专利名称：一种检测面粉中过氧化钙的酶-比色法的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测中过氧化钙的检测，尤其是涉及酶-比色法检测面粉中掺加的过氧化钙。
背景技术：
过氧化钙是一种常见的化工原料，淡黄色结晶粉末，分子量72. 08，广泛用于食品、化工、纺织等行业。在食品行业，常用来改善小麦粉的后熟、面粉增白、麦粉增筋剂、面粉脱色剂、面包改良剂、食用油漂白等领域。为了增加小麦粉的筋道和口感，面粉行业普遍加入过氧化苯甲酰、过氧化钙作为小麦粉增筋剂、增白剂。我国自2011年5月I日起，禁止在面粉生产中添加过氧化苯甲酰、过氧化钙[卫生部等七部(局)发布《关于撤销食品添加剂过氧化苯甲酰、过氧化钙的公告》(2011年第4号)]。欧盟已经禁止过氧化苯甲酰、过氧化钙的添加，美国、加拿大、日本等地还允许添加，如美国过氧化钙最大允许添加量为45mg/kg。·面团改良剂也经常含有过氧化钙。将过氧化钙添加到面粉中，长期食用可能会致癌，对人体健康会产生很大的危害。而有些面粉生产厂家为了面粉脱色、加快面粉的熟化，可能违规滥加过氧化苯甲酰或过氧化钙。现有的国家标准、行业标准和公开文献中，未发现有测定面粉中过氧化钙的方法。因此，十分需要建立一个准确可行的面粉中过氧化钙的检测方法。一般过氧化钙主含量的测定有高锰酸钾滴定法，然而，由于面粉基质干扰大，该方法不能直接用于面粉中过氧化I丐的测定。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)可以催化过氧化氢参与的多种还原剂的氧化反应，常用的HRP底物有无色的苯胺类和苯酚类衍生物，通过过氧化物酶催化过氧化氢氧化这些底物，生成有颜色的醌式或偶氮类物质，可以用光度法、荧光法测定。辣根过氧化物酶与其它酶的耦合常用于食品中某些成分的分析，如糊精、淀粉、蔗糖、葡萄糖等，但未发现HRP应用于过氧化物检测的报道。本发明建立了一种检测面粉中过氧化钙的酶-比色法，该方法快速、准确、有效，有利于政府质检部门对面粉行业产品的监管，以及检测机构对面粉的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定面粉中过氧化钙的方法。为此，本发明采用下述技术方案(I)称取O. 5-2. 5g样品于50mL离心管中，加入10_20mL有机溶剂提取，目的是除去其他过氧化物的干扰(如过氧化苯甲酰)，润旋混勻，8000rpm-12000rpm离心5min,弃去
上清液。(2)剩余样品经5-20mL0. 2_1%稀酸转移至50mL比色管中，进行酸化，涡旋混匀，室温下振荡反应10-20min。(3)然后加入稀碱溶液调节溶液pH值到6. 5-8. 0，定容。(4)将上述溶液转移至50mL离心管中，IOOOOrpm高速离心分离5min，得上清液；
(5)取10-20mL上清液加入过氧化物酶试剂溶液l_3mL，30_4(TC恒温水浴显色10-20min,冷却至室温，定容至25_50mL。(6)在波长505nm处测定吸光度。步骤(I)中所用的有机溶剂，为丙酮。步骤(2)中所用的稀酸，为稀盐酸或稀硫酸，优选稀硫酸。步骤(2)中所用的稀酸的 质量浓度为O. 2-1% ;所用的烯酸的体积为5_20mL。步骤⑶中所用的稀碱溶液,为20%和O. I %稀氢氧化钠或氢氧化钾溶液,优选稀氢氧化钠。步骤(5)所用的过氧化物酶为所用的过氧化酶为辣根过氧化物酶过氧化物酶试剂溶液由辣根过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚的磷酸盐缓冲液组成。4-氨基安替比林O. 00154mol/L的O. 2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH = 7. 6),0. 022mol/L苯酚溶液，两者的体积比I : I组成混合溶液。将辣根过氧化物酶加入到混合溶液中，轻轻混匀，酶活力10U/mL,4°C下可以保存I个月。样品溶液若不变色，则没有掺加过氧化钙，属于合格的面粉；溶液若有颜色变化，则为掺加有过氧化钙。过氧化苯甲酰也是面粉加工常用的增白剂，属于强氧化剂，遇酸会分解为苯甲酸和过氧化氢。为了避免过氧化苯甲酰的干扰，本方法利用过氧化苯甲酰易溶于丙酮的特点，先利用有机溶剂提取以除去过氧化苯甲酰，然后再检测过氧化钙。
具体实施例方式下面对本发明做进一步详细说明。实施例I :标准曲线配制分析步骤分别称取含70. 6% (已经用高锰酸钾标定)的高纯试剂过氧化钙141. 6mg。加入5mLl%稀硫酸，涡旋混匀反应lOmin。然后滴加20 %稀碱溶液调节pH值到5-6左右，然后用O. I %稀碱溶液调节pH为7. 6。加入二次水定容到100ml，得IOOOmg/L标准储备液。将标准储备液用水稀释10倍，得100mg/L标准中间液。分别取标准中间液O. 25mL、0. 5mL、l. 25mL、2. 5mL、5. 0mL、12. 5mL于50mL比色管中，分别加入过氧化物酶试剂溶液2mL，定容到25mL，水浴37°C恒温显色lOmin，冷却至室温。得系列含lmg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L和50mg/L过氧化I丐标准溶液，同时做试剂空白。在波长505nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，过氧化钙浓度横坐标，绘制标准曲线，标准曲线回归方程Y=23. 39X-0. 031，其中X为过氧化钙浓度，单位mg/L ；Y为吸光度。相关系数R2 = O. 9999。实施例2 分析步骤精确称量某品牌饺子粉2g到50ml离心管中，加入丙酮20ml，涡旋震荡，IOOOOrpm高速离心5min,弃去上清液。剩余样品经201^1%稀酸转移至50mL比色管中，进行酸化，涡旋混匀，在室温下振荡反应20min。用20%和O. I %的氢氧化钠溶液和酸度计调整pH值到7. 6，用二次水定容至刻度，转入50mL离心管，IOOOOrpm高速离心5min。移取20ml上清液到25mL比色管中，加入2mL酶试剂溶液，摇匀，在37°C水浴锅中恒温lOmin，显浅红色，冷却至室温，定容到25mL，在505nm处测定吸光度，用实施例I的标准曲线，计算该样品中过氧化钙含量为70. 5mg/kg。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。·
权利要求
1.一种检测面粉中过氧化钙的酶-比色法，其特征包括如下步骤 (1)样品中加入有机溶剂，涡旋混匀，高速离心，弃去清液； (2)加入稀酸反应，然后加入稀碱溶液调节溶液pH值到6.5-8. O,定容，离心； (3)取上清液，加入过氧化物酶和4-氨基安替比林和苯酚的混合磷酸盐缓冲液，30-40°C恒温水浴显色，定容； (4)在波长505nm处测定吸光度，计算面粉中过氧化钙的含量。
2.根据权利要求书I所述的方法，其特征在于，所用的有机溶剂为丙酮。
3.根据权利要求书I所述的方法，其特征在于，所用的稀酸为稀硫酸或稀盐酸。
4.根据权利要求书I所述的方法，其特征在于，所用的稀酸质量浓度为O.2% -1%，体积为 5-20mL。
5.根据权利要求书I所述的方法，其特征在于，所用的过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
全文摘要
本方法公开了一种检测面粉中过氧化钙的酶-比色法，包括以下步骤样品中加入稀酸反应，然后用稀碱溶液将溶液调节到6.5-8.0，离心，然后加入过氧化物酶、4-氨基安替比林和苯酚的混合磷酸缓冲液，显色，定容，离心后，取上清液在505nm处测定吸光度，计算样品中过氧化钙的含量。本发明的方法简单、快捷、准确、干扰小。
文档编号G01N21/78GK102901710SQ201210355500
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者宋薇 申请人:谱尼测试科技股份有限公司