专利名称：黄连汤制炉甘石的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药的检测方法，特别涉及黄连汤制炉甘石的检测方法。
背景技术：
炉甘石为碳酸盐类矿物方解石族菱锌矿的矿石。主含碳酸锌(ZnCO3)。具有解毒明目退翳，收湿止痒敛疮的功能。用于目赤肿痛，眼弦赤烂，翳膜遮睛，胬肉攀睛，溃疡不敛， 脓水淋漓，湿疮瘙痒。炉甘石为较常用中药，在《品汇精要》中即有记载。《本草纲目》载“炉甘石所在坑冶处皆有，以川、蜀、湘东最多，而太原、泽州、阳城、高平、灵丘、融县及云南者为胜。金银之苗也。其块大小不一，状似羊脑、松如石脂，亦粘舌。产于金坑者，其色微黄，为上。产于银坑者，其色白，或带青，或带绿，或粉红”。主产于广西。湖南、四川、云南等地亦有。炉甘石自1963年版药典以来历版《中国药典》均有收载，1988年版《全国中药炮制规范》记载其炮制品有煅炉甘石、黄连汤制炉甘石。具体记载的炮制方法如下煅炉甘石取净炉甘石，置耐火容器中，放无烟炉火内，煅至红透，取出，立即倒入水中浸淬、搅拌，倾取混悬液，未透者浙干后，再煅烧，反复浸淬3 4次。合并混悬液，静置， 倾去上层清水，干燥研散。黄连汤制炉甘石用黄连煎汤，过滤去渣，加入煅炉甘石细粉中拌勻，吸尽后，干燥。每煅炉甘石细粉100kg，用黄连12. 5kg。对炉甘石中铁盐的鉴别、氧化锌的含量测定方法2010年版《中国药典》一部及 1988年版《全国中药炮制规范》中有收载，但是黄连汤制炉甘石仅有性状观察，其鉴别及含量测定方法文献未见报道，且由于黄连汤制炉甘石样品颜色呈淡黄色，采用现有的炉甘石的理化鉴别及氧化锌的含量测定方法均不适宜。
发明内容
本发明的目的是提供黄连汤制炉甘石的检测方法，该方法能有效检测黄连汤制炉甘石，且重复性好。本发明采取的技术方案为黄连汤制炉甘石的检测方法，包括黄连汤制炉甘石的理化鉴别、薄层层析鉴别，还包括黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定、小檗碱的含量测定，步骤如下(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取待测黄连汤制炉甘石样品加稀盐酸使溶解，每1. 5g待测黄连汤制炉甘石样品加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% -10. 5% m/m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭(lg_2g)振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg， 加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝；(2)黄连汤制炉甘石的薄层层析鉴别
取待测黄连汤制炉甘石样品加甲醇，每0.5g_lg待测黄连汤制炉甘石样品加甲醇 25-50ml，加热回流10-20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇 25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成0. 2mg/ml的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2_5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，层析分离，置紫外光灯(365nm)下检视。黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 15g_0.2g，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9.5%-10.5% m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液(pH 10. 0)[配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25% -28% m/m) 35ml，再加水稀释至100ml,即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml，即得)10ml，加活性碳0. lg-0. 3g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液(pH 10. 0， 配制方法同上)1份与水4份的混合液洗涤3次，每次IOml，合并洗液与滤液，加30% (ν/ν) 三乙醇胺溶液15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L)相当于4. 069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量限度为50. 0% -75. 0% (wt% )0(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为15 μ g/ml-25 μ g/ml的对照品溶液，取待测黄连汤制炉甘石样品0. lg-o. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇混合液(含HCl 36. 0% -38. 0% m/m) 20ml_30ml，超声处理20分钟-30分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过得供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液10 μ 1与供试品溶液10μ 1 20μ 1，注入液相色谱仪，高效液相色谱法测定小檗碱的含量。黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 15% -0. 45% (wt% )。上述步骤O)中色谱分离照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2 μ 1-5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv V V V)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm) 下检视。上述步骤(4)中高效液相色谱法测定照《中国药典》2010年版一部附录VI D测定， 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. 1% (ν/ν)磷酸溶液G6 64, ν ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长350nm ； 所述的盐酸-甲醇混合液中盐酸(含HCl 36. 0^-38.0% m/m)与甲醇的体积比为1 100。上述步骤(1)为黄连汤制炉甘石的理化鉴别，黄连汤制炉甘石因其采用黄连炮制，性状显淡黄色，上述步骤(1)加稀盐酸溶解后，其溶液颜色亦显淡黄色，如果直接采用 2010年版《中国药典》一部炉甘石的理化鉴别，沉淀颜色不便于观察，通过试验，本发明取适宜的黄连汤制炉甘石样品，加入了适量的活性炭脱色，使其溶液无色，便于观察加亚铁氰化钾试液生成的白色沉淀，及放置后沉淀变蓝。上述步骤O)为黄连汤制炉甘石的薄层鉴别，黄连汤制炉甘石因其采用黄连炮制，黄连中含有小檗碱等生物碱类成份，因此采用黄连对照药材和盐酸小檗碱为对照，对其进行薄层鉴别。试验中模拟供试品溶液的制备方法制得了缺黄连空白对照液，层析结果表明，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与对黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；而缺黄连空白在相应的位置上则无此斑点，见附图1。上述步骤(3)为黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定，黄连汤制炉甘石因其采用黄连炮制，性状显淡黄色，如果直接采用2010年版《中国药典》一部炉甘石中氧化锌的含量测定方法，颜色观察有干扰，不能测定，通过试验，本发明取适宜的黄连汤制炉甘石样品，力口入了适量的活性炭脱色，使其溶液无色，便于滴定终点颜色的观察。本发明的有益效果是其一，本发明提供了黄连汤制炉甘石的理化鉴别方法。因黄连汤制炉甘石采用了黄连炮制，其性状呈淡黄色，现有文献记载炉甘石的理化鉴别方法不适宜，本发明通过试验研究，发现黄连汤制炉甘石加入稀盐酸溶解，过滤后，溶液颜色呈淡黄色，再加入适量的活性炭脱色，即可观察最后的沉淀情况，否则不能。黄连汤制炉甘石的取样量、活性炭的加入量及试验过程中从哪个步骤加入活性炭等均为通过试验研究确定，通过多批样品试验，方法可行。其二，本发明提供了黄连汤制炉甘石的薄层层析鉴别方法。黄连汤制炉甘石采用黄连炮制，对于其中所用炮制辅料黄连，本发明通过试验研究，确定了其薄层层析鉴别方法，并进行了缺黄连空白试验，结果缺黄连空白无干扰。薄层层析鉴别中，黄连汤制炉甘石的取样量、甲醇的加入量以及提取方法、提取时间、点样量等均通过试验研究确定，其方法简便、可行。其三，本发明提供了黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定方法。因黄连汤制炉甘石采用了黄连炮制，其性状呈淡黄色，现有文献记载炉甘石中氧化锌的含量测定方法不适宜，本发明通过试验研究，发现试验过程中加入适量的活性炭脱色，即可观察最后滴定终点的确定，否则不能。通过研究，本方法重复性好、回收率达到98. 30%，RSD为1.71%，方法可行可控，通过研究确定黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量限度为50.0% -75.0% (wt%), 其中黄连汤制炉甘石的取样量、活性炭的加入量及试验过程中从哪个步骤加入活性炭等均为通过试验研究确定。其四，本发明提供了黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定方法。黄连汤制炉甘石采用黄连炮制，黄连中含有小檗碱等生物碱类成分，本发明通过试验研究，发明了黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定方法。通过试验研究，确定了黄连汤制炉甘石的取样量、提取液的加入量、提取方法、提取时间、进样量等，研究发现，该方法缺黄连空白无干扰、重复性好、 回收率为96. 13%,RSD为1. 08%，方法简便、可行可控，通过研究确定黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量以盐酸小檗碱计含量为0. 15% -0. 45% (wt% )0本发明方法能有效检测黄连汤制炉甘石，适应性、重复性好，可操作性强，填补了黄连汤制炉甘石检测方法的空白。
图1黄连汤制炉甘石的TLC鉴别照片，其中a.供试品20110401，b.供试品 20110512，c.供试品 20110513，d.供试品 20110514，e.供试品 20110515，f.供试品 20110516，g.供试品 20110517，h.供试品 20110518，i.供试品 20110519，j.供试品 20110520，k.缺黄连空白，1.黄连，m.盐酸小檗碱；图2盐酸小檗碱标准曲线；图3缺黄连空白HPLC图；图4盐酸小檗碱对照品HPLC图；图5黄连汤制炉甘石供试品HPLC图。
具体实施例方式实施例1黄连汤制炉甘石样品批号20110605(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭lg，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别取黄连汤制炉甘石样品0.5g，加甲醇25ml，加热回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 15g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml，即得)10ml，加活性碳0. lg，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制 取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25% -28% m/m) 35ml，再加水稀释至IOOml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次IOml，合并洗液与滤液，加30 %三乙醇胺溶液(v/v) 15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L)相当于4. 069mg 的氧化锌(SiO)。
本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为55. 46% (平均值，η =幻衬％。(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为15μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. lg，平行取2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含HCl 36.0%-38.0%111/111)-甲醇(1 IOOv v) 20ml，超声处理(功率250W,频率50kHz) 20分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 293% (平均值，η = 2) (wt% )。实施例2黄连汤制炉甘石样品批号20110606(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭2g，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别取黄连汤制炉甘石样品0. 5g，加甲醇50ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 2g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml，即得)10ml，加活性碳0. 3g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制 取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25% -28% m/m) 35ml，再加水稀
8释至100ml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30%三乙醇胺溶液(v/v) 15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L)相当于4. 069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为61. 38% (平均值，η = 2) (wt% )0(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为15μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. 15g，平行取2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含HCl 36.0%-38.0% m/m)-甲醇(1 IOOv v)20ml，超声处理 (功率250W,频率50kHz) 20分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 168% (平均值，η = 2) (wt% )。实施例3黄连汤制炉甘石样品批号20110607(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭1. 5g，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别取黄连汤制炉甘石样品0. 5g，加甲醇30ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 18g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml，即得)10ml，加活性碳0. 2g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制 取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25% -28% m/m) 35ml，再加水稀释至IOOml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次IOml，合并洗液与滤液，加30 %三乙醇胺溶液(v/v)15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L)相当于4. 069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为71. 56% (平均值，η = 2) (wt% )0(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为25μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含 HCl 36. 0%-38. 0% m/m)-甲醇(1 IOOv v) 25ml，超声处理(功率 250W， 频率50kHz) 30分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液20μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 428% (平均值，η = 2) (wt% )。实施例4黄连汤制炉甘石样品批号20110608(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭1. 8g，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别取黄连汤制炉甘石样品lg，加甲醇25ml，加热回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各4 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。
(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 15g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml，即得)10ml，加活性碳0. 2g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制 取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25-28% m/m) 35ml，再加水稀释至 100ml,即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30%三乙醇胺溶液(v/v)15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于4.069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为73. 45% (平均值，η = 2) )。(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为20μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. lg，平行取2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含HCl 36. 0%-38.0% m/m)-甲醇(1 IOOv v) 20ml，超声处理(功率250W,频率50kHz) 25分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 436% (平均值，η = 2) (wt% )。实施例5黄连汤制炉甘石样品批号20110619(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭1. 6g，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别取黄连汤制炉甘石样品0. Sg,加甲醇40ml，加热回流15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各5 μ 1，分别
11点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 17g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml， 即得)10ml，加活性碳0.25g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10.0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25 % -28 % m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30% 三乙醇胺溶液(v/v) 15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L) 滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于 4. 069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为51. 33% (平均值，η = 2) (wt% )0(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为25μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. 13g，平行取2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含HCl 36.0%-38.0% m/m)-甲醇(1 IOOv v)25ml，超声处理 (功率250W,频率50kHz) 30分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液20μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 284% (平均值，η = 2) (wt% )。实施例6黄连汤制炉甘石样品批号20110621(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取黄连汤制炉甘石样品1. 5g，加稀盐酸(本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5% m/ m) 20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭1. 5g，振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液(亚铁氰化钾试液配制取亚铁氰化钾lg，加水IOml使溶解，即得，本液应临用新制)，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝。(2)黄连汤制炉甘石的薄层鉴别
取黄连汤制炉甘石样品lg，加甲醇25ml，加热回流15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含0. 2mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν ν) 为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点。(3)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 15g，平行取2份，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml， 即得)10ml，加活性碳0. 15g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[PH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25 % -28 % m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30% 三乙醇胺溶液(v/v) 15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L) 滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于 4. 069mg 的氧化锌(SiO)。本品按干燥品计算，含氧化锌(SiO)含量为58. 24% (平均值，η = 2) (wt% )0(4)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定照高效液相色谱法测定(《中国药典》2010年版一附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0. (ν/ν)磷酸溶液06 64v ν)(每IOOml含0. Ig十二烷基硫酸钠)为流动相，检测波长 350nmo对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为20μ g/ml 的对照品溶液。供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. 15g，平行取2份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸(含HCl 36.0%-38.0% m/m)-甲醇(1 IOOv v)25ml，超声处理 (功率250W,频率50kHz) 30分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液10μ 1，注入液相色谱仪，测
定，即得。本批黄连汤制炉甘石按干燥品计算，含小檗碱以盐酸小檗碱(C2tlH17NO4)计，为 0. 205% (平均值，η = 2) (wt% )。试验1黄连汤制炉甘石的薄层层析鉴别采用薄层层析法，以盐酸小檗碱为对照对黄连汤制炉甘石进行鉴别，试验中还制备了缺黄连空白，结果阴性无干扰。方法如下
供试品溶液的制备取黄连汤制炉甘石0. 5g，加甲醇25ml，加热回流10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。点样2μ1。黄连对照药材溶液的制备取黄连对照药材0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟， 滤过，滤液作为黄连对照药材溶液。点样2 μ 1。盐酸小檗碱对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每Iml含O.aiig 的溶液，作为对照品溶液。点样2μ1。缺黄连空白溶液的制备取煅炉甘石粉末0. 5g，模拟供试品溶液的制备方法制得缺黄连空白溶液。点样2μ1。薄层板硅胶G薄层板，固定相涂布厚度为0.3mm，规格20 X 20cm。硅胶G为青岛
海洋化工厂生产。展开剂乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水(10 7 1 Iv ν ν V)。检视紫外光灯(365nm)下检视。结果黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；而缺黄连药材色谱在相应的位置上，无此斑点。见附图1。试验2黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定的对比试验、重复性试验及回收率试验仪器与试药碱式滴定管，盐酸、氯化铵、磷酸氢二钠、乙二胺四醋酸二钠、三乙醇胺、氧化锌等所用试剂、试药均为分析纯。含量测定方法取黄连汤制炉甘石样品0. 15g，精密称定，置锥形瓶中，加稀盐酸 (本液HCl的浓度应为9. 5% 10. 5%m/m) 10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液(NH3含量为 25% -28% m/m)与氨-氯化铵缓冲液[pH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后， 加浓氨溶液(NH3含量为25%m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]各10ml，摇勻， 加磷酸氢二钠试液(磷酸氢二钠试液配制取磷酸氢二钠结晶12g，加水使溶解成100ml， 即得)10ml，加活性碳0. 15g，振摇，滤过。锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液[pH 10. 0，配制取氯化氨5. 4g，加水20ml溶解后，加浓氨溶液(NH3含量为25 % -28 % m/m) 35ml，再加水稀释至100ml，即得]1份与水4份的混合液洗涤3次，每次10ml，合并洗液与滤液，加30% 三乙醇胺溶液(v/v) 15ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0. 05mol/L) 滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色。每Iml乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)相当于 4. 069mg 的氧化锌(SiO)。空白试验按上述“含量测定方法”所述的操作不加黄连汤制炉甘石样品，进行空白试验，结果空白无干扰。重复性试验取同一批黄连汤制炉甘石样品00110401)0. 15g，共取6份，按上述方法进行含量测定，结果见表1。表1重复性试验结果
权利要求
1.黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，包括黄连汤制炉甘石的理化鉴别、薄层层析鉴别，具体步骤如下(1)黄连汤制炉甘石的理化鉴别取待测黄连汤制炉甘石样品加稀盐酸使溶解，每1.5g待测黄连汤制炉甘石样品加 9. 5% 10. 5% m/m的稀盐酸20ml，振摇，溶液呈淡黄色，然后加活性炭振摇，滤过，滤液加亚铁氰化钾试液，黄连汤制炉甘石样品生成白色沉淀、放置后沉淀变蓝；(2)黄连汤制炉甘石的薄层层析鉴别取待测黄连汤制炉甘石样品加甲醇，每0. 5g-lg待测黄连汤制炉甘石样品加甲醇 25ml-50ml，加热回流10分钟-20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取黄连对照药材 0. 3g加甲醇25ml，加热回流20分钟，滤过，滤液作为黄连对照药材溶液；再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成0. 2mg/ml的溶液，作为对照品溶液；吸取上述三种溶液各2 μ 1_5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
2.根据权利要求1所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，还包括氧化锌的含量测定、小檗碱的含量测定，具体如下(a)黄连汤制炉甘石中氧化锌的含量测定取待测黄连汤制炉甘石样品0. 15g-0. 2g，精密称定，置锥形瓶中，加9. 5% 10. 5%m/ m的稀盐酸10ml，振摇使锌盐溶解，加浓氨试液与pH = 10. 0的氨-氯化铵缓冲液各10ml， 摇勻，加磷酸氢二钠试液10ml，加活性炭，振摇，滤过；锥形瓶与残渣用氨-氯化铵缓冲液与水的混合液洗涤，合并洗液与滤液，加30%的三乙醇胺溶液15ml与铬黑T指示剂少量，用 0. 05mol/L的乙二胺四醋酸二钠滴定液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，每Iml 0. 05mol/ L的乙二胺四醋酸二钠滴定液相当于4. 069mg的氧化锌；(b)黄连汤制炉甘石中小檗碱的含量测定精密称取盐酸小檗碱对照品加甲醇溶解制成浓度为15yg/ml-25yg/ml的对照品溶液，取待测黄连汤制炉甘石样品0. lg-0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇混合液20ml-30ml，超声处理20分钟-30分钟，放冷，离心，以0. 45 μ m滤膜滤过得供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液10μ 1与供试品溶液10 20μ 1，注入液相色谱仪， 高效液相色谱法测定小檗碱的含量。
3.根据权利要求1或2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(1)所述的亚铁氰化钾试液为0. lg/ml的亚铁氰化钾水溶液。
4.根据权利要求1或2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(1)所述的活性炭加入量为l_2g。
5.根据权利要求1或2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤⑵以乙酸乙脂-丁酮-甲酸-水=10 :7:1: 1为展开剂。
6.根据权利要求2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(a)所述的浓氨试液NH3含量为25% -28% m/m ；所述的磷酸氢二钠试液为0. 12g/ml的磷酸氢二钠水溶液；氨-氯化铵缓冲液为由氯化铵和浓氨溶液混合而成。
7.根据权利要求2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(a)所述的混合液洗涤是用PH = 10. 0的氨-氯化铵缓冲液1份与水4份的混合液洗涤3次，每次用IOml。
8.根据权利要求2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(a)所述的氧化锌的含量为50.0% -75.0%。
9.根据权利要求2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(a)所述的活性炭加入量为0. 1-0. 3g。
10.根据权利要求2所述的黄连汤制炉甘石的检测方法，其特征是，步骤(b)所述的小檗碱以盐酸小檗碱计，含量为0. 15% -0.45%。
全文摘要
本发明涉及一种黄连汤制炉甘石的检测方法，包括黄连汤制炉甘石的理化鉴别、薄层层析鉴别，还包括氧化锌的含量测定、小檗碱的含量测定；取待测黄连汤制炉甘石样品加适量稀盐酸溶解、加活性炭过滤后加亚铁氰化钾试液生产沉淀；将黄连汤制炉甘石样品、黄连对照药材、盐酸小檗碱对照品进行薄层层析，365nm紫外灯下检视，黄连汤制炉甘石样品色谱中，在与黄连对照药材、盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上有相同颜色的斑点；氧化锌的含量测定采用活性炭脱色、乙二胺四醋酸二钠滴定液滴定，小檗碱的含量采用高效液相色谱法测定。方法能有效检测黄连汤制炉甘石，适应性、重复性好，可操作性强，填补了黄连汤制炉甘石检测方法的空白。
文档编号G01N30/02GK102507579SQ20111038262
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者刘善新, 曲永胜, 王亮, 苏本正, 靳光乾 申请人:山东省中医药研究院