专利名称：一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法
技术领域：
本发明属于移植免疫检测领域，特别涉及一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法。
背景技术：
传统肾移植术后急性细胞性排斥反应的检测方法多从移植受者者血液、尿液直接进行ELISA检测，但由于移植受者服用免疫抑制剂致使免疫分子表达受到抑制，因此在血液、尿液表达量较低，从而导致免疫标记分子表达量在肾功能正常与急性排斥受者之间的差距较小，因而此类传统做法存在检测的免疫指标灵敏度低、特异度不高的现象。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有移植免疫检测领域技术和功能上的缺陷与不足，针对移植免疫检测领域高灵敏度、高特异度的要求，提供一种预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法，其特征在于，包括:体外刺激肾移植受者外周血淋巴细胞，增加免疫分子的表达以放大排斥反应信号，并提前预测急性细胞性排斥反应，所述体外刺激是指PMA和离子霉素体外刺激，所述排斥反应信号是指流式细胞术检测细胞培养上清液IL-2和IL-6的含量，所述排斥反应信号还指流式细胞术检测细胞培养上清液TNF-α和IFN-Y的含量，所述提前预测是指诊断急性细胞性排斥反应的时间要早于其临床诊断。所述方法可提前3-5天预测急性细胞性排斥反应。所述体外刺激时间为4-8h。其特征在于:所述细胞培养液上清IL-2和IL-6的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为91.7%，特异度为95.6%。所述细胞培养液上清TNF- α和IFN- Y的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为89.2%，特异度为93.23%。所述细胞培养液上清IL-2、IL_6、TNF- α和IFN- Y的荧光强度值在急性排斥反应组均显著高于肾功能正常组。所述的方法还包括以下步骤:I)采集肾移植受者晨起空腹肝素抗凝外周静脉血5ml,800rpm,离心3min,取血衆
0.2ml置入无菌0.5ml EP管中，剩余抗凝全血用PBS对倍稀释；2)取3个无菌试管(容积5ml)，每个试管加入2ml淋巴细胞分离液，每个试管中加入3ml用PBS对倍稀释的抗凝全血(用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面)，2OOOrpm,离心2Omin ；3)离心结束后，用毛细吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一无菌短中管中(容积15ml)，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpm,离心IOmin,洗涤细胞I次；4)离心结束后弃上清，在细胞沉淀中加入红细胞裂解液4ml，静置5min，期间颠倒混匀I次，IOOOrpm,离心5min ；5)离心结束后弃上清，加入PBS液10ml，混匀，1000离心5min，洗涤细胞2次；6)末次离心弃上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640液100 μ L，重悬细胞，取10 μ L细胞悬液加入无菌0.5mlEP管中，并加入90 μ L PBS液充分混匀，取10 μ L稀释后的细胞悬液与IOyL 0.2%台盼兰染液充分混合，滴加至血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数；7)细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率，本试验方案要求活细胞百分率在95%以上；
权利要求
1.一种早期预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法，其特征在于，包括:体外刺激肾移植受者外周血淋巴细胞，增加免疫分子的表达以放大排斥反应信号，并提前预测急性细胞性排斥反应， 所述体外刺激是指PMA和离子霉素体外刺激， 所述排斥反应信号是指流式细胞术检测细胞培养上清液IL-2和IL-6的含量， 所述排斥反应信号还指流式细胞术检测细胞培养上清液TNF-α和IFN-Y的含量， 所述提前预测是指诊断急性细胞性排斥反应的时间要早于其临床诊断。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法可提前3-5天预测急性细胞性排斥反应。
3.根据权利 要求1所述的方法，其特征在于:所述体外刺激时间为4-8h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述细胞培养液上清IL-2和IL-6的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为91.7%，特异度为95.6%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述细胞培养液上清TNF-α和IFN-Y的含量预测术后急性细胞性排斥反应的灵敏度为89.2%，特异度为93.23%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述细胞培养液上清IL-2、IL-6、TNF-a和IFN-Y的荧光强度值在急性排斥反应组均显著高于肾功能正常组。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:还包括以下步骤: 1)采集肾移植受者晨起空腹肝素抗凝外周静脉血5ml，800rpm，离心3min，取血浆.0.2ml置入无菌0.5ml EP管中，剩余抗凝全血用PBS对倍稀释； 2)取3个无菌试管(容积5ml)，每个试管加入2ml淋巴细胞分离液，每个试管中加入3ml用PBS对倍稀释的抗凝全血(用滴管沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面)，2000rpm,离心 20min ； 3)离心结束后，用毛细吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一无菌短中试管中(容积15ml)，加入5倍以上体积的PBS液，1500rpm，离心lOmin，洗涤细胞I次； 4)离心结束后弃上清，在细胞沉淀中加入红细胞裂解液4ml，静置5min，期间颠倒混匀I 次，IOOOrpm,离心 5min ； 5)离心结束后弃上清，加入PBS液10ml，混匀，1000离心5min，洗涤细胞2次； 6)末次离心弃上清，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640液100 μ L，重悬细胞，取.10 μ L细胞悬液加入无菌0.5mlEP管中，并加入90 μ L PBS液充分混匀，取10 μ L稀释后的细胞悬液与IOyL 0.2%台盼兰染液充分混合，滴加至血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数； 7)细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色，计数200个淋巴细胞，计算出活细胞百分率，本试验方案要求活细胞百分率在95 %以上；活细胞数活细胞百分率=-XlOO %总细胞数 8)单个核细胞浓度(细胞数/毫升细胞悬液)二
全文摘要
本发明公开了一种预测肾移植术后急性细胞性排斥反应的方法，将肾移植受者术后外周静脉血在体外分离出淋巴细胞，将淋巴细胞经PMA和离子霉素体外刺激4-8小时，在流式细胞仪检测细胞培养上清液IL-2和IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量，达到预测急性细胞性排斥反应发生的目的。本发明提供的方法打破了传统检测移植受者血液、尿液免疫指标低灵敏度、特异度的局限性，大大提高预测排斥反应的敏感度和特异度，该方法操作简便、微创、费用低，且可提前3-5天预测急性细胞性排斥反应的发生，为指导临床合理使用免疫抑制剂提供重要依据。
文档编号G01N15/14GK103175769SQ20111044040
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者田普训, 靳占奎, 林远, 薛武军, 郑瑾 申请人:田普训