专利名称：大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，尤其是一种大鼠ロ服草乌甲素片后測定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。
背景技术：
草乌甲素是ー种强效镇痛剂和抗炎剂，用于治疗慢性疼痛，类风湿性关节炎、骨关节炎等。中国国家食品与药品监瞀管理局(SFDA)已于19世纪80年代，批准BLA肌肉注射剂(0.2 mg/2 mL)、片剂(0.4 mg)和软胶囊(0.4 mg)用于临床使用。但ニ酷-ニ職型乌头属生物碱如BLA的潜在毒性可引起心律失常和强心作用，动物研究中，当使用大剂量BLA 时，毒性作用如呼吸抑制、脑积水和室性心律失常见于报道。鉴于草乌甲素良好的临床疗效以及潜在的心脏毒性等副作用，了解该药物的药代动力学特征，绘制出具有吸收相、峰浓度、分布相和消除相的完整血药浓度曲线，并对该曲线进行非房室模型和房室模型处理，经处理提取的药动学參数用于解释药物的体内命运、指导新药开发以及指导临床合理用药是十分必要的ー项工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大鼠ロ服草乌甲素片后測定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。本发明的大鼠ロ服草乌甲素片药代动力学測定方法，该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠ロ服草乌甲素血药浓度的，其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理；こ醚作为萃取溶剂；液相条件中流动相由O. 1%甲酸水和-O. 1%甲酸甲醇55:45，V/V组成；新乌头碱作为草乌甲素生物样品測定的内标。血浆样品的处理是LC-MS/MS法测定获得高灵敏度的关键过程。常见的血浆样品处理方法包括蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液萃取法。曾尝试采用蛋白沉淀法和固相萃取法，但前者蛋白沉淀不完全，药物定量限过高，后者操作繁琐、回收率与灵敏度均非常低。因此，本发明最终采用相对简便、灵敏和回收率更高的液-液萃取法作为草乌甲素血浆样品的处理方法。在萃取溶剂的选择上，曾采用こ醚-环己烷(4:1)混合溶液、こ醚-正己烷(4:1)混合溶液、こ醚-ニ氯甲烷(4:1)混合溶液以及正己烷作萃取溶剂进行提取，结果表明混合溶剂的提取效率均不如单纯采用こ醚，正己烷的提取效果虽与こ醚相当，但提出的杂质较多。因此，确定こ醚作为萃取溶剂，提取后的样品纯净、回收率高，几乎无杂质干扰。实验中还考察了碱化试剂(pH 9. O的磷酸盐缓冲液)对提取效率的影响，结果表明碱化处理对药物的提取效率无明显作用，故提取过程未作碱化处理。液相条件中流动相由O. 1%甲酸水-O. 1%甲酸甲醇(55:45，V/V)组成，加入甲酸可以促进被分析物的离子化，提高检测的灵敏度。采用C18 50_短柱进行分析，单个样品的分析时间仅为3. 5min，大大增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量样品的的快速，本方法亦可用于临床快速监测患者的血药浓度。内标的选择对于检测的灵敏度和特异性至关重要，理想的内标应为同位素标记物或结构类似物。文献报道草乌甲素血浆样品的測定曾采用酮康唑5、左吡坦6或多潘立酮[i]作为内标，但它们与草乌甲素的结构差别较大，在预实验中发现上述内标无法达到本项目对草乌甲素ロ服血药浓度測定高灵敏度的要求。为此，我们选择与草乌甲素同属“乌头碱类生物碱”结构的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱作为内标进行尝试，发现乌头碱的定量离子对与草乌甲素过于接近，次乌头碱的出峰时间与草乌甲素过于接近，因此选择出峰时间短，响应值高，峰形良好的新乌头碱作为草乌甲素生物样品測定的内标。本发明所建立的草乌甲素血浆样品LC-MS-MS測定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2010年版以及SFDA 2005年颁布、的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。特别指出的是，本測定方法最低定量限达到O. 02ng/ml，远远超出文献报道的最低定量限O. 12ng/ml，可用于动物以及人体ロ服草乌甲素的药代动力学研究。
图I为大鼠肌注不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。图2为大鼠ロ服不同剂量草乌甲素后血药浓度-时间曲线图。图3为草乌甲素静脉注射三室模型示意图。其中，中央室I，还存在快分布相2，分布相3。图4为大鼠静脉注射草乌甲素(O. 02mg/kg)的血药浓度-时间曲线。图5为大鼠ロ服不同剂量草乌甲素混悬液后平均血药浓度-时间曲线。图6为大鼠ロ服药代动力学试验。
具体实施例方式实施例I :草乌甲素大鼠ロ服药代动力学试验。草乌甲素片为O. 4mg规格，毎次I片，I日2-3次，成人体重按照60kg计算，大鼠的给药剂量为人的6倍，则推算大鼠ロ服剂量应为O. 04 mg/kg。预实验按照单倍剂量O. 04mg/kg、5倍剂量O. 2mg/kg、10倍剂量O. 4mg/kg和30倍剂量I. 2mg/kg给予大鼠ロ服，考察血药浓度-吋间曲线具有血管外给药特征的ロ服剂量。草乌甲素肌肉注射剂的规格为O. 2mg/ml，每天I次，与ロ服剂量的換算方式相同，则大鼠的肌注剂量应为O. 02 mg/kg，预实验按照单倍剂量O. 02 mg/kg、2倍剂量O. 04 mg/kg、3倍剂量O. 06 mg/kg和6倍剂量O. 12 mg/kg给予大鼠肌注，考察能获得血管外给药特征的肌注剂量。为了计算草乌甲素ロ服绝对生物利用度，正式药动学试验采用静脉注射作为对照，肌肉注射药动学预实验对静脉注射剂量的设计具有相同的參考价值。一、草乌甲素片大鼠ロ服药代动力学预实验。I、实验方法
取体重约250g的SD大鼠16只，分为8组，每组2只，其中4组肌肉注射草乌甲素溶液，剂量分别为O. 02,0. 04,0. 06和O. 12 mg/kg ;另夕卜4组灌胃草乌甲素混悬液，剂量分别为0.04、0.2、0.4和1.2 mg/kg。大鼠于给药前一天作颈静脉插管手木，术后禁食，自由饮水。给药当天称量体重，根据体重精确计算给药剂量及相应体积。各组大鼠于给药前取空白血。灌胃组于给药后15、30min、l、l. 5、2、3、4、5、6、8、10、12 h取血O. 3ml，肌肉注射组于给药后 10、20、30、45min、l、l. 5、2、3、4、6、8、10 h 取血 O. 3ml，及时补充生理盐水 O. 3ml。血浆于5000rpm离心lOmin，取上层澄清血浆，迅速贮存于_20°C冰箱中待測定。测定大鼠血浆中草乌甲素采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量測定方法。具体为
1.实验药品及仪器 1.1标准品与试剂
试验制剂草乌甲素片，云南昊邦制药有限公司生产，批号110904;
草乌甲素对照品批号=010302，含量98.3%，云南昊邦制药有限公司；
新乌头碱内标110799-200404，中国药品生物制品检定所；
こ醚HPLC级，国药集团化学试剂有限公司；
甲醇HPLC 级，merkoI. 2 仪器
分析天平BT25S, Sartorius , Germany ；
高速离心机H-1650，长沙湘仪离心机仪器有限公司；
超声脱气仪KQ-250DA型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；
涡旋混合器XW — 80A，上海医科大学仪器厂；
LC-MS/MS仪器组成
AB Sciex公司4000Q TRAP串联四级杆-线性离子肼质谱仪；
Agilent 1200 Quaternary Pump ；
工作站Analyst I. 5. I ；
色谱柱Phenomenex Luna C18 (50mmX 2. 00mm, 5Mm)；
保护柱SecurityGuard Cartridges C184X3.0mm。I. 3实验动物
SD大鼠来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。2.实验方法和结果
2.I LC-MS/MS分析条件
色谱条件色谱柱Phenomenex Luna C18 (50mmX 2. 00mm, 5Mm);流动相1% 甲酸水1%甲酸甲醇=55:45 ;流速400μ1/ηι η ;进样体积:5μ1。质谱条件草乌甲素和新乌头碱的离子化采用电喷雾离子源，正离子模式。在Ql扫描模式下，草乌甲素和内标产生了质子化的母离子[Μ+Η]+。在MS/MS谱图中可观察到草乌甲素的主要离子为m/z 645. 2，草乌甲素強度最高的子离子为m/z 552. 6;内标的主要离子为m/z 632. 4,内标最强的子离子为m/z 572.6。2. 2标准溶液的配制 2.2. I草乌甲素标准液配制
精密称定草乌甲素对照品O. 37mg，置IOml量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得草乌甲素标准储备液(I) (37yg/ml)。精量草乌甲素储备液(I) 270μ 1，用甲醇稀释至IOml即得草乌甲素储备液(2)浓度为I μ g/ml ;精密吸取草乌甲素标准储备液(2)适量，用水稀释至草乌甲素系列标准液浓度为O. 2,0. 5、2、10、40、80和200ng/ml，用于血浆标准曲线配制。2.2.2内标工作液配制
精称新乌头碱对照品O. 63mg，置IOml量瓶中，用甲醇定容即得内标贮备液(I) 10. 063mg/ml。精量内标贮备液(1)793μ1，用甲醇稀释至5ml即得内标贮备液(2)浓度为IOyg/ml ;精量内标贮备液(2) 1ml，用甲醇稀释至IOml即得内标液浓度I μ g/ml ;精密吸取内标贮备液(3) O. 1ml，用甲醇稀释至10ml，得内标工作液浓度为10ng/ml。2. 3血浆样品处理方法
将空白血浆自冰箱取出于室温下解冻并恢复至室温，7000rpm离心5min，精密吸取血衆90 μ I,加入内标新乌头碱溶液(10ng/ml)10ml和草乌甲素系列标准溶液IOml,于旋涡混合器上混匀，加入こ醚2ml，混匀，静置分层后吸取こ醚层，于35°C水浴中氮气流吹干，最后 加入流动相IOOml复溶，进样5ml测定浓度。2.4方法专属性
按上述条件测得的典型色谱图，血浆中几乎无内源性杂质及代谢产物，不干扰草乌甲素及内标新乌头碱的測定，方法的专属性符合要求。草乌甲素和内标的保留时间分别约为
2.4 2. 5min 和 L 3 L 4min。2、实验結果
(I)肌注组大鼠分别肌注O. 02 (I倍剂量)、O. 04 (2倍剂量)、O. 06 (3倍剂量)和O. 12mg/kg(6倍剂量)，结果表明大鼠给予O. 02mg/kg单倍剂量肌注即可检测到完整的血药浓度-时间曲线。(2) ロ服组大鼠分别给予I倍剂量O. 04mg/kg、5倍剂量O. 2mg/kg、10倍剂量
0.4mg/kg和30倍剂量I. 2mg/kg灌胃给药，结果表明大鼠给予单倍剂量O. 04mg/kg灌胃即可检测到完整的血药浓度-时间曲线，特别是能够检测到处于消除相末端的血药浓度。大鼠I倍、5倍和30倍剂量ロ服的血药浓度峰值出现在15min，提示草乌甲素ロ服吸收非常迅速，有可能胃部即为最佳吸收部位，因此吸收相的取样点应重新设计，拟为2、5、10 min0ニ、草乌甲素片大鼠ロ服药代动力学研究。I、实验方法
取体重约250g的SD大鼠24只，分为4组，每组6只，其中I组尾静脉注射草乌甲素溶液，剂量为O. 02mg/kg，另外3组分别灌胃草乌甲素混悬液O. 04,0. 12,0. 36mg/kg。大鼠于给药前I天作颈静脉插管手木，术后禁食，自由饮水。给药当天称量体重，根据体重精确计算给药剂量及相应体积，分别于给药前取空白血，于给药后2、5、10、20、30min、l、1.5、2、3、
4、6、8、10取血O. 3ml,及时补充生理盐水O. 3ml。血衆于5000rpm离心IOmin,取上层澄清血浆，迅速贮存于_20°C冰箱中待測定。测定大鼠血浆中草乌甲素采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的高通量測定方法。具体如上述。2、实验結果
(I)大鼠静脉注射草乌甲素的药代动力学分析大鼠尾静脉注射草乌甲素溶液后草乌甲素在血浆中消除迅速，消除半衰期为I. 18 h，清除率为1.86 L/hr/kg，表观分布容积为
1.96 L/kgo
利用Winnolin软件模拟草乌甲素在大鼠体内的房室模型特征，结果表明草乌甲素在体内呈三室模型特征，即除中央室I外，还存在快分布相2和分布相3，拟合的三室模型方程为 C (T) =12. 20*EXP (-19. 61*T) +9. 02*ΕΧΡ (-2. 74*Τ) +5. 08*ΕΧΡ (-0. 77*Τ)。进ー步求算获得三室模型的快分布相半衰期为2. 12 min，分布相半衰期为15. 16min，中央室消除相半衰期为53. 79 min。根据草乌甲素片说明书的描述，大鼠静脉注射草乌甲素的血药浓度-吋间曲线亦呈开放式三室模型，三相的半衰期分别为快分布相半衰期(ら/η)=2. 87min,分布相半衰期(らぶJ =11. 6min,消除相半衰期( 伽)=5h。草乌甲素静脉注射的非房室模型药代动力学參数
权利要求
1.大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法，该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的，其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理；乙醚作为萃取溶剂；液相条件中流动相由0. 1%甲酸水和-0. 1%甲酸甲醇55:45，V/V组成；新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。
全文摘要
大鼠口服草乌甲素片药代动力学测定方法，属于医药技术领域，尤其是一种大鼠口服草乌甲素片后测定其血浆中的草乌甲素浓度的方法。该方法是采用高效液相色谱法-电喷射离子化串联质谱法即HPLC-MS-MS法来检测大鼠口服草乌甲素血药浓度的，其特征在于本方法中血浆样品采用液-液萃取法处理；乙醚作为萃取溶剂；液相条件中流动相由0.1%甲酸水和-0.1%甲酸甲醇(55:45，V/V)组成；新乌头碱作为草乌甲素生物样品测定的内标。本发明所建立的草乌甲素血浆样品LC-MS-MS测定法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到了中国药典2010年版以及SFDA2005年颁布的《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》对生物样品的分析要求。
文档编号G01N30/06GK102662022SQ20121014315
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者李彪 申请人:云南昊邦制药有限公司