘要
本发明属于分析化学领域，涉及一种检测水体中目标汞离子的方法。本发明利用了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶碱基错配与汞离子(T-Hg2+-T)之间的特异性识别，再结合两种DNA修饰的功能性纳米金(DNA1-AuNPs与DAN2-AuNPs)的放大作用，层层捕捉并富集溶液中的汞离子，最终形成一种三维“渔网”型结构，静电吸附大量的电化学信号探针六氨合钌Ru(NH3)63+。差示脉冲伏安(DPV)作为电化学检测方法。发展出的这种电化学传感策略检测汞离子具有高灵敏性，操作简单等优点。
文档编号G01N27/48GK102435662SQ20111027566
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘会祥, 唐雪梅, 宋荣斌, 梅亚军, 田丹碧, 马玉洁, 黄和 申请人:南京工业大学