专利名称：一种白花益肝排毒颗粒及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种白花益肝排毒颗粒及其制备方法和检测方法，属于中药技术领域。
背景技术：
肝脏是重要的解毒器官，各种毒素经过肝脏的一系列化学反应后，变成无毒或低毒物质。肝脏一旦发生病变，引发肝病，其危害性极大，常见的肝病有乙肝、甲肝、丙肝、肝硬化、脂肪化、肝癌、酒精肝等。因此具有益肝排毒功效的中药制剂能发挥良好作用。申请号为“200410022730. 8”的专利申请公开了一种益肝排毒药物及其制备方法，该制备方法是将11味药材全部用水煎煮提取；经进一步研究发现，该处方中的熟大黄含有的游离羟基蒽醌类物质、五味子中含有的大量联苯环辛烯型木质素成分、泽泻中的有效成分等都是对抗病毒性肝炎的主要活性物质，而用水煎煮时提取率低，没有将这些主要活性物质充分提取出来，从而使得该复方的疗效受到影响。此外，目前对益肝排毒药品还没有一套严格可靠的质量检测标准。如果没有严格的质量标准，得到的产品不能确保其质量，结果必将影响该药物的临床疗效；所以为提高益肝排毒药物的治疗作用，确保用药的安全、有效及产品质量的稳定，制定一个严格可靠的质量标准成为保证药品质量的基本要求。随着现代仪器分析技术的发展，高效液相色谱法、薄层色谱鉴别法等分析方法在药品的质量控制中得到了越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种白花益肝排毒颗粒及其制备方法和检测方法。本发明针对现有技术的不足，对白花益肝排毒颗粒的制备工艺进行了优化，使其对病毒性肝炎的疗效更为显著，并建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。本发明的技术方案一种白花益肝排毒颗粒，它是以白花蛇舌草5 25kg、灵芝2 15kg、黄精I 10kg、黄芪2 15kg、泽泻I 10kg、熟大黄I 10kg、肉苁蓉I 5kg、鳖甲2 15kg、五味子f 10kg、银杏叶f IOkg和甘草f6kg为原料药，提取后加入适量可溶性淀粉和阿斯巴甜，并以80%乙醇为润湿剂制成的。优选的白花益肝排毒颗粒是以白花蛇舌草20kg、灵芝10kg、黄精8kg、黄芪10kg、泽湾8kg、熟大黄8kg、肉灰蓉4kg、鳘甲10kg、五味子8kg、银杏叶8kg和甘草6kg为原料药，提取后加入适量可溶性淀粉和阿斯巴甜，并以80%乙醇为润湿剂制成的。前述白花益肝排毒颗粒的制备方法为将熟大黄、五味子、泽泻药材加6倍量70%乙醇提取3次，每次2h，过滤，醇提液70°C减压浓缩至密度I. 2，稠浸膏于80°C真空减压干燥36h，得干膏，粉碎过筛，得醇提粉末；其余8味原料药与醇提药渣混合加6倍量水浸泡O. 5h，再加6倍量水先煎O. 5h，共计加水12倍量，煎煮三次，煎煮时间分别为3h、3h和Ih，85°C减压浓缩至密度I. 2，80°C减压干燥48h，得干膏，粉碎过筛，得水提粉末；将醇提粉末和水提粉末混合，按I : I的重量比例加入辅料可溶性淀粉和O. 2%阿斯巴甜做甜味剂，以80%乙醇做润湿剂，湿法制粒，颗粒75°C干燥4-6h，整粒，过筛，包装，即得。前述白花益肝排毒颗粒的检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中鉴别是对制剂中的银杏叶、甘草、大黄、五味子的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法分别测定制剂中大黄所含总游离蒽醌类成分和五味子所含五味子醇甲的含量。银杏叶的鉴别方法是以银杏叶对照药材为对照，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 3 1 1为展开剂的薄层色谱法；甘草的鉴别方法是以甘草对照药材和甘草酸铵对照品为对照，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15 1 1 :2为展开剂的薄层色谱法；大黄的鉴别方法是 以大黄对照药材为对照，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法；五味子的鉴别方法是以五味子对照药材和五味子甲素对照品为对照，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法。具体鉴别方法为(I)银杏叶的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加40%甲醇20mL，加热回流30min，放冷，滤过，取滤液IOmL浓缩至2mL，作为供试品溶液；另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 μ L及对照药材溶液6 μ L分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 3 1 :1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；(2)甘草的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加乙醚40mL，加热回流I h，滤过，药渣加甲醇30mL，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，力口甲醇制成每ImL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8 μ L，另吸取上述对照品溶液、对照药材溶液各I 2 μ L，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15:1 I 2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；(3)大黄的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加甲醇20mL，浸泡lh，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水IOmL使溶解，再加盐酸lmL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次萃取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材O. Ig,同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各4μ L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色突光主斑点；(4)五味子的薄层色谱鉴别取本颗粒剂3g，加三氯甲烷20mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取五味子对照药材溶液、五味子甲素对照品溶液各2 μ L和供试品溶液6 μ L分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 :1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。大黄中总游离蒽醌类成分的含量测定方法是以芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酚对照品为对照，以乙腈0. 1%磷酸=58%-85% 42%-15%为流动相的高效液相色谱法；五味子中五味子醇甲的含量测定方 法是以五味子醇甲对照品为对照，以乙腈水=45% 55%为流动相的高效液相色谱法。具体含量测定方法为(I)总游离蒽醌类成分含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，DiamonsilC18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m);以乙腈0. 1% 磷酸=58%_85% 42%-15% 为流动相；流速 I. OmL · HiirT1 ;检测波长为254 nm ;柱温为25°C ;理论塔板数以大黄酚峰计算不低于6000 ；对照品溶液的制备分别精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酚对照品，加甲醇制成每ImL各含O. 0145mg、0. 0277mg、0. 0283mg、0. 0655mg的对照品溶液；供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂O. 6g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，加8%盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加三氯甲烷10mL，加热回流I h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸水层再用三氯甲烷萃取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残余物加甲醇使溶解，转移至IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液5 μ L与供试品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本颗粒剂每袋含大黄以包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的总游离蒽醌类成分计，不得低于4. 9mg ；(2)五味子醇甲含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，DiamonsilC18 (250mmX4. 6mm，5 μ m);乙腈:水=45% :55% 为流动相；流速为 I. O mL .mirT1 ;柱温 25°C;检测波长为250 nm ;理论塔板数以五味子醇甲峰计算不低于2000 ；对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每ImL含五味子醇甲7. 8 μ g的对照品溶液；供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂O. 6g，精密称定，置25mL容量瓶中，加甲醇20mL，在功率250W、频率20HZ条件下超声处理45min后取出，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液10 μ L与供试品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本颗粒剂每袋含五味子以五味子醇甲计，不得低于I. 56mg。本发明所述的检测方法包括性状本制剂为掠揭色颗粒，气方香，味微甜略带Ife ;鉴别(1)银杏叶的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加40%甲醇20mL，加热回流30min,放冷，滤过，取滤液IOmL浓缩至2mL，作为供试品溶液；另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 μ L及对照药材溶液6 μ L，分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 :3 :1 :1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；(2)甘草的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加乙醚40mL，加热回流I h，滤过，药渣加甲醇30mL，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，力口甲醇制成每ImL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8 μ L，另吸取上述对照品溶液、对照药材溶液各I 2 μ L，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15:1 I 2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；(3)大黄的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加甲醇20mL，浸泡lh，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水IOmL使溶解，再加盐酸lmL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次萃取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材O. Ig,同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各4μ L，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色突光主斑点；(4)五味子的薄层色谱鉴别取本颗粒剂3g，加三氯甲烷20mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取五味子对照药材溶液、五味子甲素对照品溶液各2 μ L和供试品溶液6 μ L分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 :1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑
占. 检查应符合《中国药典》2010年版一部附录I C颗粒剂项下有关的各项规定；含量测定(I)总游离蒽醌类成分含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VID高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈0. 1%磷酸=58%-85% 42%-15%为流动相；流速I. O mL · min—1 ;检测波长为254 nm ;柱温为25°C ；理论塔板数以大黄酚峰计算不低于6000 ；对照品溶液的制备分别精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酚对照品对照品，加甲醇制成每ImL各含O. 0145mg、O. 0277mg、O. 0283mg、
O.0655mg的对照品溶液；供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂O. 6g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，加8%盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加三氯甲烷10mL，加热回流I h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸水层再用三氯甲烷萃取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残余物加甲醇使溶解，转移至 IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液5 μ L与供试品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本颗粒剂每袋含大黄以包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的总游离蒽醌类成分计，不得低于4. 9mg ；(2)五味子醇甲含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Diamonsil C18(250mmX 4. 6mm, 5 μ m);乙腈水=45% :55% 为流动相；流速为 I. O mL · mirT1 ;柱温 25°C ;检测波长为250 nm ;理论塔板数以五味子醇甲峰计算不低于2000 ；对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每ImL含五味子醇甲7. 8 μ g的对照品溶液；供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂O. 6g，精密称定，置25mL容量瓶中，加甲醇20mL，在功率250W、频率20HZ条件下超声处理45min后取出，加甲醇至刻度，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液10 μ L与供试品溶液10 μ L，注入高效液相色谱仪，测定，即得；本颗粒剂每袋含五味子以五味子醇甲计，不得低于I. 56mg。白花益肝排毒方由银杏叶、五味子、熟大黄、甘草等11味药组成，具有清热解毒，滋阴潜阳，软坚散结，益气生津功用，该处方在经验方基础上，以辨病与辨证相结合，通过补益肝体、软坚散结、调畅肝用、防止传变、利胆退黄等多个环节，用于治疗湿热蕴久成毒，结于肝胆的各种肝炎，如病毒性肝炎、慢性乙肝、丙型肝炎、黄疸型肝炎等，疗效显著。白花益肝排毒方由11味药材组成，药物组成较多，化学成分较复杂。大量文献表明，处方中的熟大黄含有的游离羟基蒽醌类物质、五味子中含有的大量联苯环辛烯型木质素成分(五味子素、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙等)、泽泻中有效成分等都是对抗病毒性肝炎的主要活性物质，用水煎时提取率低，故通过查阅文献综合考虑采用醇提。根据该处方在临床使用的情况，查阅文献发现该方其余8味药材所含的有效成分均具有较好的水溶性，宜采用水提。
发明人根据11味药材的化学成分与临床疗效结合，设计了 4种不同的提取方案。方案一将11味药材组合用蒸馏水煎煮三次，第一次按总量加6倍量纯净水浸泡30min，加热煮沸2h，得煎煮液备用；第二次加4倍量纯净水，加热煮沸I. 5h得煎煮液备用；第三次加2倍量纯净水，加热煮沸45min得煎煮液备用；合并三次煎煮液，静置4_6h，过200目筛，溶液加热蒸发浓缩至稠膏状，60°C减压干燥，得干膏，粉碎，即得。方案二 将熟大黄、五味子、泽泻三味药采用乙醇回流法，第一次按总量加9倍量70%乙醇浸泡30min，回流提取I. 5h，得醇提液备用；第二次加7倍量70%乙醇，回流提取Ih得醇提液备用；第三次加5倍量70%乙醇，回流提取O. 5h得醇提液备用；合并三次醇提液，浓缩，干燥，粉碎得粉末。其余8味药材与醇提药渣混合，按“方案一”加水煎煮，60°C减压干燥，得干膏，粉碎，与醇提粉末混合，即得。方案三熟大黄、五味子、泽泻三味药采用乙醇回流法，方法同“方案二”，合并三次醇提液，浓缩，干燥，粉碎得粉末。其余8味药材与醇提药渣混合，按“方案一”水提，合并三 次煎煮液，浓缩至一定密度，加6倍量80%乙醇，静置24h，过200目筛，溶液加热蒸发至稠膏状，60°C减压干燥，得干膏，粉碎，与醇提粉末混合，即得。方案四11味药材组合用蒸馏水煎煮三次，第一次按总量加9倍量纯净水浸泡30min，加热煮沸2h，得煎煮液备用；第二次加7倍量纯净水，加热煮沸I. 5h得煎煮液备用；第三次加5倍量纯净水，加热煮沸45min得煎煮液备用；合并三次煎煮液，浓缩至一定密度，加6倍量80%乙醇，静置24h，用200目筛过滤，溶液加热蒸发至稠膏状，60°C减压干燥，得干膏，粉碎，即得。通过将四种不同的提取方案提取的白花益肝排毒复方对CCl4所致的急性肝损伤小鼠血清AST、ALT的影响与正常对照组比较，优选最佳提取工艺。实验结果表明4个不同提取方案的白花益肝排毒复方对抑制AST及ALT升高(P〈0. 05)的程度不同(方案二 >方案三 > 方案一 > 方案四)。比较了处方醇沉前后对O. 5%CCL4致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST含量的影响，方案四该处方11味药经过水提醇沉的复方基本没有抑制AST、ALT的作用，而方案三3味药材醇提，药渣与其他8味药材水提后醇沉复方对小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的影响，虽能看出高剂量有显著的抑制作用，但低剂量却没有降低的趋向。据文献报道该处方11味药材中具有保肝、抗免疫作用的多糖等有效成分在醇沉的过程中被去除，从而造成该复方的疗效受影响，也再一次证明水提醇沉法并不是中药最理想的提取分离方法。而本实验根据该处方药材的化学成分并结合临床疗效的方案二对O. 5%CCL4致小鼠急性肝损伤血清的ALT、AST含量表现出极为显著的影响。因此，结合上述药理实验研究，筛选出最佳提取方案为熟大黄、五味子、泽泻三味药材醇提，药渣与其余8味药材合并水提，浓缩，干燥，粉碎得干膏粉，加入辅料制粒，干燥，整粒，即得白花益肝排毒颗粒。另外，为了确保本发明检测方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。(一)鉴别I、仪器与试药仪器采用超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份)、电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司DHG9070A)和ZF三用紫外分析仪；试剂均为分析纯，薄层层析用硅胶为化学纯。2、鉴别方法与结果(I)大黄的薄层色谱鉴别方法本试验基本参照《中国药典》2010版一部中大黄的薄层色谱鉴别方法，取三批样品颗粒(批号20111201、20111202、20111203)各4g，缺大黄的粉末约2g，各加甲醇20mL，浸泡Ih,滤过,取滤液5mL,蒸干,残洛加水IOmL使溶解,再加盐酸ImL,加热回流30min,立即冷却，用乙醚分2次萃取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为3份供试品溶液和I份阴性溶液；另取大黄对照药材O. Ig,同法制成I份对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、阴性溶液、对照药材溶液 各4μ L,分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的娃胶H薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 :1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点。经多次试验，方法灵敏，重复性好，方便可行，阴性液无干扰，结果见
图1，其中，I :大黄对照药材，2 :批号为20111201的供试品溶液，3 :批号为20111202的供试品溶液，4 :批号为20111203的供试品溶液，5 :缺大黄阴性溶液。故将其列入本发明检测项目。(2)五味子的薄层色谱鉴别方法本试验基本参照《中国药典》2010版一部中五味子的薄层色谱鉴别方法，取三批样品(批号20111201、20111202、20111203)颗粒各3g，缺五味子的阴性粉末约2g，各加三氯甲烷20mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为3份供试品溶液和I份阴性溶液；另取五味子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取五味子对照药材溶液、五味子甲素对照品溶液各2 μ L和供试品溶液、阴性溶液各6 μ L分别点于同一娃胶GF254薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。经多次试验，方法灵敏，重复性好，方便可行，阴性液无干扰，结果见图2，其中，I :五味子甲素对照品溶液，2 :五味子对照药材溶液，3 :批号为20111201的供试品溶液，4 :批号为20111202的供试品溶液，5 批号为20111203的供试品溶液，6 :缺五味子阴性溶液。故将其列入本发明检测项目。(3)甘草的薄层色谱鉴别方法本试验基本参照《中国药典》2010版一部中甘草的薄层色谱鉴别方法，取三批样品(批号20111201,20111202,20111203)颗粒各4g，缺甘草的粉末约2g，各加乙醚40mL，加热回流I h，滤过，药渣加甲醇30mL，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为3份供试品溶液和I份阴性溶液；另取甘草对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每ImL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、阴性溶液各8 μ L，另吸取上述对照品溶液、对照药材溶液各I 2 μ L，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15 1 1 :2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，阴性无干扰。经多次试验，方法灵敏，重复性好，方便可行，阴性液无干扰，结果见图3，其中，I :甘草酸铵对照品溶液，2 :甘草对照药材溶液，3 :批号为20111201的供试品溶液，4 :批号为20111202的供试品溶液，5 :批号为20111203的供试品溶液，6 :缺甘草阴性溶液。故将其列入本发明检测项目。(4)银杏叶的 薄层色谱鉴别方法本试验基本参照《中国药典》2010版一部中银杏叶的薄层色谱鉴别方法，取三批样品(批号20111201,20111202,20111203)颗粒4g，缺银杏叶的粉末约2g，各加40%甲醇20mL,加热回流30min，放冷，滤过，取滤液IOmL浓缩至2mL，作为3份供试品溶液和I份阴性溶液；另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、阴性溶液各10 μ L及对照药材溶液6 μ L，分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 3 1 1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，阴性无干扰。经多次试验，方法灵敏，重复性好，方便可行，阴性液无干扰，结果见图4，其中，I :银杏叶对照药材溶液，2 :批号为20111201的供试品溶液，3 :批号为20111202的供试品溶液，4 :批号为20111203的供试品溶液，5 :缺银杏叶阴性溶液。故将其列入本发明检测项目。(二)检查I、粒度检查粒度测定法参照《中国药典》2010年版一部附录XI B第二法测定。取本品颗粒剂5袋，称定重量，置规定的药筛内过筛，保持水平状态，左右往返轻轻筛动3min。取不能通过一号筛与能通过五号筛的总和称定重量，计算所占百分比。经检测三批样品均少于15%，符合规定，结果见表I。表I三批样品粒度检查
批号__
201112014.3%
20IU2024.7%
201112034.8%2、装量差异检查取本品颗粒剂10袋，分别称定每袋内容物的重量，每袋装量与标示量相比较，不得超出标示量的±10%，经测定三批样品均符合规定，结果见表2。表2三批样品装量差异检查
权利要求
1.一种白花益肝排毒颗粒，其特征在于它是以白花蛇舌草5 25kg、灵芝f 15kg、黄精I 10kg、黄芪2 15kg、泽泻I 10kg、熟大黄I 10kg、肉苁蓉I 5kg、鳖甲2 15kg、五味子f 10kg、银杏叶f IOkg和甘草f 6kg为原料药，提取后加入适量可溶性淀粉和阿斯巴甜，并以80%乙醇为润湿剂制成的。
2.根据权利要求I所述的白花益肝排毒颗粒，其特征在于它是以白花蛇舌草20kg、灵芝10kg、黄精8kg、黄苗10kg、泽湾8kg、熟大黄8kg、肉灰蓉4kg、鳘甲10kg、五味子8kg、银杏叶8kg和甘草6kg为原料药，提取后加入适量可溶性淀粉和阿斯巴甜，并以80%乙醇为润湿剂制成的。
3.如权利要求1-2中任一项所述的白花益肝排毒颗粒的制备方法，其特征在于将熟大黄、五味子、泽泻药材加6倍量70%乙醇提取3次，每次2h，过滤，醇提液70°C减压浓缩至密度I. 2，稠浸膏于80°C真空减压干燥36h，得干膏，粉碎过筛，得醇提粉末；其余8味原料药与醇提药渣混合加6倍量水浸泡0. 5h，再加6倍量水先煎0. 5h，共计加水12倍量，煎煮三次，煎煮时间分别为3h、3h和lh，85°C减压浓缩至密度1.2，801减压干燥481!，得干膏，粉碎过筛，得水提粉末；将醇提粉末和水提粉末混合，按I : I的重量比例加入辅料可溶性淀粉和0. 2%阿斯巴甜做甜味剂，以80%乙醇做润湿剂，湿法制粒，颗粒75°C干燥4-6h，整粒，过筛，包装，即得。
4.如权利要求I或2所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于所述的检测方法包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中鉴别是对制剂中的银杏叶、甘草、大黄、五味子的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法分别测定制剂中大黄所含总游离蒽醌类成分和五味子所含五味子醇甲的含量。
5.根据权利要求4所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于银杏叶的鉴别方法是以银杏叶对照药材为对照，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 :3 :1 :1为展开剂的薄层色谱法；甘草的鉴别方法是以甘草对照药材和甘草酸铵对照品为对照，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15 1 1 2为展开剂的薄层色谱法；大黄的鉴别方法是以大黄对照药材为对照，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法；五味子的鉴别方法是以五味子对照药材和五味子甲素对照品为对照，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂的薄层色谱法。
6.根据权利要求4或5所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于具体鉴别方法为 (1)银杏叶的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加40%甲醇20mL，加热回流30min，放冷，滤过，取滤液IOmL浓缩至2mL，作为供试品溶液；另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 及对照药材溶液6 y L，分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 3 1 :1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点； (2)甘草的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加乙醚40mL，加热回流Ih，滤过，药渣加甲醇30mL，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL,合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每ImL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8 u L，另吸取上述对照品溶液、对照药材溶液各I 2 ii L，分别点于同一用.1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15 :1 :1 :2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点； (3)大黄的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加甲醇20mL，浸泡lh，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水IOmL使溶解，再加盐酸lmL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次萃取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0. lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各4yL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点； (4)五味子的薄层色谱鉴别取本颗粒剂3g，加三氯甲烷20mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取五味子对照药材溶液、五味子甲素对照品溶液各2 u L和供试品溶液6 u L分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 :5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
7.根据权利要求4所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于大黄中总游离蒽醌类成分的含量测定方法是以芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酚对照品为对照，以乙腈0. 1%磷酸=58%-85% 42%-15%为流动相的高效液相色谱法；五味子中五味子醇甲的含量测定方法是以五味子醇甲对照品为对照，以乙腈水=45% 55%为流动相的高效液相色谱法。
8.根据权利要求4或7所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于具体含量测定方法为 (I)总游离蒽醌类成分含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈0. 1%磷酸=58%-85% 42%-15%为流动相；流速1.0 mL min—1 ;检测波长为254 nm ;柱温为25 °C ;理论塔板数以大黄酚峰计算不低于6000 ； 对照品溶液的制备分别精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酹对照品，加甲醇制成每ImL各含0. 0145mg、0. 0277mg、0. 0283mg、0. 0655mg的对照品溶液； 供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂0. 6g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，加8%盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加三氯甲烷10mL，加热回流I h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸水层再用三氯甲烷萃取4次，每次IOmL,合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残余物加甲醇使溶解，转移至IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液； 测定法分别精密吸取对照品溶液5 u L与供试品溶液10 u L，注入高效液相色谱仪，测定，即得； 本颗粒剂每袋含大黄以包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的总游离蒽醌类成分计，不得低于4. 9mg ； (2)五味子醇甲含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈水=45% 55% 为流动相；流速为I. 0 mL HiirT1 ;柱温25°C ;检测波长为250 nm ;理论塔板数以五味子醇 甲峰计算不低于2000 ； 对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每ImL含五味子醇甲.7.8ug的对照品溶液； 供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂0. 6g，精密称定，置25mL容量瓶中，力口甲醇20mL，超声处理45min后取出，加甲醇至刻度，摇勻，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液10 y L与供试品溶液10 u L，注入高效液相色谱仪，测定，即得； 本颗粒剂每袋含五味子以五味子醇甲计，不得低于I. 56mg。
9.根据权利要求4、5或7所述的白花益肝排毒颗粒的检测方法，其特征在于所述的检测方法包括 性状本制剂为棕褐色颗粒，气芳香，味微甜略带酸； 鉴别(I)银杏叶的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加40%甲醇20mL，加热回流30min，放冷，滤过，取滤液IOmL浓缩至2mL，作为供试品溶液；另取银杏叶对照药材lg，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10 y L及对照药材溶液6 y L，分别点于同一含4%醋酸钠的羧甲基纤维素钠溶液为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水=5 :3 :1 :1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点； (2)甘草的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加乙醚40mL，加热回流I h，滤过，药渣加甲醇30mL，加热回流lh，滤过，滤液蒸干，残渣加水40mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20mL,合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5mL使溶解，作为供试品溶液；另取甘草对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每ImL含2mg的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8 u L，另吸取上述对照品溶液、对照药材溶液各I 2 ii L，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水=15 :1 :1 :2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；(3)大黄的薄层色谱鉴别取本颗粒剂4g，加甲醇20mL，浸泡lh，滤过，取滤液5mL，蒸干，残渣加水IOmL使溶解，再加盐酸lmL，加热回流30min，立即冷却，用乙醚分2次萃取，每次20mL，合 并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0. Ig,同法制成对照药材溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各4yL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 5 1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点； (4)五味子的薄层色谱鉴别取本颗粒剂3g，加三氯甲烷20mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷ImL使溶解，作为供试品溶液；另取五味子对照药材lg，同法制成对照药材溶液；再取五味子甲素对照品，加三氯甲烷制成每ImL含Img的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》一部附录VI B薄层色谱法试验，吸取五味子对照药材溶液、五味子甲素对照品溶液各2 u L和供试品溶液6 u L分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以30 60°C石油醚-甲酸乙酯-甲酸=15 :5:1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； 检查应符合《中国药典》2010年版一部附录I C颗粒剂项下有关的各项规定； 含量测定(I)总游离蒽醌类成分含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈0. 1%磷酸=58%-85% 42%-15%为流动相；流速1.0 mL min—1 ;检测波长为254 nm ;柱温为25 °C ;理论塔板数以大黄酚峰计算不低于6000 ； 对照品溶液的制备分别精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品和大黄酹对照品，加甲醇制成每ImL各含0. 0145mg、0. 0277mg、0. 0283mg、0. 0655mg的对照品溶液； 供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂0. 6g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，加8%盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加三氯甲烷10mL，加热回流I h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸水层再用三氯甲烷萃取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残余物加甲醇使溶解，转移至IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液； 测定法分别精密吸取对照品溶液5 u L与供试品溶液10 u L，注入高效液相色谱仪，测定，即得； 本颗粒剂每袋含大黄以包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚的总游离蒽醌类成分计，不得低于4. 9mg ； (2)五味子醇甲含量测定参照2010版《中国药典》一部附录VI D高效液相色谱法测定 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈水=45% 55%为流动相；流速为I. 0 mL HiirT1 ;柱温25°C ;检测波长为250 nm ;理论塔板数以五味子醇甲峰计算不低于2000 ； 对照品溶液的制备精密称取五味子醇甲对照品，加甲醇制成每ImL含五味子醇甲.7.8ug的对照品溶液； 供试品溶液的制备取装量差异项下的本颗粒剂0. 6g，精密称定，置25mL容量瓶中，力口甲醇20mL，超声处理45min后取出，加甲醇至刻度，摇勻，取续滤液，即得供试品溶液；测定法分别精密吸取对照品溶液10 y L与供试品溶液10 u L，注入高效液相色谱仪，测定，即得； 本颗粒剂每袋含五味子以五味子醇甲计，不得低于I. 56mg。
全文摘要
本发明提供了一种白花益肝排毒颗粒及其制备方法和检测方法，所述白花益肝排毒颗粒是以白花蛇舌草5~25kg、灵芝2~15kg、黄精1~10kg、黄芪2~15kg、泽泻1~10kg、熟大黄1~10kg、肉苁蓉1~5kg、鳖甲2~15kg、五味子1~10kg、银杏叶1~10kg和甘草1~6kg为原料药，提取后加入适量可溶性淀粉和阿斯巴甜，并以80%乙醇为润湿剂制成的。本发明针对现有技术的不足，对白花益肝排毒颗粒的制备工艺进行了优化，使其对病毒性肝炎的疗效更为显著，并建立了系统的、完整的、有效的成分鉴别和含量测定方法，可有效控制该药品的质量，从而确保其临床疗效。
文档编号G01N30/02GK102698083SQ20121022807
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者张欣, 王祥培, 靳凤云 申请人:贵阳中医学院