用于鉴定小于48小时之前发作的心房纤维性颤动患者的中段前心钠肽(pro-ANP)的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于确定患者从心房纤维性颤动发作至呈现的时间的方法，包括步骤：提供所述患者的体液样品，确定所述样品中proANP(SEQ?ID?NO:1)或其片段的水平，使proANP或其片段的水平与所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间相关联，其中所述片段具有至少6个氨基酸残基长度。
【专利说明】用于鉴定小于48小时之前发作的心房纤维性颤动患者的中段前心钠肽(pro-ANP)
发明领域
[0001]本发明属于临床诊断领域。特别地，本发明涉及确定在源自心房纤维性颤动患者的体液的样品中的中段前心钠肽(MR-proANP)水平。
[0002]发明背景
[0003]心房纤维性颤动(AF)是需要治疗并涉及心脏的两个上室(心房)的最常见心脏心率失常。在美国大约二百二十万名个人并且在欧盟大约四百五十万名个人患有AF(_等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Go 等人，2001.TAMA285:2370-2375)。它也占因心脏节律紊乱而住院的1/3人数(Fuster等人，2006.Circulationl 14: e257_354),并且近年来因 AF 而住院的比率已经上升(Friberg 等 K , 2004.Epidemiologyl4:666-672)。 AF的患病率随年龄而增加，从40-50岁时0.5%至80岁时5-15% (Camm等人，2010.Eur HeartT.31:2369-2429)。心房纤维性颤动的发生率也随年龄而增加。在发达国家中，心房纤维性颤动患者的数目可能下一个50年期间增加，原因在于老年个体的比例增长(Go等人，2001.TAMA285:2370-2375)。
[0004]其名称源自心房的心肌纤维性颤动(即，颤抖)，而非协调收缩。经常可以通过搭脉并观察到心搏不以规律间隔出现而鉴定它。然而，AF的更有力指标是在心电图(ECG或EKG)缺少P波，在每次心脏搏动伊始存在协调的心房收缩时，所述P波正常情况下存在。
[0005]AF与改变的耐力和增加的死亡风险相关，独立于其他心脏风险因子(Beniamin等人，1998.Circulation98:946-952)。AF的最常见和毁灭性的后果是中风。源自AF的中风占全部缺血性中风的 6-24%(Narumiya 等人，2003.Circulation Journal67 (I):68-72)。在恢复心房机械活动后，AF的电复律和药理学复律可能并发中风(Camm等人，2010.Eur HeartT.31:2369-2429:Halperin 等人，1988, Strokel9:937-941)。
[0006]美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏学学会(ESC)在它们的指南基于简洁性和临床相关性推荐以下分类系统(Fuster等人，2006.Circulationl 14:e257-354)。全部心房纤维性颤动患者起初在该分类中称作首次检测的AF。这些患者可以存在或可以不存在先前检测不到的发作。如果首次检测的发作在不到7日内自我终止并且随后另一次发作稍后开始，则病例进展至阵发性AF的分类。虽然处于这个分类的患者具有持续至多7日的发作，但在大多数阵发性AF病例中，发作将在不到24小时内自我终止。如果发作反而持续超过7日，则它不太可能自我终止(Levy2000.Curr OpinCardiol 15:54-57)并将它称作持续性AF。在这种情况下，可以通过复律终止发作。如果复律不成功或不想采用它并且发作继续长时间进行(例如一年或更长时间)，则患者的AF称作永久性的。
[0007]除主要由发作时程和终止限定的以上4种分类之外，ACC/AHA/ESC指南就患者其他特征而言描述了另外的AF分类(Fuster等人，2006.Circulationl 14:e257_354):孤立性心房纤维性颤动(LAF)-不存在其他心血管疾病(包括高血压)、相关肺病或心脏异常(如左心房扩张)的临床或超声心动术结果并且年龄小于60岁；非瓣膜性AF-不存在风湿性二尖瓣病、心脏瓣膜假体或二尖瓣修复；继发性AF-在原发性病状的背景下发生，所述原发性病状可能是AF的病因，如急性心肌梗死、心脏外科、心包炎、心肌炎、甲状腺功能亢进、肺栓塞、肺炎或其他急性肺病。
[0008]心房纤维性颤动常伴随与快速心率相关的症状。快速和不规则的心率可能觉察为心悸、锻炼不耐受并且偶尔产生咽峡炎(如果速率更快并且使心脏处于紧张时)和气短或水肿的充血症状。有时，将仅随着中风或暂时性缺血性发作(TIA)的发作鉴定到心率失常。对于从例行体格检查或ECG首先知道AF的患者，它并不少见，因为它在许多情况下可能是无症状的(Fuster 等人,2006.Circulationll4:e257~354)。
[0009]由于大部分心房纤维性颤动病例继发于其他医学问题，所以胸痛或咽峡炎的存在、甲状腺功能亢进症状(过度活跃的甲状腺)如体重减轻和腹泻以及提示肺病的症状将指示潜在病因。中风或TIA的先前病史以及高血压(高血压)、糖尿病、心力衰竭和风湿热可以指示患有AF的某人是否存在较高的并发症风险(Fuster等人，2006.Circulationll4:e257~354)。
[0010]心房纤维性颤动可以用减慢心率或使心脏节律恢复至正常的药物治疗。复律是利用电手段或化学手段使不规则心搏非侵入性地转变成正常心搏(Fuster等人，2006.Circulationll4:e257-354)。外科疗法和基于导管的疗法也可以用来防止某些个体中AF的复发。经常给予患有AF的人抗凝血药如阿司匹林、肝素、华法林或达比加群以保护他们免于中风。
[0011]当考虑复律时，AF的持续时间变得重要，并且通常认为具有小于48小时的AF发作的患者可以安全地接受迅速复律，而具有超过48小时的AF发作的患者必须用抗凝血药治疗持续多于3周或在复律之前接受经食道超声心动术(TEE) (Camm等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Fuster 等 人,2006.Circulationll4:e257~354:Page 等人，2004.NE顶351:2408-2416:Klein 等人，2001.NE顶344:1411-1420: Tessup 等人，2009.Circulationll9:1977-2016)。可以在报告急性心悸、呼吸困难或晕厥的患者中确定AF的持续时间。然而，无症状或不明显的AF经常发生(Savelieva等人，2000.Pacing clin Electrophysiol23:145-148);在加拿大 AF 记录中，21% 新诊断患有 AF 的患者是无症状的(Kerr等人，1996.Eur Heart T17Suppl C:48-51)。在另一项研究中，17%的患者在他们提到明显的AF相关症状之前具有无症状的AF发作(Page等人，2003.Circulationl07:1141-5)。总体上，AF持续时间的临床确定(低于或高于48小时)可能在临床实践中经常是有害的，这指出需要帮助临床医生在呈现之前精确确定AF持续时间的新工具。
[0012]先前研究已经提出一些生物标志物(主要是B-型钠尿肽类)在AF患者的风险分级或予页测AF发生方面的可倉M尤点(Defteros等人,2010.Heart96:1033-1036:.Tourdain等人，2002.Eur T Heart Fail4:263_267:Maisel 等人，2002.NETO347:161-167:Theius 等人,2009.1ndian Pacing Electrophysiol.T9:1-4)。Deftereos 及其合作者手艮道，患有小于24小时的AF并且没有心力衰竭的患者具有ΝΤ-ρι.οΒΝΡ波动的特定样式，所述样式以头24小时内进行性升高随后快速下降为特征(Defteros等人，2010.Heart96:1033-1036)。他们得出结论:在没有心力衰竭的不能令人满意地确定发作时间的AF患者中在24小时获得2个至3个血浆ΝΤ-ρι.οΒΝΡ水平可以辅助确定心率失常发作是否为新近的，并且这类信息将与涉及抗凝和复律的决策相关。然而，基于这类ΝΤ-ρι.οΒΝΡ波动的患者分类可能在临床实践中是有害的并且在可以作出决定之前需要延长对患者的监测。相比之下，Tsuchida和Tanabe显示BNP已经在AF发作后4小时内立即升高并且BNP水平并不显著地与AF发作后流逝的时间相关(Tsuchida 和 Tanabe2004.T Cardiol44:1~11)。
[0013]发明简述
[0014]本发明的主题是一种用于确定患者从心房纤维性颤动发作至呈现的时间的方法，包括步骤:
[0015]i)提供所述患者的体液样品，
[0016]ii)确定所述样品中proANP或其片段的水平，
[0017]iii)使proANP或其片段的水平与所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间相关，
[0018]其中所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度。
[0019]在从属权利要求中描述优选的方法变体。
[0020]发明详述
[0021]心房纤维性颤动(AF)定义为不规则的异常心脏节律，伴随心脏的心房中不规则地生成电信号，这可以通过以下方式鉴定:搭脉并观察到心搏不以规则间隔出现和/或进行心电术(ECG或EKG)，其中缺少P波表示有AF，所述正P波在每次心脏搏动伊始存在协调的心房收缩时通常情况下存在。
[0022]复律是使用电或药物将异常快的心率或心脏心率失常转变成正常节律的医疗方法(Shea等人，2002.Ciculationl06:el76~178)。同步电复律在心动周期中的特定时刻向心脏使用治疗性剂量的电流。药理学复律，也称作化学复律，使用抗心律失常药物而非电击。
[0023]为了进行同步电复律，使用两个电极极板(或，可选地，传统手持式“电极板”)，每种极板包括面朝基于盐水的导电凝胶的金属板。将极板置于患者的胸部上，或将一个极板置于胸部上并将一个极板置于背部上。这些极板由电缆连接至一台仪器，该仪器具有ECG显示器和除颤器电功能的联合功能。同步功能(或者:手工地操作或自动的)允许复律器借助极板在预定的毫秒数内在心动周期中的最佳时刻递送具有所选择量的电流的逆转电击，所述最佳时刻对应于ECG上QRS复合波的R波。相对于R波对电击计时防止在心动周期的易颤期(或相对不应期)期间递送电击，这可能诱导心室颤动。如果患者是有意识的，则经常使用各种药物帮助镇静患者并使得该方法更可忍受。然而，如果患者在血液动力学上是不稳定的或无意识的，则一旦证实心率失常则立即给予电击。当同步电复律作为可选方法进行时，电击可以结合药物疗法一起进行直至窦性节律实现。在该方法后，监测患者以确保窦性节律的稳定性。同步电复律法用来治疗血液动力学上明显的室上(或窄复合波)心动过速，包括心房纤维性颤动和心房扑动。当脉搏存在时，它也用于急救治疗宽复合波心动过速，包括室性心动过速。无脉搏室性心动过速和心室颤动用称作除颤的非同步电击法治疗。电治疗不适用于窦性心动过速，它应当总是鉴别诊断的部分。
[0024]多种抗心律失常药可以用来使心脏回转至正常窦性节律。药理学复律在颤动最近发作的患者中是特别好的选项。在电复律后有效维持正常节律的药物也可以用于药理学复律。在复律之前给予药物如胺碘酮、地尔硫卓、维拉帕米和美托洛尔以降低心率、稳定患者并增加复律成功的机会。存在最有效用于药理学复律的两类药物。I类药物是钠(Na)通道阻滞剂(其通过阻断Na+通道减慢传导)并且划分成3个亚类a、b和c:1a类减慢心室中的O期去极化并增加绝对不应期。普鲁卡因胺、奎尼丁和丙吡胺是Ia类药物。Ib类药物缩短3期复极化。它们包括利多卡因，美西律(mexiletine)和苯妥英并且Ic类药物最终大幅度减慢心室中的O期去极化(然而不同于la，对不应期没有影响)。氟卡尼、莫雷西嗪和普罗帕酮是Ic类药物。II类药物是抑制SA和AV节去极化并减慢心率的β阻滞剂。它们也降低心脏需氧量并且可以防止心脏重塑。并非全部β阻滞剂是相同的，一些是具有心脏选择性(仅影响β I受体)，其他是非选择性的(影响β I和2受体)。靶向β -1受体的β阻滞剂称作心脏选择性，因为β-1负责增加心率；因此β阻滞剂将减慢心率。III类药物通过阻断向外的K+流延长复极化。胺碘酮和索他洛尔是有效的III类药物。伊布利特是另一种III类药物，但是具有不同的作用机制(发挥作用促进钠经慢钠通道内流)。已经显示它在新近发作型心房纤维性颤动和心房扑动的急性复律方面有效。IV类药物是钙(Ca)通道阻滞剂。它们通过抑制SA节和AV节的动作电位发挥作用。
[0025]如果可获得有经验的技术人员和适宜设施，推荐经食道超声心动术(TEE)指导的复律策略作为3周复律前抗凝法的替代，并且当需要早期复律时，不适用复律前口服抗凝血药，原因在于患者选择或潜在的出血风险或当存在左心房/左心耳血栓的高风险时(Klein等人，2001.NETM344:1411-1420)。TEE是进行超声心动术的替代方式。在其尖端含有超声法换能器的专用探测器通入患者的食道中。这产生可以记录的图像和多普勒评价。
[0026]充分认识到复律后血栓栓塞风险增加。因此，对于超过48小时的AF或持续时间未知的AF，认为在电复律之前抗凝是必须的。对于AF超过48小时的电复律和药理学复律，推荐预防血栓。在小于48小时的明确AF发作的患者中，可以在静脉内施用未分级肝素，随后输注或皮下给予低分子量肝素的掩护下方便地进行复律。在具有中风风险因子(例如心力衰竭、高血压、老年、糖尿病、先前中风或TIA)的患者中，应当在复律后启动口服抗凝血药治疗并终生持续。在无血栓栓塞风险因子的患者中不需要口服抗凝血药。
[0027]抗凝血药是防止凝血的物质；即，它阻止血液凝固。一组称作抗凝血药的药物可以在体内用作血栓形成病症的药物。口服抗凝血药包括香豆素(维生素K拮抗药)，例如华法林、醋硝香豆醇和苯丙香豆素或苯茚二酮。可以通过注射使用抗凝血药肝素。通过防止血凝块形成和血液内部现有血凝块扩大，肝素和其低分子量衍生物(例如依诺肝素、达肝素钠、亭扎肝素)有效在存在风险的患者中预防深静脉血栓形成和肺栓塞。另一种类型的抗凝血药是凝血酶直接抑制剂。该类型的现有成员包括阿加曲班、来匹卢定、比伐芦定和达比加群。
[0028]在本发明的一个实施方案中，确定患者中从心房纤维性颤动发作至呈现的时间高于或低于某个时间临界值。在本发明的一个优选实施方案中，确定患者中从心房纤维性颤动发作至呈现的时间是48小时或高于或低于48小时。在本发明的另一个优选实施方案中，确定患者中从心房纤维性颤动发作至呈现的时间是24小时或高于或低于24小时。
[0029]在本发明的一个优选实施方案中，当确定所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间低于所述时间临界值时，以此作为患者应当适用于立即复律的指标。
[0030]在本发明的另一个优选实施方案中，当确定所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间处在或高于所述时间临界值时，以此作为患者应当用抗凝血药治疗和/或应当在复律之前接受经食道超声心动术(TEE)的指标。
[0031]在本发明的又一个优选的实施方案中，复律优选地是电复律和/或药理学复律。
[0032]心钠肽(ANP)(钠尿肽家族的成员)调节几项生理学参数，包括利尿和钠尿增多，并且降低动脉血压(BP)。它优势地在心脏的心房中产生并且占到循环状态下钠尿肽的98% (Vesely DL.Life2002; 53:153-159)。ANP衍生自其前体激素原的切割，所述前体激素原在循环时比成熟肽显著地更稳定。前体激素的中段片段(ΝΤ-ρι?ΑΝΡ的第53-90位氨基酸)(称作中段-proANP (MR-proANP))，可以相对地抵抗外蛋白酶类降解，不同于先前免疫测定法中所使用的proANP N-端或C端中的表位(MorRenthaler NG等人，ClinChem2004; 50:234-236:Gerszten RE 等人，2008.Am T Physiol Lung Cell Mol Physiol)。
[0033]在本发明的一个优选实施方案中，使用针对与proANP片段MR-proANP(SEQ IDNO:4)相对应的氨基酸序列的至少一种抗体，确定proANP或其片段的水平。
[0034]在本发明的一个特定实施方案中，另外地确定可能影响所述患者中proANP或其片段的水平的至少一个临床参数。这种临床参数优选地选自年龄、性别、共病和身体质量指数(BMI)，最优选地选自年龄和BMI。例如，已知proANP水平随年龄渐增而增力卩。当固定年老患者的临界值时，应当考虑这种更高的水平。与这些临床参数相关，可以参考Morgenthaler等人,Clin Chem.2004, 234 ；Gegenhuber 等人,Clin Chem.2006, 827 ；Gegenhuber 等人,JCard Fail.2007, 42 ；von Haehling 等人，J Am Coll Cardiol.2007，1973 ;Khaleghi 等人，Am J Cardiol.2009, 1257 ;Krueger等人，Intensive Care Med.2007, 2069 ;&Mueller等人，J Intern Med.2006，568,所述文献均通过引用的方式并入本文。
[0035]也可能并且可以改善结果的可靠性以确定除proANP或其片段之外的一个或多个生物标志物，尤其通常与心房纤维性颤动或心血管疾病相关的生物标志物。这类另外生物标志物的优选例子是ProBNP及其片段，特别是NT-proBNP和/或BNP。在这个方面，可以参考TO2008/077396A1和W02008/106938A2，所述文献是通过引用的方式并入本文。
[0036]如本文中提到，术语“片段”指从较大蛋白质或肽可衍生的较小蛋白质或肽，因此它包含较大蛋白质或肽的部分序列。所述片段是从较大蛋白质或肽，通过其一个或多个肽键的皂化而可衍生的。所述片段是从ANP的激素原(proANP ;SEQ ID NO:1)可衍生的任何片段。proANP的这些片段优选地涉及至少6个氨基酸长度、最优选地至少12个氨基酸残基长度的片段。proANP的已知片段包括ANP (SEQ ID NO: 2)、NT-proANP (SEQ ID NO: 3)和MR-proANP(SEQ ID N0:4)。这类片段优选地用如本文所述的免疫学测定法可检测。
[0037]如本文中提到，“测定法”或“诊断测定法”可以是诊断领域中应用的任何类型测定法。这种测定法可以基于待检测的分析物以某种亲和力与一个或多个捕获探针结合。就捕获分子和靶分子或目的分子之间的相互作用而言，亲和常数优选地大于IO8M'
[0038]在本发明的上下文中，“捕获分子”是可以用来结合来自样品的靶分子或目的分子即分析物(即在本发明的上下文中，心血管肽)的分子。捕获分子因此必须在空间上并且就表面特征，如表面 电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体而言充分地成型，以特异性结合靶分子或目的分子。因此，结合可以例如由捕获分子和靶分子或目的分子之间离子性、范德瓦尔斯、、σ-J1、疏水性或氢键相互作用或两种或更多种前述相互作用的组合介导。在本发明的上下文中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，捕获分子是抗体，包括对靶分子或目的分子具有足够亲和力的其片段并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物，所述片段源自具有至少12个氨基酸长度的变体链。
[0039]优选的检测方法包括各种形式的免疫测定法，例如放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定法和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定法和快速检测形式，例如免疫层析试纸条检测。
[0040]测定法可以是均相或多相测定法、竞争性或非竞争性测定法。在一个特别优选的实施方案中，测定法处于夹心测定法的形式，所述夹心测定法是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体结合并且与第二抗体结合。第一抗体可以与固相(例如珠、板孔或其他容器的表面、芯片或试纸条)结合，并且第二抗体是(例如用染料、用放射性同位素或反应性或催化活性部分)标记的抗体。随后通过适宜的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。涉及“夹心测定法”的一般组成和程序是充分建立的并且是技术人员已知的(The Tmmunoassay Handbook,编者 David Wild, Elsevier LTD, Oxford:第 3 版(2005 年 5 月)，ISBN-13:978-0080445267:Hultschig C 等人，Curr Qpin ChemBiol.2006Feb:10(1):4~10.PMID: 16376134,通讨弓I用的方式并入本文)。
[0041]在一个特别优选的实施方案中，测定法包含两种捕获分子，优选地包含均作为分散体存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一标记组分与第一捕获分子连接，其中所述第一标记组分是基于荧光猝灭或化学发光猝灭或扩增的标记系统的部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接，从而一旦两种捕获分子与分析物结合，则生成可度量信号，所述可度量信号允许检测包含样品的溶液中所形成的夹心复合物。
[0042]甚至更优选地，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料、尤其花青型染料组合的稀土元素穴状化合物或稀土元素螯合物。在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、菁染料，如 CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、咕吨、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6_羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’_四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5_羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、B0DIPY染料，如BODIPY TMR、俄勒网绿、香豆素类，如伞形酮、苯甲酰亚胺类，如Hoechst33258 ;菲啶，如德克萨斯红、Yakima黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙啶、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、多次甲基染料等。
[0043]在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括基于在下述文献中对化学发光材料所述的物理原理使用染料Kirk-Qthmer, Encyclopedia of chemical technology,第 4版.执,对丁编辑,T.1.Kroschwitz:编辑,M.Howe-Grant, Tohn ffiley&Sons, 1993,第 15 卷，第518-562页，所沭文献通过引用的方式并入本文，包括第551-562页上的引文。优选的化学发光染料是吖啶酯。
[0044]甚至更优选,所述标记系统包含与突光染料组合的稀土元素穴状化合物或稀土元素螯合物。
[0045]如本文所用的术语“患者”指正在接受医疗护理或因疾病而应当接受医疗护理的活人或非人生物。这包括未患有限定疾病的人，其中对这些人就病变的体征研究。
[0046]如本文所用，术语“样品”指出于受试者(如患者)的诊断、预后或评价目的所获得的体液样品。优选的测试样品包括血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、痰、和胸腔积液。此外，本领域技术人员会认识到在分级或纯化方法(例如，将全血分离成血清或血浆组分)后将更轻易地分析一些试样。
[0047]因此，在本发明的一个优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿样或前述任何样品的提取物。优选地，样品是血液样品，最优选地血清样品或血浆样品。
[0048]在适宜的情况下，样品可能在本发明中使用之前需要均化或用溶剂提取以获得液体样品。液体样品因而可以是溶液或悬液。液体样品可以在本发明中使用之前经历一个或多个预处理。这类预处理包括但不限于稀释、过滤、离心、浓度、沉降、沉淀、透析。预处理也可以包括向溶液添加化学或生物化学物质，如酸、碱基、缓冲液、盐、溶剂、反应性染料、去垢齐U、乳化剂、螯合剂。
[0049]诊断和/或预后试验的灵敏度和特异性不只是取决于检验的分析“品质”，它们还取决于构成异常结果的定义。在实践中，接受者操作特征曲线(R0C曲线)一般通过将变量的值对其在“正常”群体(即，表观健康)和“疾病”群体(即患有心房纤维性颤动的患者)中的相对频率作图进行计算。对于任何特定标志物，针对患病或不患病的受试者的标志物水平的分布将可能重叠。在这类条件下，某检验的确无法以100%准确度绝对地区分正常与患病，并且重叠区域表示该检验在何处不能区分正常与患病。选择阈值，其中高于所述阈值(或低于所述阈值，这取决于标志物怎样随疾病变化)，则将该检验视为异常并且低于所述阈值，则将该检验视为正常。ROC曲线下面积是所构思量值将导致正确鉴定某病状的概率的量度。甚至当检验结果并不必然地给出精确数字时，可以使用ROC曲线。只要可以将结果排序，就可以产生ROC曲线。例如，可以根据程度将对“患病”样品检验的结果排序(例如1=低，2=正常，和3=高)。这种排序可以与“正常”群体中的结果相关，并且产生ROC曲线。这些方法是本领域熟知的(见例如，Hanley等人，1982.RadioloRyl43:29-36)。优选地，ROC曲线产生大于约0.5、更优选地大于约0.7、仍更优选地大于约0.8、甚至更优选地大于约0.85并且最优选地大于约0.9的曲线下(AUC)面积。术语“约”在这种语境下指给定量值的+/_5%。
[0050]ROC曲线的水平轴代表(1-特异性)，其随假阳性率而增加。该曲线的垂直轴代表灵敏度，其随真阳性率而增加。因此，对于选择的特定截值，可以确定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下面积是所测量的标志物水平将导致正确鉴定某疾病或病状的概率的量度。因此，ROC曲线下面积可以用来确定检验的有效性。
[0051]在某些实施方案中，标志物或标志物组合显示出至少约70%灵敏度、更优选地至少约80%灵敏度、甚至更优选地至少约85%灵敏度、仍更优选地至少约90%灵敏度并且最优选地至少约95%灵敏度，前者与至少约70%特异性、更优选地至少约80%特异性、甚至更优选地至少约85%特异性、仍更优选地至少约90%特异性并且最优选地至少约95%特异性组合。在特别优选的实施方式中，灵敏度和特异性均是至少约75%、更优选地至少约80%、甚至更优选地至少约85%、仍更优选地至少约90%并且最优选地至少约95%。术语“约”在这种语境下指给定量值的+/_5%。
[0052]阈值水平可以例如从Kaplan-Meier分析获得，其中疾病的出现与标志物在群体中的四分位数相关。根据这项分析，标志物水平高于第75百分位数的受试者具有显著增加的属于下述组的概率，其中所述组低于某个时间临界值的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间。这个结果进一步得到对经典风险因子全面调节的Cox回归分析支持:相对于全部其他受试者的最高四分位数高度显著地与低于某个时间临界值的时间间隔相关。
[0053]其他优选的临界值例如是正常群体的第90百分位数、第95百分位数或第99百分位数。通过使用比第75百分位数更高的百分位数，降低了鉴定的假阳性受试者的数目，但是可能错过鉴定风险为中度但仍增加的受试者。因而，可以根据是否认为如下更适宜:以还鉴定出“假阳性”为代价鉴定出大多数存在风险的受试者，或是否认为如下更适宜:以错失几位处于中度风险的受试者为代价主要鉴定出高风险受试者，采用该临界值。
[0054]通过使用个体的标志物水平值和其他预后性实验室参数和临床参数计算个体风险的其他数学概率，例如NRI (净重新分类指数)或IDI (综合区分指数)。可以根据 Pencina(Pencina M.T 等人，Evaluating the added predictive ability of a newmarker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond.StatMed.2008:27:157-172)计算这些指数。
[0055]根据该方法，当所述确定的proANP或其片段水平、MR-proANP水平高于预定阈值水平时，诊断该患者具有流逝的小于48小时从心房纤维性颤动发作至呈现的时间。优选地，预定阈值水平在100和350pmol/L之间，更优选地在100pmol/L和250pmol/L之间，甚至更优选地在100pmol/L和190pmol/L之间,最优选地在100pmol/L和160pmol/L之间。
[0056]上文提到的值可能在检测proANP或其片段的其他测定法中是不同的，如果这些测定法已经按不同方式校准。考虑到校准中的差异，上文提到的值应当因此适用于这类按不同方式校准的ProANP测定法。一种对校准中差异量的可能性是所讨论的proANP测定法与通过使用两种方法测量样品中proANP或其片段的在本发明中使用的MR-proANP测定法的方法比较分析(相关性)。另一个可能性是鉴于这个检验法具有足够的分析性灵敏度，采用所讨论的proANP测定法确定；将代表性正常群体的中位数proANP水平与如本文所述的中位数分析物水平比较；并且基于借助这种比较所获得的差异，重新计算校准。
【专利附图】
【附图说明】
[0057]现在将参考附图和以下实施例更详细地描述本发明。在附图中，
[0058]图1显示与小于48小时从心房纤维性颤动发作至呈现的时间相关的MR-proANP和ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的接受者操作曲线，和
[0059]图2显示与小于24小时从心房纤维性颤动发作至呈现的时间相关的MR-proANP和ΝΤ-ρι.οΒΝΡ的接受者操作曲线。
实施例
[0060]研究设计和群体
[0061]从2010年6月至2010年9月，考虑纳入推荐至柯钦医院(Cochin Hospital)心内科以便管理AF的连续患者。基于ECGJf RR间距(心电图中两个连续R波之间的时间)不规则、无明显P波和心房周期长度(当可见时)可变且<200ms的AF定义为心脏心率失常。排除标准是1)AF作为急性病状(即术后急性心肌梗死、败血症、急性呼吸衰竭)的并发症，2)患有严重肾衰竭的患者(肌酐清除率<30ml/分钟)，和3)以下患者，其呈现AF及临床上基于气短(新近或恶化)疑似并且必须根据当前指南加以证实的并发性急性失代偿性心力衰竭(.Tessup等人，2009.Circulationll9:1977-2016)。患者提交书面知情同意书，并且本地伦理委员会批准该方案。
[0062]例行临床评估和管理
[0063]除临床史、体格检查和12导联ECG之外，全部患者均进行I)胸部放射线照相术；2)标准血液检查，包括血清学检测甲状腺功能和肝脏酶测量；和3)经胸超声心动图(TTE)，由有经验的心脏病专家使用ATLHDI5000系统(ATL超声和Bothell，华盛顿，DC)根据美国超声心动图协会指南进行。
[0064]进行TEE和在采用复律的节律控制策略或心率控制策略之间选择的决定交由医师决定。根据目前建议，考虑对其复律的患者必须用口服抗凝血药治疗至少3 周或接受 TEE (Camm 等人，2010.Eur Heart T.31:2369-2429:Fuster 等人，2006.Circulationll4:e257~354)。
[0065]评估发作至呈现的时间
[0066]将AF划归为阵发性、持续性或长期，并且由2位心脏病学家按以下事项独立地确定发作时间:1)由患者报告的症状发作(主要是心悸)，2)先前的可能院内和院外ECG和24小时霍尔特监测结果，和3)掌管病人的院外医师(包括全科医生)通知的最后心脏节律。由第三位心脏病学家消除不一致。
[0067]生物化学分析
[0068]在含有Li+-肝素盐的塑料管中采集血液样品，并且在分析之前血浆贮存在_80°C。在呈现时在以仰卧位置持续至少30分钟的患者中从外周肘前静脉采集血液样品。使用Kryptor分析仪(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫，德国)测量MR-proANP。这种荧光免疫测定法使用时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术，所述技术基于因完成的免疫反应而从供体分子(穴状化合物)至接纳体分子(XL665)的非放射性能量转移。已经在其他地方评价和描述了该方法的分析性能。在我们的实验室中，发现变异系数(CV)是〈5%，在419.0pmoI/L 时是3.4%并且在 89.2pmol/L 时是 3.7%(Chenevier-Gobeaux 等人，2010.ClinChem56:1708-1717)。
[0069]使用市售免疫突光测定法(ElecsysproBNP, Roche Diagnostics, Mannheim,德国)测量血浆ΝΤ-ρι.οΒΝΡ水平。测定法具有30pg/mL的功能灵敏度，测量上限为35000pg/mL并且变异系数处于1.0-6.0%范围内。
[0070]统计分析
[0071]数值表述为均值土标准偏差，中位数加四分位[IQR]范围，或如果适宜，计数和百分比。使用Spearman相关性研究钠尿肽和其他变量之间任何相关性的存在。首先使用针对连续变量的Student t_检验或Mann-Whitney U检验和用于频率差异的卡方检验或Fisher精确检验(如果适宜)，以单变量分析研究钠尿肽和其他临床参数和实验室参数在新近发作(小于48小时)患者与具有更延长的AF的患者之间区分的能力。随后进行多变量对数回归，包含从单变量分析出现的全部变量以检验由钠尿肽提供的可能的独立诊断信息。构建接受者操作特征(ROC)曲线以评估整个钠尿肽浓度范围内的灵敏度和特异性；从ROC曲线确定理想临界值并且报告灵敏度和特异性。使用STATA版本10.1 (StataCorp LP,College Station, TX)执行全部统计分析并且小于0.05的p-值视为统计显著。[0072]结果
[0073]从2010年6月至2010年9月，推荐57位患者以便管理AF。在这些患者中，不能纳入9位患者(4位患者具有急性心肌梗死，3位患者患有心原性或非心原性休克，I位患者患有严重肾衰竭并且I位患者患有急性失代偿性心力衰竭)。在一位另外的患者中未测量钠尿肽。因此纳入47位患者。表1中列出患者的〈/≥48小时的AF发作至呈现时间特征。纳入时的中位数年龄是72岁[61-81]并且性别比率是1.9。AF在22位患者中呈阵发性，在6位患者中呈持续性并且在19位患者中呈长期性。19位患者(40.4%)在48小时内出现AF发作，整个队列中AF的中位数持续时间是5日[1-120]。
[0074]MR-proANP水平是78.8至903.3pmol/L。MR-proANP部分地但是显著与从AF发作至呈现的时间、LV射血分数(LVEF)，血红蛋白相关，但是不与心率或肌酐浓度相关(表2)。另外,MR-proANP 和 NT-proBNP 是显著相关的(Spearman r=0.71,ρ〈0.001)。表 3 中显不不同亚组(分别是阵发性、持续性和长期AF)之间的MR-proANP浓度。
[0075]分析从AF发作至呈现的时间(〈/≥48小时)
[0076]AF发作小于48小时的患者与AF发作≥48小时的患者相比，具有明显降低的 MR-proANP(分别是 144.0[129.2-213.7]pmol/L 对比 321.7[236.4-425.6]pmol/L,p〈0.001)(表3)。与AF〈48小时相关的其他变量是较小年龄、增加的心率、保持的LVEF (左心室射血分数)、保持的血红蛋白(表1)。在多变量分析中，MR-proANP是保持与小于48小时的AF相关的唯一变量(p=0.021)。
[0077]鉴定入院之前具有小于48小时的AF发作的患者的ROC曲线下面积对于MR-proANP 和 NT-proBNP 分别是 0.90 及 0.82 (ρ〈0.05 ;图1)。移除 LVEF〈50% 的患者(12位患者)不改变结果；在这种情况下MR-proANP在AF小于48小时的患者中是140.8[129.2-191.6]pmol/L,相比之下在 AF ≥ 48 小时的患者中是 321.7[213.5-422.0]pmol/L (ρ〈0.001)。
[0078]基于ROC曲线分析，我们鉴定了 MR-ρι?ΑΝΡ的两个可能临界值以检测入院之前具有小于48小时的AF发作的患者。191.6pmol/L的临界值将分别产生85.7%的灵敏度和73.8%的特异性，161.9pmol/L的临界值将分别产生92.9%的灵敏度和63.2%特异性，表4中给出示例性MR-proANP临界值在从AF发作至呈现的时间小于48小时的患者和从AF发作至呈现的时间> 48小时的患者之间进行区分的灵敏度和特异性。
[0079]序列
[0080]SEQ ID NO:1 (proANP 的氨基酸序列):
[0081]I NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS
[0082]51 PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKL RALLTAPRSL
[0083]101 RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY
[0084]SEQ ID NO: 2 (ANP 的氨基酸序列):
[0085]I SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY
[0086]SEQ ID NO:3 (NT-proANP 的氨基酸序列):
[0087]I NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS
[0088]51 PLPEVPPffTG EVSPAQRDGG ALGRGPffDSS DRSALLKSKL RALLTAPR
[0089]SEQ ID NO:4(MR-proANP 的氨基酸序列):[0090]I PEVPPffTGEV SPAQRDGGAL GRGPffDSSDR SALLKSKL
[0091]SEQ ID NO:5 (proBNP 的氨基酸序列):
[0092]I HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV
[0093]51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL
[0094]101 GCKVLRRH
[0095]SEQ ID NO:6 (BNP 的氨基酸序列):
[0096]I SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH
[0097]SEQ ID NO:7 (NT-proBNP 的氨基酸序列):
[0098]I HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV
[0099]51 WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR
[0100]表1.患者特征(从AF发作至呈现的时间〈/≥48小时)
【权利要求】
1.一种用于确定患者中从心房纤维性颤动发作至呈现的时间的方法，包括步骤: (i)提供所述患者的体液样品， (ii)确定所述样品中proANP(SEQID NO:1)或其片段的水平， (iii)使ProANP或其片段的水平与所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间相关联， 其中所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中确定患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间处在或高于某个时间临界值或低于某个时间临界值。
3.根据权利要求2所述的方法，其中时间临界值是48小时或高于或低于48小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其中时间临界值是24小时或高于或低于24小时。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品选自血液、血清、血浆、脑脊液、尿或唾液，优选地血液、血清或血浆。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中使用针对与proANP片段MR-proANP(SEQ ID NO:4)相对应的氨基酸序列的至少一种抗体,确定proANP或其片段的水平。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中，当确定所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间低于所述时间临界值时，以此作为患者应当施用于立即复律的指标。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中，当确定所述患者的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间处在或高于所述时间临界值时，以此作为患者应当用抗凝血药治疗和/或应当在复律之前接受经食道超声心动术(TEE)的指标。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中复律是电复律和/或药理学复律。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中当所述确定的proANP(SEQIDNO:1)或其片段的水平高于预定阈值水平时，诊断所述患者具有低于所述时间临界值的从心房纤维性颤动发作至呈现的时间。
11.根据权利要求1O所述的方法，其中预定阈值水平在100和350pmo I /L之间，更优选地在100pmol/L和250pmol/L之间，甚至更优选地在100pmol/L和190pmol/L之间,最优选地在 100pmol/L 和 160pmol/L 之间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中除proANP或其片段之外还确定至少一种生物标志物，优选地与心血管疾病、优选与心房纤维性颤动相关的生物标志物，最优选地确定ProBNP及其片段，特别优选地NT-proBNP和/或BNP。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中另外地确定可影响所述患者中proANP或其片段的水平的至少一个临床参数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中临床参数选自包括年龄、性别、共病和身体质量指数(BMI)的组，优选地年龄和BMI。
【文档编号】G01N33/68GK103765219SQ201280037660
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年7月2日 优先权日:2011年7月28日
【发明者】C·摩恩 申请人:B.R.A.H.M.S有限公司, 公共救济事业局-巴黎医院, 笛卡尔巴黎大学