专利名称：利用真皮类似物的皮肤弹性增强能力评价方法
技术领域：
本发明涉及一种评价皮肤弹性增强效果的方法，该方法是通过制备与实际真皮类似的三维真皮类似物(mimetic dermis),并测量真皮类似物的变形程度的差异实现的。
背景技术：
皮肤真皮(dermis)的胶原(collagen)和弹性蛋白(elastin)分别由称为胶原纤维和弹性纤维的蛋白质构成，它们是组成真皮结缔组织的主要成分，是决定皮肤抗拉强度的重要构成成分。健康皮肤中的胶原和成纤维细胞通过相互作用发挥极强的收缩力，从而维持皮肤的紧绷和弹性。但是随着年龄的增加，出现成纤维细胞不健康或者胶原质量下降、两者间的附着点不牢固等情况时，维持皮肤紧绷的力降低，皮肤收缩性降低，失去弹性，从而会成为形成皱纹。皮肤弹性的核心要素是真皮胶原和成纤维细胞间的相互作用及结合力，目前采用胶原凝胶收缩分析方法(collagen gel contraction assay, ExperimentalDermatology, 17，788-789 (胶原凝胶收缩分析方法，实验皮肤病学，17，788-789))测定胶原与成纤维细胞的相互作用。具体地说是将成纤维细胞和胶原混合制备成凝胶，在普通培养皿中培养后，比较各凝胶的收缩程度，从而观察因物质处理引起的胶原和成纤维细胞相互作用的变化，并利用数字图像(照片)计算各凝胶的表面积，以此评价皮肤弹性度。但是，此类方法只能显示二维结果，具有以下缺点:不能以三维或更加富有视觉性的方式显示实际皮肤中所发生的变化。
发明内容
本发明要解决的技术问题本发明人利用培养插入体(culture insert),制备了以三维形态构建的真皮类似物，并确认了通过观察物质处理后上述真皮类似物的构造坍塌程度，可预测实际皮肤中发生的变化，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供一种能够以三维方式评价皮肤弹性增强效果的方法。技术方案为实现上述目的，本发明提供一种利用真皮类似物的皮肤弹性增强能力评价方法。所述方法包括以下步骤:a)使胶原和糖进行反应获得糖化胶原对照组；以及使胶原、糖和需要评价皮肤弹性增强能力的候选物质进行反应获得糖化胶原实验组；使所述对照组和实验组分别与成纤维细胞混合，从而制备凝胶山)利用培养插入体构建三维形态；c)在所述步骤b)的培养插入体内部分别加入步骤a)中制备的对照组及实验组的凝胶并培养，从而制备真皮类似物；d)将制备的类似物形态以三维方式图像化 '及e)根据所述d)的图像化结果评价弹性变化。并且，本发明提供一种对增强皮肤弹性的化妆品原料进行筛选的方法，所述方法利用所述皮肤弹性增强能力评价方法。有益效果本发明利用真皮类似物，可通过三维图像评价因物质处理而引起的真皮类似物坍塌程度，不仅观察因物质处理而引起的成纤维细胞和胶原纤维的结合力及相互作用的变化，还可预测上述变化在实际皮肤中可能引起的变化，能够以富有视觉性的方式显示皮肤弹性降低、下垂等现象。此外，采用本发明的评价方法，还可容易地筛选出能增强皮肤弹性的广品。
图1通过HE染色照片示出了本发明的真皮类似物截面图。图2示出了采用目前胶原凝胶收缩分析方法及依据本发明真皮类似物评价方法时的结果。图3示出了采用依据本发明的真皮类似物评价皮肤弹性增强功能的结果。本发明的优选实施方式本发明涉及一种能够以富有视觉性的方式表现化妆品引起的皮肤弹性增强能力的方法，该方法是利用真皮类似物，以三维方式显示皮肤弹性的变化实现的。利用本发明的真皮类似物，评价皮肤弹性增强能力的方法包含以下步骤:a)使胶原和糖进行反应获得糖化胶原对照组；以及使胶原、糖和需要评价皮肤弹性增强能力的候选物质进行反应获得糖化胶原实验组；使所述对照组和实验组分别与成纤维细胞混合，从而制备凝胶；b)利用培养插入体构建三维形态；c)在所述步骤b)的培养插入体内部分别加入步骤a)中制备的对照组及实验组的凝胶并培养，从而制备真皮类似物；d)将制备的类似物形态以三维方式图像化 '及e)根据所述d)的图像化结果评价弹性变化。胶原凝胶收缩分析方法作为现有的评价方法，是将成纤维细胞和胶原混合制备成凝胶后，在普通培养皿中培养，从而制备成胶原凝胶，在制备过程中胶原凝胶处于漂在培养基中的状态。与此相反，依据本发明的评价方法与现有方法的差别在于，本发明利用培养插入体构建三维形态后，将胶原凝胶附着在培养插入体内部，而非普通培养皿中。在培养过程中发生因成纤维细胞而引起的真皮重构(dermal remodeling)。真皮重构过程是成纤维细胞通过与胶原纤维结合，调节胶原纤维的排列，从结构性方面使真皮类似物稳定的过程。图1示出了以上述方法制备的真皮类似物的截面图。图1的照片采用HE (苏木精-曙红)染色，根据图片可知本发明的真皮类似物通过依据成纤维细胞的真皮重构过程，成纤维细胞在胶原蛋白基质中形成了与实际真皮层一样的网状结构。因此可确定本发明的真皮类似物与实际真皮在构造上非常类似。本发明中为制备真皮类似物，通过使胶原和糖反进行应后诱导胶原糖化(glycation),从而制备胶原凝胶。皮肤老化会引起胶原的糖化,这会降低胶原与成纤维细胞的结合，使皮肤弹性降低，引起皮肤下垂现象。因此，本发明为了制备弹性降低的真皮类似物，诱导了实际皮肤中发生的胶原的糖化。胶原糖化后，由于附着在胶原上的糖，因此不能顺利进行真皮重构过程，因此用糖化的胶原制备的真皮类似物在结构上不稳定。此时，为诱导胶原糖化而采用的糖的种类没有特殊限制，但优选使用核糖。并且，本发明中将需要评价皮肤弹性增强功能的候选物质与糖一同添加并与胶原发生反应，评价候选物质的胶原糖化抑制功能，从而通过此过程评价候选物质的皮肤弹性增强功能。此时，现有的胶原凝胶收缩分析方法提供胶原凝胶的二维结果，通过胶原表面积的变化判断胶原凝胶的收缩程度。而本发明中采用真皮类似物的评价方法可提供三维结果，可根据真皮类似物的体积变化判断真皮类似物的构造坍塌程度。利用本发明真皮类似物的皮肤弹性增强能力评价方法，通过用预计会产生皮肤弹性增强效果的候选物质进行处理，从而能够以富有视觉性的方式显示出上述物质的弹性增强功能并进行评价，因此，可容易地筛选出具有皮肤弹性增强能力的物质。
具体实施例方式以下，将通过实施例详细说明本发明。[参考例I]真皮类似物的制备方法本发明中使用的真皮类似物可由下述方法制备1.在Epi管(Epi tube)中加入40 μ I的IOX P缓冲液{3个DMEM (DMEM细胞培养基(Dulbeccos，s Modified Eagle Medium) (DMEM 粉末，Gibco 公司，美国))、I 个 Ham’sF-12营养成分混合物(F-12粉末，Gibco公司，美国)、4ml抗生素-抗真菌剂(PSF，Gibco公司，美国)加入至400ml灭菌蒸懼水中溶解的溶液}、40 μ I重溶缓冲剂(Reconstitutionbuffer) (IOOml0.05M NaOH 中溶解 2.2g 的 NaHCO3 和 4.77g 的 HEPES 后过滤)、2 μ I 的 5ΜNaOH后充分混匀。2.在上述I中加入320 μ I正常胶原水溶液或糖化的胶原水溶液，用移液管充分混匀。3.在上述2中加入IO4个成纤维细胞(人类新生儿的成纤维细胞，Cascadebiologies公司，美国)，用移液管充分混勻使成纤维细胞在溶液中均勻分布。4.12孔细胞培养板内部装置培养插入体(culture insert, 12mm Transwell 1，康宁公司，美国)，将上述3的混合液加至培养插入体内部，后在37°C条件下反应30分钟，使胶原水溶液凝固。5.待胶原完全凝固后往培养插入体的内部和外部均加入成纤维细胞培养基(M106, Cascade Biologies公司，美国)并培养一晚。之后培养真皮类似物,约培养一周时间且每3天更换一次培养基。在此过程中因成纤维细胞和胶原纤维间的相互作用而发生真皮重构过程。[实施例1]凝胶胶原收缩分析方法和利用真皮类似物的评价方法的比较使胶原和核糖反应，诱导胶原的糖化后分别制备胶原凝胶和真皮类似物，对胶原糖化对皮肤的影响进行评价。具体地说，真皮类似物是以上述参考例I的方法制备的，此过程中参考例I制备方法的步骤2中使用的糖化胶原溶液是利用0，62.5，125及250mM浓度的核糖处理胶原后诱导胶原糖化的。并且，核糖是将D- (_)核糖(Sigma公司，美国)溶于水后用0.2μπι过滤器(Minisart sartorious stedim生物科技公司，德国)精制使用。并且，胶原糖化的具体方法如下。为防止胶原的污染，在洁净台内，在胶原水溶液(将I型胶原(Sigma公司，美国)溶于0.1%的乙酸制备成终浓度为3mg/ml)中添加特定浓度的(62.5、125及250mM) D-(-)核糖，装配到可360度旋转的行星摆转混砂机(rotationmixer)后,在常温下反应3天,从而诱导胶原的糖化。与上述相同的方法完成真皮类似物的培养后，利用外科用手术刀将真皮类似物从培养插入体中分离，放置到细胞培养皿上，观察随时间的变化产生的真皮类似物体积的变化。一般在将真皮类似物从培养插入体中分离后的10分钟左右时进行观察，用DSLR照相机(佳能Kiss Digital N，佳能公司，日本)获得三维图像，以图像中各真皮类似物的高度差异为重点分析图像。从培养池中分离后，随着时间的延长结构稳定的真皮类似物的体积变化不是很大，然而不稳定的真皮类似物会发生坍塌的现象，图像中的高度会降低，从而引起体积减少。因此，图像中真皮类似物的高度与真皮类似物结构的稳定性呈比例。并且为了比较，将与上述相同浓度的核糖处理获得的糖化胶原与成纤维细胞混合，从而获得胶原凝胶，在普通培养皿中培养所获得的胶原凝胶，获取其对应的数码图像照片，实施作为二维方式测定方法的胶原凝胶收缩分析方法。上述两种方法获得的结果如图2所示。图2中I)示出了胶原凝胶无法正常收缩的二维结果。由于经核糖处理后，胶原凝胶无法收缩，因此仿佛向外侧扩张。并且图2中2)显示因胶原的糖化而变弱的真皮类似物未能维持正常的形态，发生变形(坍塌)的结果。此方法通过显示三维方式的结构变化，以视觉性的方式很好地示出了因胶原糖化引起的真皮失去弹性、发生变形并因此引起的坍塌的现象。正如图2显示，现有的胶原凝胶收缩分析方法是以二维方式显示结果，但本发明的方法可以将结果以三维的方式，视觉化显示，因此可更有效地示出实际皮肤中发生的变化。[实施例2]利用真皮类似物的皮肤弹性增强功能评价为筛选对皮肤弹性增强有效果的物质，采用了依据本发明的上述参考例I的真皮类似物。具体地说，在本实验中准备了没有诱导胶原糖化的胶原(正常胶原)；用62.5mM的核糖处理，从而诱导胶原糖化的胶原；用62.5mM的核糖和IOppm生育酹同时处理,从而诱导胶原糖化的胶原；以及用62.5mM的核糖和Ippm 二棕榈酰脯氨酸(DPHP)同时处理，从而诱导胶原糖化的胶原。此过程中的核糖是将D- (_)核糖(Sigma公司，美国)溶于水后用
0.2 μ m过滤器(Minisart sartorious stedim生物科技公司，德国)精制使用。并且，糖化胶原的具体方法如下。为防止胶原的污染，在洁净台内往胶原水溶液(将I型胶原(Sigma公司，美国)溶于0.1%的乙酸制备成终浓度为3mg/ml)中添加D-(-)核糖使其浓度成为62.5mM,并根据需要添加IOppm生育酚或者Ippm DPHP，装配到可360度旋转的行星摆转混砂机后，在常温反应3天，从而诱导胶原的糖化。将用上述方法准备好的胶原和成纤维细胞混合后，将其附着于以三维形态构建的培养插入体(12mm Transwell 康宁公司，美国)内部进行培养，制得真皮类似物。真皮类似物的培养结束后，利用外科用手术刀将真皮类似物从培养分离体重分离，放置到细胞培养皿上，在将真皮类似物从培养插入体中分离后的10分钟左右时进行观察,用DSLR照相机(佳能Kiss Digital N,佳能公司，日本)获得三维图像，以图像中各真皮类似物的高度差异为重点分析图像。各个真皮类似物的三维图像如图3所示。
如图3所示，可确定由于经过核糖处理，真皮类似物形态发生了坍塌。也可确定与公布的抗老化物质(生育酚或DPHP)同时处理时，真皮类似物的坍塌被抑制。如上所述，使用依据本发明的方法时，可对候选物质抑制由皮肤老化引起的胶原糖化，从而增强皮肤弹性的现象容易地进行评价，并进行视觉性地评价，因此可利用本发明有效筛选有助于皮肤弹性增强的物质。
权利要求
1.一种利用真皮类似物的皮肤弹性增强能力评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:a)使胶原和糖进行反应获得糖化胶原对照组；以及使胶原、糖和需要评价皮肤弹性增强能力的候选物质进行反应获得糖化胶原实验组；使所述对照组和实验组分别与成纤维细胞混合，从而制备凝胶；b)利用培养插入体构建三维形态；c)在所述步骤b)的培养插入体内部分别加入步骤a)中制备的对照组及实验组的凝胶并培养，从而制备真皮类似物；d)将制备的类似物形态以三维方式图像化；及e)根据所述步骤d)的图像化结果评价弹性变化。
2.—种对增强皮肤弹性的化妆品原料进行筛选的方法，其特征在于，所述方法利用权利要求I所述的皮肤弹性增强能力评价方法。
全文摘要
本发明涉及一种评价皮肤弹性增强效果的方法，该方法通过制备具有与实际真皮类似构造的真皮类似物后，将真皮类似物变形程度的差异以三维形式可视化的方式实现。
文档编号G01N33/15GK103189743SQ201180052645
公开日2013年7月3日 申请日期2011年10月21日 优先权日2010年10月29日
发明者闵大珍, 罗勇柱, 安顺爱, 金惠景 申请人:株式会社爱茉莉太平洋