一种共聚焦光学扫描仪的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种共聚焦光学扫描仪，特别涉及使用CCD、EMCCD、CMOS和sCOMS等面阵检测器作为检测单元的、应用于生物荧光显微成像的共聚焦光学扫描仪。本共聚焦光学扫描仪的主要特征是：微透镜阵列的微透镜与针孔阵列的针孔一一对应，针孔阵列位于微透镜的焦平面；照明样品的激发光和样品发射的荧光经过针孔阵列上的同一个针孔；针孔阵列的针孔呈等距矩阵排列，所有针孔在样品上形成的照明点具有相同的移动速度；扫描振镜具有两个反射面，通过其往复旋转来实现对样品的扫描成像。因此，该共聚焦光学扫描仪具有扫描速度快、零杂散光背景噪声、照明强度均一等优点、易于与检测器曝光同步控制。
【专利说明】一种共聚焦光学扫描仪
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多针孔共聚焦光学扫描仪，特别涉及使用CCD、EMCCD, CMOS和sCOMS等面阵检测器作为检测单元的、应用于显微成像的多针孔共聚焦光学扫描仪。本发明主要应用于生物医学显微成像领域，也可用于材料研究和集成电路芯片检测成像。
【背景技术】
[0002]随着细胞生物学研究的深入，荧光显微镜成像的应用越来越普遍，共聚焦显微成像更是受到广泛的重视。但是，目前的共聚焦成像系统有各种无法克服问题，使系统的性能难以进一步提闻:
[0003]1.单针孔激光共聚焦光学扫描仪的成像速度普遍比较低，在典型的1024X1024像素成像条件下，成像速度小于I赫兹；而且单针孔激光扫描共聚焦显微镜使用光电倍增管作为检测元件，光电转换效率不高，只有30 %所有的量子效率。
[0004]2.转盘共聚焦光学扫描仪利用高速旋转的转盘来驱动等距螺旋排列的针孔扫描对样品。尽管其具有1000赫兹的扫描速度，但位于转盘内径的针孔比位于转盘外径的针孔具有更慢的旋转速度，使得各个针孔对样品的照明时间长短不一，造成照明强度不均匀。而高速旋转的转盘不能实时调节转速，使得对样品的照明与检测器的曝光不能完全同步，给图像带来明暗相间的扫描线，降低了图像质量。
[0005]3.滑块共聚焦扫描仪利用往复滑动的滑块来取得多个针孔扫描样品，由于目前的技术限制无法实现高速扫描，扫描速度最快只有20赫兹。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对目前各种共聚焦光学扫描仪存在的不足之处进行改进，如单点共聚焦激光扫描仪扫描速度慢、灵敏度低；转盘共聚焦扫描仪有亮暗相间的扫描线干扰、照明强度不均一；滑块共聚焦扫描仪扫描速度慢等问题，提供一种新的多针孔共聚焦光学扫描仪，配合荧光显微镜和面阵检测器组成共聚焦成像系统，从而高速地获取高质量的共聚焦图像。
[0007]本发明的目的是通过以下的技术方案实现的:
[0008]如图1所示，本发明提供一种多针孔共聚焦光学扫描仪，主要包括:光源I ;激发滤色片2 ;照明透镜组3 ;微透镜阵列4，其上排列了微透镜4a ;二色分光镜5 ;针孔阵列6，其上排列了针孔6a ;延迟透镜组7 ;扫描振镜8，有第一反射面8a和第二反射面8b ;截止光阑9，分为透光部分9a和不透光部分9b ;全反镜组10 ;成像透镜组11 ;发射滤色片12 ;控制器13 ;其特征在于:
[0009]所述光源I使用激光、发光二极管、汞灯、氙灯和金属卤化物灯中的任意一种或多种作为光源；
[0010]所述激发滤色片2的作用在于，透过所述光源I发射的部分波长的光、反射其它波长的光，得到用于照明样品的激发光；[0011]所述照明透镜组3的作用在于，使所述光源I发射并透过所述激发滤色片2的激发光形成平行光束；
[0012]所述微透镜阵列4位于所述照明透镜组3，并垂直于所述平行光束，其上排列了多个透光的、具有相等焦距的所述微透镜4a，其余部分不透光；所述微透镜4a是圆形或多边形，如三角形、方形、矩形、四边形、五边形和六边形等；所述微透镜是菲涅耳透镜、曲面反射镜、微型凸透镜型微透镜中的一种或多种，且具有相等的焦距；
[0013]所述二色分光镜5位于所述微透镜阵列4和所述针孔阵列6之间，与所述平行光束有45度夹角；
[0014]所述针孔阵列6放置在所述二色分光镜5之后，垂直于所述平行光束，并且位于所述微透镜4a的所述二色分光镜5 —侧的焦平面上；
[0015]所述针孔阵列6上排列了多个透光的所述针孔6a，其余部分不透光；所述针孔6a是圆形或多边形，如三角形、方形、矩形、四边形、五边形和六边形等；
[0016]所述针孔6a为圆形时,所述针孔6a的大小r定义为所述圆形的半径；所述针孔6a为多边形时，所述针孔6a的大小r定义为所述多边形的内切圆的半径；
[0017]所述针孔6a的大小r由显微镜19的物镜15的数值孔径NA、放大倍率Ml、所述延迟透镜组7的放大倍率M2和所述样品16发射荧光的波长λ决定:
[0018]r = 0.61Χ λ+ΝΑΧΜ1ΧΜ2
[0019]如图8所示，所述针孔阵列6上的所述针孔6a按照以下规则排列:当所述扫描振镜8旋转时,所述照明点在所述样品16上移动的方向定义为扫描方向；将平行于所述扫描方向的所述针孔6a的排列定义为行；将垂直于所述扫描方向的所述针孔6a的排列定义为列；每一行的所述针孔6a的数量相等，每一列的所述针孔6a的数量相等，且每一行至少有一个所述针孔6a ;穿过所述针孔6a的中心画平行于所述扫描方向的直线，相邻的两条直线的距离为相邻两行所述针孔6a的行间距，称为I ;穿过所述针孔6a的中心画垂直于扫描方向的直线，相邻的两条直线的距离为相邻两列所述针孔6a的列间距，称为J ;同一行的相邻两个所述针孔6a的中心距离定义为K ;同一列的相邻两个所述针孔6a的中心距离定义为L ;所述针孔6a的排列使1、J、K和L与所述针孔6a的大小r有以下等式关系:
[0020]O < I ^ 2r
[0021]L = nX I,
[0022]K2 = η2 X L2-12
[0023]J2 = L2-12
[0024]η为改变所述针孔6a间距离的系数，I < n ^ 20 ；
[0025]如图9所示，所述微透镜4a和所述针孔6a有相同的排列，经过所述二色分光镜5形成一一对应关系，即所述平行光束被所述微透镜4a分束、汇聚，汇聚的焦点位于所述二色分光镜5后的所述针孔6a的中心；所述平行光束分束透过所述针孔6a后形成多个点光源；
[0026]所述延迟透镜组7对所述针孔阵列6成像，像平面与所述物镜15对所述样品16成像的像平面重合，使所述点光源在所述样品16上形成与所述针孔6a—一对应的照明点；
[0027]所述扫描振镜8围绕固定转轴往复旋转，有两个反射面，即第一反射面8a和第二反射面8b ;第一反射面8a和第二反射面8b是平面反射或凹面反射；当所述第一反射面8a和第二反射面8b是凹面反射时，有相等或不等的焦距；
[0028]所述截止光阑9位于所述样品16经过所述物镜15成像的像平面，分为所述透光部分9a和所述不透光部分9b ；
[0029]所述全反镜组10是平面反射或凹面反射；
[0030]所述成像透镜组11对所述针孔阵列6成像，像平面位于面阵检测器20的感光芯片14上；
[0031]所述发射滤色片12的作用在于，透过所述样品16发射的特定波长的荧光，反射其它波长的光；
[0032]所述控制器13的作用在于:控制所述扫描振镜8的旋转位置、旋转周期，并与所述面阵检测器20进行信号通讯，实现所述扫描振镜8的旋转与所述面阵检测器20的曝光同步控制。
[0033]本发明的优点如下:
[0034]1、本发明由扫描振镜驱动扫描，配合使用CCD、EMCCD、CMOS和sCOMS等高灵敏度面阵检测器，可实现高速、高灵敏度的共聚焦光学成像。
[0035]2、本发明为单一针孔阵列，激发光与荧光经过同一个针孔阵列，安装调节简单。
[0036]3、本发明使用微透镜阵列和针孔阵列双阵列结构，微透镜和针孔一一对应，光源利用率高，无杂散光背景噪声。
[0037]4、本发明的扫描振镜的扫描与面阵检测器的曝光同步，避免扫描不完全造成的图象亮暗不均匀的问题。
[0038]5、本发明对样品的照明强度完全相等，视场照明强度均一。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1:本发明和显微镜及面阵检测器应用的结构示意图
[0040]图2a和2b:本发明的第一种实施例的示意图
[0041]图3:本发明的第二种实施例的示意图
[0042]图4:本发明的第三种实施例的示意图
[0043]图5:本发明的第四种实施例的示意图
[0044]图6:本发明的第五种实施例的示意图
[0045]图7:本发明的第六种实施例的示意图
[0046]图8:本发明的针孔阵列排列方式的示意图
[0047]图9:本发明的圆形针孔阵列和圆形微透镜阵列的示意图
[0048]图面说明:
[0049]1-光源2-激发滤色片3-照明透镜组4-微透镜阵列4a_微透镜5-二色分光镜6-针孔阵列6a-针孔7-延迟透镜组8-扫描振镜8a-扫描振镜第一反射面8b-扫描振镜第二反射面 9-截止光阑 9a-透光部分9b-不透光部分 10-全反镜组
11-成像透镜组12-发射滤色片13-控制器14-感光芯片15-物镜16-样品17-计算机18-计算机显示器19-显微镜20-面阵检测器
【具体实施方式】[0050]下面结合附图和实施例进一步描述本发明。
[0051]实施例1
[0052]图2a和2b是与本发明相关的第一种共聚焦光学扫描仪的示意图，其中，扫描振镜8的第一反射面8a、第二反射面Sb和全反镜组10都是平面反射。
[0053]如图2a，在本实施例中，面阵检测器20 (未画出)开始曝光前，控制器13 (未画出)控制扫描振镜8停留在正向或反向最大旋转角位置；光从光源I发射出，经过激发滤色片
2、照明透镜组3、微透镜阵列4上的微透镜4a、二色分光镜5和针孔阵列6上的针孔6a形成多个激发点光源；激发点光源经延迟透镜组7成像并被扫描振镜8的第一反射面8a反射在截止光阑9的不透光部分％，不能进入显微镜19 (未画出)，在位于物镜15焦平面的样品16上形成照明点。
[0054]如图2b，当面阵检测器20(未画出)开始曝光，控制器13(未画出)控制扫描振镜8从正向或反向最大旋转角位置开始顺时针或逆时针旋转至反向或正向最大旋转角位置，使激发点光源经过截止光阑的透光部分9a得以进入显微镜19 (未画出)，在位于物镜15焦平面的样品16上形成照明点。随着扫描振镜8的旋转，照明点在样品16上移动。当面阵检测器20(未画出)曝光结束时，扫描振镜8刚好旋转至反向或正向最大旋转角位置，样品16被照明一次。
[0055]在样品16上的所有照明点的排列与针孔6a的排列相同，都是等距矩阵排列，并以相同的速度在样品16上移动。所以，面阵检测器20(未画出)曝光时，样品16被完整地、均匀地照明一次；或者，通过控制器13(未画出)控制扫描振镜8的旋转周期，使面阵检测器20(未画出)的曝光时间等于扫描振镜8的旋转周期的整数倍，样品16在面阵检测器20(未画出)曝光时被多次完整地、均匀地照明。
[0056]照明点激发样品16发射的荧光经过物镜15、截止光阑9的透光部分9a、扫描振镜8的第一反射面8a、延迟透镜组7和针孔阵列6的针孔6a被二色分光镜5反射，再经过全反镜组10、成像透镜组11、扫描振镜8的第二反射面8b和发射滤色片12在感光芯片14形成成像点。成像点随着扫描振镜8旋转在感光芯片14上移动，在面阵检测器20(未画出)曝光结束时，感光芯片14获得样品16的完整的荧光信息，并由计算机17 (未画出)处理、在计算机显示器18 (未画出)上显示成图像。由于只有位于物镜15的焦平面的样品16发射的荧光才能经过针孔阵列6的针孔6a、被二色分光镜5反射和透过发射滤色片12到达感光芯片14，所以计算机显示器18(未画出)上显示的图像是样品16的共聚焦图像。
[0057]实施例2
[0058]图3是与本发明相关的第二种共聚焦光学扫描仪的结构示意图，与实施例1的区别具体如下:扫描振镜8的第一反射面8a、第二反射面Sb，以及第一反射面8a与针孔阵列6之间的全反镜10都为凹面反射，可分别替代实施例1的延迟透镜组7和成像透镜组11对针孔阵列6成像，第一反射面8a和第一反射面8a与针孔阵列6之间的全反镜10的成像倍率是M2。因为减少了延迟透镜组7和成像透镜组11，本实施例的光路中具有更少的光学界面，可获得更闻的光效率。
[0059]实施例3
[0060]图4是与本发明相关的第三种共聚焦光学扫描仪的结构示意图，与实施例2的区别具体如下:扫描振镜8的第一反射面8a和全反镜组10为凹面反射、第二反射面Sb为平面反射。
[0061]实施例4
[0062]图5是与本发明相关的第四种共聚焦光学扫描仪的结构示意图，与实施例3的区别具体如下:扫描振镜8的第一反射面8a和第二反射面Sb、全反镜组10都是凹面反射。
[0063]实施例5
[0064]图6是与本发明相关的第五种共聚焦光学扫描仪的结构示意图，与实施例4的区别具体如下:第一反射面8a和第二反射面Sb分别在两个相同的扫描振镜8上，由控制器13同步控制旋转，减少了一片全反镜10。
[0065]实施例6
[0066]图7是与本发明相关的第六种共聚焦光学扫描仪的结构示意图，与实施例1的区别具体如下:增加了成像透镜组11的数量，使感光芯片14记录的图像和物镜15对样品16的成像可实现严格的1:1放大。
【权利要求】
1.一种共聚焦光学扫描仪，通过有两个反射面的扫描振镜反射由光源发射并透过针孔阵列的光，照明位于显微镜物镜焦平面的样品，并通过所述扫描振镜的旋转对所述样品进行扫描，最后由面阵检测器记录所述样品发射并透过所述针孔阵列的荧光，完成共聚焦成像，其特征在于: 有一个所述针孔阵列，其上排列了多个透光的针孔，其余部分不透光； 所述针孔将所述光源发射的光束分成多个点光源，并经过所述扫描振镜的第一反射面反射，在位于所述显微镜物镜焦平面的所述样品上形成多个与所述针孔一一对应的照明点，同时照明所述样品； 所述样品发射的荧光经过所述显微镜物镜后，被所述扫描振镜的第一反射面反射透过所述针孔，再经过所述扫描振镜的第二反射面反射，在所述面阵检测器的感光芯片上形成多个图像点； 所述扫描振镜旋转，使所述照明点以相同的速度在所述样品上移动，实现对所述样品完全的、均匀的照明；同时使所述图像点在所述面阵检测器的感光芯片上移动，得到完整的所述样品的荧光图像，完成共聚焦成像。
2.根据权利要求1所述的一种共聚焦光学扫描仪，在所述光源与所述针孔阵列之间还放置了一个排列了多个微透镜的微透镜阵列，其特征在于:所述针孔阵列位于所述微透镜的焦平面，且所述微透镜阵列的所述微透镜与所述针孔阵列的所述针孔一一对应，即所述光源发射的光束被所述微透镜阵分束、汇聚，汇聚的焦点位于所述针孔的中心，然后透过所述针孔阵列形成所述点光源。
3.根据权利要求2所述的一种共聚焦光学扫描仪，其特征在于:所述微透镜阵列的所述微透镜是菲涅耳透镜、曲面反射镜、微型凸透镜型微透镜中的一种或多种，形状为圆形或多边形，且都具有相等的焦距。
4.根据权利要求1或2所述的一种共聚焦光学扫描仪，其特征在于:所述针孔是圆形或多边形；当所述针孔为圆形时，所述针孔的大小r定义为所述圆形的半径；当所述针孔为多边形时，所述针孔的的大小r定义为所述多边形的内切圆的半径。
5.根据权利要求4所述的一种共聚焦光学扫描仪，其特征在于:所述针孔阵列上的所述针孔按照以下规则排列:当所述扫描振镜旋转时，所述照明点在所述样品上移动的方向定义为扫描方向；将平行于所述扫描方向的所述针孔的排列定义为行，将垂直于所述扫描方向的所述针孔的排列定义为列；每一行的所述针孔的数量相等，每一列的所述针孔的数量相等，且每一行至少有一个所述针孔；穿过所述针孔的中心画平行于所述扫描方向的直线，相邻的两条直线的距离为相邻两行所述针孔的行间距，称为I ;穿过所述针孔的中心画垂直于所述扫描方向的直线，相邻的两条直线的距离为相邻两列所述针孔的列间距，称为J ;同一行的相邻两个所述针孔的中心距离定义为K ;同一列的相邻两个所述针孔的中心距离定义为L ;所述针孔的排列使1、J、K和L与所述针孔的大小！ 有以下等式关系:
O < I ^ 2r
L = nX I,
K2 = η2 X L2-12
J2 = L2-12 η为改变所述针孔间距的系数，I < η < 20。
6.根据权利要求1或2所述的一种共聚焦光学扫描仪,其特征在于:所述扫描振镜的所述第一反射面是平面反射或凹面反射、所述第二反射面是平面反射或凹面反射。
7.根据权利要求6所述的一种共聚焦光学扫描仪,其特征在于:所述第一反射面和所述第二反射面分别在两个扫描振镜上。
8.根据权利要求1或2所述的一种共聚焦光学扫描仪，还包括一片二色分光镜，位于所述光源与所述针孔阵列之间，透过所述光源发射的光，反射所述样品发射的荧光。
9.根据权利要求1或2所述的一种共聚焦光学扫描仪,还包括一个截止光阑,位于所述显微镜物镜对所述样品成像的像平面，其作用在于:当所述扫描振镜旋转至最大角位置时，所述光源发射并透过所述针孔阵列的光被所述截止光阑阻挡，不能进入所述显微镜照明所述样品。
10.根据权利要求1或2所述的一种共聚焦光学扫描仪，还包括一个与所述面阵检测器之间有信号通讯的控制器，由所述控制器控制扫描振镜旋转，使所述面阵检测器的曝光时间等于所述扫描振镜的旋转时间的整数倍，且使所述扫描振镜旋转的启动与所述面阵检测器曝光的启动为同一时刻。`
【文档编号】G01N21/01GK103776769SQ201210398683
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2012年10月19日
【发明者】赖博 申请人:赖博