一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其要点是：首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37℃孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37℃孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37℃孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值，计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪，并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。
【专利说明】—种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物制剂的检测方法，特别是涉及一种利用双抗夹心ELISA原理快速检测乙脑病毒抗原含量、鉴别乙脑疫苗真伪的用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，属于生物【技术领域】。特别适合应用在乙型脑炎疫苗生产企业的质量控制环节。
【背景技术】
[0002]流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起、由蚊虫传播的一种急性传染病。乙脑的病死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。我国是乙脑高流行区，在20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，近年来维持在较低的发病水平。由此可见乙脑疫苗在预防乙脑流行上起着重要作用。而乙脑病毒抗原作为乙脑疫苗的最主要成分，其含量对疫苗质量起到至关重要的作用。
[0003]在现有技术中，国内并没有公开乙脑病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。根据生产企业实际的生产情况，迫切需要能有一种检测乙脑病毒抗原含量的方法，以便有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并用于快速鉴别疫苗真伪。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法。本发明应用ELISA双抗体夹心原理,首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37°C孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37°C孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37°C孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值。计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪。并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。
[0005]本发明给出的技术方案是:这种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤:
[0006](I)兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备
[0007]I)注射抗原制备(乳化)震荡CFA (完全弗氏佐剂)或IFA (不完全弗氏佐剂)，4°C下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射；
[0008]2)免疫程序
[0009]注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照:
[0010]初次免疫
[0011]注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量Iml/点，共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量约0.8mg ；
[0012]加强免疫(间隔一周)
[0013]注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5ml/点，注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量约0.4mg。
[0014]加强免疫(间隔一周)
[0015]注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2ml/点，注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量约0.2mg,
[0016]间隔一周后，心脏采血制备抗血清；
[0017]3)分离血清检测抗体
[0018]将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4°C下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心lOmin，保留上清液，然后对血清中抗体进行检测；
[0019]4)抗血清IgG纯化
[0020]盐析法粗体一硫酸铵沉淀
[0021]4-1在离心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L,pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀，用枪头吸取IOml SAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50%，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4°C过夜，以3000r/min离心IOmin,白蛋白在上清液中,沉淀为球蛋白，弃去上清液,留下沉淀部分；
[0022]4-2将所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS,使溶液的饱和度达35%，加完后4°C放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀；
[0023]4-3将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml 0.02mol/L, pH 7.0磷酸缓冲液中；
[0024]5)蛋白A亲和纯化
[0025]5-1柱平衡:用Binding buffer清洗柱,5-10个体积；
[0026]5-2上样:使用注射器缓慢挤压Iml样品进入柱内；
[0027]5-3清洗:使用Binding buffer清洗柱,5-10个柱体积；
[0028]5-4洗脱:使用Elution buffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分；
[0029]5-5合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/ml和抗体活性；
[0030](2) ELISA方法的建立(方阵滴定)
[0031]将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度(5 μ g/ml, 10 μ g/ml)包被96孔板，200 μ I/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37°C 3小时，然后4°C过夜，取出倒空板，加300 μ I/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37°C I小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于_70°C保存；
[0032]样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度，将预先包被好的酶标板从_70°C冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300 μ I/孔，倒空板，加样200 μ I/孔，空白孔由稀释液代替，用封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ；
[0033]取出板，洗板机清洗5次，洗液300 μ I/孔，加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体(稀释度分别10-410-5)200 μ I/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ；
[0034]取出板，洗板机清洗5次，洗液300 μ I/孔，加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物(稀释度分别10_410_5)200 iil/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育60min ；
[0035]取出板，洗板机清洗6次，洗液300 ill /孔，加0PD显色液，200 yl /孔，室温下避光 反应30min ；
[0036]显色后H2S04终止液，50 u 1/孔，使用酶标仪，并在492nm测定各孔0D值。
[0037](3)具体实验样品检测
[0038]将兔抗乙脑病毒多克隆抗体（浓度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200 yl， 用封口膜封好，置于湿盒中37°C 3小时，然后4°C过夜后取出倒空板，加300 yl/孔封闭液， 再用封口膜封好置于湿盒中37V 1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70°C保存；
[0039]样品以2倍法稀释（64、128、256、512)，将预先包被好的酶标板从_70°C冰箱中取 出，洗板机清洗4次，洗液300 y 1/孔，倒空板，加样200 ii 1/孔，由低稀释度往高稀释度加， 每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37°C 湿盒中鮮育90min ；
[0040]取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300 u 1/孔，将稀释度为10_4的乙脑病毒E蛋 白单克隆抗体加到酶标板上，200 yl/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ；
[0041]取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300 u 1/孔，将稀释度10-5的辣根酶标记山羊 抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200 yl/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育60min ；
[0042]取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300 ill/孔。加入0PD显色液，200 yl/孔，室 温下避光反应30min ；
[0043]显色后加50 u 1/孔终止液，设定相应的空白，酶标仪492nm测定；
[0044]结果判定：
[0045]当阴性对照0D值< 0. 1，阳性对照0D值≤1. 0时，该试验成立；
[0046]若阴性对照平均0D值< 0. 05，按0. 05计算；
[0047]若阴性对照平均0D值> 0. 05，按实际0D值计算；
[0048]当P/N≤2. 1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度；
[0049]其中：P是样品平均0D值 N是阴性对照平均0D值。
[0050]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0051]在现有技术中，国内并没有公开乙脑病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企 业的相关报道。建立此方法可以根据生产企业实际的生产情况，有效的预知成品疫苗的 抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并能快速鉴别疫苗真伪，缩短实验时 间，几小时内出结果，不使用实验动物，节省实验资金，特别适用于快速鉴别疫苗真伪。
【具体实施方式】
[0052]实施例1
[0053]这种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，有以下步骤：
[0054]一兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备
[0055]1.注射抗原制备（乳化）震荡CFA(完全弗氏佐剂）或IFA (不完全弗氏佐剂）。 4°C下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内强力混合。直至乳状剂形成。挤出一滴 至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用。如液滴分散，继续混匀。将配置成的 乳状剂转移至2. 5ml注射器，准备注射。[0056]2免疫程序
[0057]注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照
[0058]初次免疫
[0059]注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量Iml/点。共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量约0.8mg。
[0060]加强免疫(间隔一周)
[0061]注射部位为两肩后侧及两髋附近。为皮下、肌肉注射5点。注射剂量0.5ml/点。注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量约0.4mg。
[0062]加强免疫(间隔一周)
[0063]注射部位为两肩后侧及两髋附近。为皮下、肌肉注射5点。注射剂量0.2ml/点。注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量约0.2mg
[0064]间隔一周后，心脏采血制备抗血清。
[0065]3.分离血清检测抗体
[0066]将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4°C下放置过夜使血块缩小。使用无菌枪头剥离血块。将血清转移至另一新离心管中，3000g离心lOmin，保留上清液。然后对血清中抗体进行检测。(见表1)
[0067]表1:血清中抗体测定结果
[0068]
【权利要求】
1.一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤: (1)兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备 1)注射抗原制备 震荡CFA (完全弗氏佐剂)或IFA (不完全弗氏佐剂)，4°C下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射； 2)免疫程序 注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照: 初次免疫 注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量Iml/点，共注射5ml (使用CFA)注射病毒蛋白量0.8mg ； 加强免疫(间隔一周) 注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5ml/点，注射共2.5ml (使用IFA)注射病毒蛋白量0.4mg ； 加强免疫(间隔一周) 注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2ml/点，注射共Iml (使用IFA)注射病毒蛋白量0.2mg， 间隔一周后，心脏采血制备抗血清； 3)分离血清检测抗体 将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4°C下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心lOmin，保留上清液，然后对血清中抗体进行检测； 4)抗血清IgG纯化 盐析法粗体-硫酸铵沉淀 4-1在离心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L, ρΗ7.0磷酸盐缓冲液，混匀，用枪头吸取IOml SAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50%，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4°C过夜，以3000r/min离心IOmin,白蛋白在上清液中,沉淀为球蛋白，弃去上清液,留下沉淀部分； 4-2将所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L, pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS,使溶液的饱和度达35%，加完后4°C放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀； 4-3将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml0.02mol/L, pH 7.0磷酸缓冲液中； 5)蛋白A亲和纯化 5-1柱平衡:用Bindingbuffer清洗柱，5_10个体积； 5-2上样:使用注射器缓慢挤压Iml样品进入柱内； 5-3清洗:使用Binding buffer清洗柱,5-10个柱体积； 5-4洗脱:使用Elution buffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分； 5-5合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/ml和抗体活性； (2)ELISA方法的建立将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度(Syg/miaOyg/ml)包被96孔板，200 μl/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37°C 3小时，然后4°C过夜，取出倒空板，加300 μl/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37°C l小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于-70°C保存；样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度，将预先包被好的酶标板从_70°C冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300 μl/孔，倒空板，加样200 μl/孔，空白孔由稀释液代替，用封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ； 取出板，洗板机清洗5次，洗液300 μ l/孔，加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体(稀释度分别10_410_5)200 μl/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ； 取出板，洗板机清洗5次，洗液300 μ l/孔，加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物(稀释度分别10_410_5)200 μl/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育60min ； 取出板，洗板机清洗6次，洗液300 μl/孔，加OPD显色液，200 μl/孔，室温下避光反应30min ； 显色后H2SO4终止液，50 μ l/孔，使用酶标仪，并在492nm测定各孔OD值； (3)具体实验样品检测 将兔抗乙脑病毒多克隆抗体(浓度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200 μ 1，用封口膜封好，置于湿盒中37°C 3小时，然后4°C过夜后取出倒空板，加300 μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37°C1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于_70°C保存； 样品以2倍法稀释(64、128、256、512)，将预先包被好的酶标板从-70°C冰箱中取出，洗板机清洗4次，洗液300 μ l/孔，倒空板，加样200 μ l/孔，由低稀释度往高稀释度加，每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ； 取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300 μ I/孔，将稀释度为10_4的乙脑病毒E蛋白单克隆抗体加到酶标板上，200 μ l/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育90min ； 取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300 μ l/孔，将稀释度10_5的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200 μ l/孔，封口膜密封，置于37°C湿盒中孵育60min ； 取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300 μl/孔。加入OPD显色液，200 μ l/孔，室温下避光反应30min ； 显色后加50 μ l/孔终止液，设定相应的空白，酶标仪492nm测定； 结果判定: 当阴性对照OD值≤0.1，阳性对照OD值≥1.0时，该试验成立； 若阴性对照平均OD值≤ 0.05，按0.05计算； 若阴性对照平均OD值> 0.05,按实际OD值计算； 当P/N≥2.1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度； 其中:P是样品平均OD值N是阴性对照平均OD值。
【文档编号】G01N33/569GK103777022SQ201210398684
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】高旭哲, 战辛, 刘畅, 张玥 申请人:辽宁成大生物股份有限公司