专利名称：尿糖的测定方法及该方法中使用的生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体是尿糖的测定方法及该方法中使用的生物传感器。
背景技术：
为了控制新陈代谢的情况，特别是对于糖尿病病例，需要定期地控制体循环中的葡萄糖浓度。这不仅对于要注射胰岛素的I型糖尿病患者来说是必须的，对于II型糖尿病患者也是如此，后者约占这种糖代谢疾病的85%。据预计，至2010年世界糖尿病患者数将达到两亿两千一百万(Hauner, H, ；Dtsch Med Wochenschr (德国医学周刊)1998 ;123 ;777-82 ；Pharmaco Economics (医药经济)1995 ；8 (Suppl, 1)28-71 ;)。鉴于糖尿病的高发病率，仅有常规的通过皮肤穿刺进行的血糖测量不能够满足定期的新陈代谢控制的需要和希望。这需要患者在每次测量前克服刺伤皮肤的心理障碍。对于大多数患者来说，并不需要测量血糖，而只要控制尿液中的葡萄糖浓度就行了。如果通过新陈代谢的刺激超过了肾脏的阈值，就导致生理需要的外的葡萄糖作为尿糖经过肾脏排出，在尿液中的葡萄糖就体现为可以检测出的浓度。因此，尽管血糖检测已经相当普及，但尿糖检测作为一种使用操作很简便的无创的检测方法，仍深受相当部分糖尿病患者的欢迎。一种测定尿糖的方法基于葡萄糖的特性，使光偏振而右旋。所说的偏光光度计就利用了这种特性，其中光从偏振面偏转的角度是实际的葡萄糖浓度的测度(Poege，A.W.Zmed.Labortechnik (医用实验室诊断技术)17 (1976) 59-79)。对于预防用的筛选家庭及个人尿液中的葡萄糖含量的方法通常采用尿糖检测试纸，这类试纸多数是在酶化学基础上产生葡萄糖依从性的颜色反应。这些试纸条的缺点是准确性差，只能用于尿糖的半定量检测，且灵敏度比较低，一般都在尿糖含量达到50mg/dl，甚至100mg/dl才能显示出阳性，测试时还必须用时钟严格控制时间才能准确判断结果，从而测量结果很不可靠。并且只有能分辨颜色的人才能采用，而糖尿病患者，特别是II型糖尿病的老年患者中，相当多的人是色盲，至少辩色不准确。上述偏光光度计是作为实验室设备而配备的用于临床化学中，而尿糖试纸又不适宜用作日常新陈代谢控制中可靠地表达尿液中的葡萄糖存在及其浓度的常规方法。因此研究和开发越来越集中于酶促电化学测量装置及其在葡萄糖测定方面的应用。2008年，日本的一家公司研制推出了一种可对尿糖进行定量检测的生物传感器尿糖测试仪，但由于其采用固定生物传感器检测头，价格昂贵，使用成本高，且检测头是多次反复使用，需要清洗，还会面临消毒方面的一些问题。尿液中各种杂质对尿糖测量造成严重的干扰，不管是比色反射法还是电化学生物传感器法。不同比重尿液中存在干扰物的量有较大差别，高比重尿中含有更多的Vc、尿酸等还原性干扰物，高比重尿中含有的大量电解质离子、金属离子均会影响尿糖检测的特异性，造成测试结果不准确。
一正在等待批准、名为《具有样品前处理功能的电极式尿糖试纸》的专利，为了解决不同尿液干扰的问题，在电极式尿糖试纸的加样部加入浸泡了处理剂的膜，对消除干扰有较好的效果。但是，由于需要前处理膜，前处理膜的生产加工要求严格控制，才能保证尿糖试纸的精密度，有时即使严格控制，生产的试纸精度仍然会较差；另外，由于需要严格控制生产，增加了加工的效率和成本。现有的尿糖测试方法，要么灵敏度偏低，受各种干扰物影响大，造成测试不够准确；要么制作工艺繁杂，成本高，使用不够不方便。为了糖尿病人及非糖尿病人方便、无痛的分析胰岛素状态，需要一种测试灵敏度高、准确、可靠的测试尿中葡萄糖的方法。尿糖测试要更准确、可靠，干扰的消除、测试精密度等还有需要改进的地方。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供通过以高精度和高可靠性测定尿液电导率而能够充分且正确地校正的尿糖测定方法及该方法中使用的生物传感，制作工艺简单，成本低，使用方便。为了达成上述目的，本发明的测定方法为尿液中的葡萄糖的测定方法，该方法的步骤为:a，在介体的存在下，利用氧化还原酶将尿液中的葡萄糖氧化还原；b，通过电极系统检测此时产生的氧化电流或还原电流，以上述电流值为基础计算葡萄糖浓度；C，测定上述尿液中的电导率、并利用该电导率校正尿液葡萄糖浓度的校正工序；电导率的测定方法为:准备含有工作电极和对电极的电极系统，在上述两电极中的工作电极上不配置介体，而在对电极上配置介体；将尿液导入至上述电极系统，在该状态下对上述电极系统施加电压，由此检测流至上述两电极间的氧化电流或还原电流，以该电流值为基础计算电导率值。本文中所说的氧化还原酶，系指可与样品中的待测标的物产生氧化还原反应的酶。所使用酶种类视所欲检测的标的物不同而有所不同。例如，欲检测葡萄糖浓度时，所选用的酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。本文中所说的电子介体，系指可与经前述氧化还原酶作用所产生的物质反应后，本身可由氧化状态还原成还原状态得物质。当电子介体变成还原状态时，可藉由施加一外加电压于电极试纸上，促使电子介体由还原状态逆反应回复为氧化状态，此时化学反应的电位、电阻或电流变化，可由电极系统的工作电极与参考电极传导至电极系统另一端的接头。当此接头与一讯号接收装置连接时，可将前述化学反应的电位、电阻或电流变化接收，并藉由一显示装置将讯号转换成检测标的物的浓度。电子传递介体为铁氰化钾、二茂铁及其衍生物、钌的络合物或苯醌类化合物。根据本发明的一较佳具体实施例，该电子介体可为铁氰化钾。较佳地，该电子介体的含量为3% (m/m)至20% (m/m)。本文中所说的缓冲液、粘合剂及表面活性剂，系指可助于氧化还原酶及电子介体干燥后附着于绝缘基片上的物质，或可保护氧化还原的物质。所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液组成的组中的一种；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-100、TW-20。将酶反应膜固定到电极上的方法可以是吸附法、交联法、溶胶-凝胶法、粘合剂法等。吸附法固定酶只需要将酶液直接滴加在电极表面上，酶的疏水基团与疏水的电极表面经范德华力而吸附；交联法固定酶可以在酶液中加入戊二醛等交联试剂。溶胶-凝胶法固定酶可以将酶融入二氧化硅水溶胶、二氧化钛水溶胶、明胶等试剂中，在电极表面干燥后形成凝胶。粘合剂法固定酶可以将酶与粘合剂及其他辅料配成可印刷的酶浆，丝网印刷在电极表面上。电子传递介体、缓冲液及表面活性剂可以与酶混合一起滴加或丝网印刷到电极表面。本发明的生物传感器用于通过氧化还原葡萄糖、并利用电极检测由该反应产生的氧化电流或还原电流来测定上述尿液葡萄糖，其分为尿糖检测部和浓缩系数检测部:尿糖检测部具有第I电极系统和试剂层，上述试剂层具有尿糖的氧化还原酶和介体。在介体的存在下，通过上述氧化还原酶将尿糖氧化还原，利用上述第I电极检测施加电压时的氧化还原电流，从而测定尿糖浓度。浓缩系数检测部具有工作电极和对电极，在上述工作电极上不配置介体，而在对电极上配置介体；将上述尿液导入至上述电极系统，施加电压，由此检测流动的电流值，从而测定上述尿液的浓缩系数。通过该浓缩系数来校正上述尿糖浓度。本发明的生物传感器，其包括:一绝缘基片；一位于绝缘基片上的电极系统，该电极系统设置有三条状导电电极，分别为参比电极、工作电极、浓缩系数测定电极；一局部覆盖于电极系统上的电绝缘层，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔；一位于电化学电极反应区的反应层，该反应层包括至少一种氧化还原酶、种电子介体，还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂；反应层仅覆盖参比电极、工作电极，而不覆盖浓缩系数测定电极。本文中所说的绝缘基片，系指具有平直的表面及电绝缘特性的薄层片。较佳地，该绝缘基片选自下列所组成的群:聚氯乙烯(PVC)片、玻璃纤维片(FR-4)、聚酯、电木片、PET片、PC片、PP片、PE片、PA片、PS片、玻璃片及陶瓷片(CEM-1)。根据本发明的一较佳实施，该绝缘基片为PC或PET片。本文中所说的电极系统，系指包括至少有三条分离且互不相接触的电极，分别形成工作电极、参考电极及浓缩系数测定电极。根据本发明的一较佳实施，电极系统系以电绝缘层局部覆盖，使裸露于电绝缘隔离层一端分别形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极而与电化学电极反应区相连，而另一端则形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极的接头，可与检测样品在电化学反应时产生电效应的检测装置相连。较佳地，该电极系统的材料可选用适合网版印刷的导电性浆状材质，例如但不限于碳胶、金胶、银胶、碳银混合胶、挥发性石墨或铜胶或其组合(例如以网印先印银胶后再印碳胶)，或其它任何适合网版印刷的导电性浆状材料。本文中所说的电绝缘隔离层，系指以具有电绝缘性质的材质所形成的薄层。较佳地，该电绝缘隔离层的材料可选用适合网版印刷的电绝缘性浆状材质或电绝缘性胶带，例如热干燥型或紫外光干燥型的绝缘漆，或PVC或PET材质的绝缘胶带。较佳地，该电绝缘层具有厚度为0.1至0.25毫米。根据本发明的一较佳实施，该电绝缘隔离层局部覆盖于基片上的电极系统，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔。本文中所说的反应层，系指位于上述电化学电极反应区，含有与被测物质反应的生物试剂。反应层中包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。较佳地，该调配物可以涂覆或滴加的方式加至该反应层后，于60°C下干燥。本发明的尿糖的测定方法和生物传感器中，上述尿液浓缩系数测定部的上述工作电极和对电极之间的施加电压优选大于等于水电解的电压，优选为1-5V的范围，进一步优选为1-3V的范围。通过施加大于等于水电解电压的电压，能够以更高的灵敏度测定仅依赖于尿液浓缩的电流，且能够得到不受尿液中所存在的其它氧化还原物质的影响、不依赖于个人差异的稳定的电流。另外，施加时间例如为1-10秒、更优选为1-5秒。由此，本发明的特征在于尿液的浓缩系数的测定。即，当测定尿液的浓缩系数时，通过仅在对电极上配置介体，能够以高精度和高可靠性简单地检测反映尿液的浓缩系数的电流。因此，通过本发明的测定方法、生物传感器和测定装置，以该高精度和高可靠性测定的尿液的浓缩系数为基础来校正尿糖浓度，因此能够充分且正确地进行校正，其结果是校正后的尿糖浓度也更为高精度和高可靠性，制作工艺简单，成本低，使用方便。
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，并不构成对本发明的限定。在附图中:图1为本发明的第一实施方式的结构示意图；图2为图1所示实施方式的结构分解图；图3为表示实施例1的传感器相对于电压的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图4为表不实施例1的传感器相对于电压(IV)的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图5为表不实施例1的传感器相对于电压(2V)的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图6为表不实施例1的传感器相对于电压(3V)的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图7为表不实施例1的传感器相对于电压(4V)的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图8为表不实施例1的传感器相对于电压(5V)的施加、浓缩系数的响应电流值(nA)随时间变化的图；图中标号为:I基片；2对电极；3工作电极；4浓缩系数测定电极；5绝缘隔离层；6反应窗口 ；7酶反应膜；8虹吸导样槽。
具体实施例方式本发明提供通过以高精度和高可靠性测定尿液的浓缩系数而由此能够正确地校正尿糖的测定方法和该方法中使用的生物传感器。本发明的生物传感器，其包括:一绝缘基片一位于绝缘基片上的电极系统，该电极系统设置有三条状导电电极，分别为参比电极、工作电极、浓缩系数测定电极；局部覆盖于电极系统上的电绝缘层，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔；一位于电化学电极反应区的反应层，该反应层包括至少一种氧化还原酶、种电子介体，还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂；反应层仅覆盖参比电极、工作电极，而不覆盖浓缩系数测定电极。本文中所说的绝缘基片，系指具有平直的表面及电绝缘特性的薄层片。较佳地，该绝缘基片选自下列所组成的群:聚氯乙烯(PVC)片、玻璃纤维片(FR-4)、聚酯、电木片、PET片、PC片、PP片、PE片、PA片、PS片、玻璃片及陶瓷片(CEM-1)。根据本发明的一较佳实施，该绝缘基片为PC或PET片。本文中所说的电极系统，系指包括至少有三条分离且互不相接触的电极，分别形成工作电极、参考电极及浓缩系数测定电极。根据本发明的一较佳实施，电极系统系以电绝缘层局部覆盖，使裸露于电绝缘隔离层一端分别形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极而与电化学电极反应区相连，而另一端则形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极的接头，可与检测样品在电化学反应时产生电效应的检测装置相连。较佳地，该电极系统的材料可选用适合网版印刷的导电性浆状材质，例如但不限于碳胶、金胶、银胶、碳银混合胶、挥发性石墨或铜胶或其组合(例如以网印先印银胶后再印碳胶)，或其它任何适合网版印刷的导电性浆状材料。本文中所说的电绝缘隔离层，系指以具有电绝缘性质的材质所形成的薄层较佳地，该电绝缘隔离层的材料可选用适合网版印刷的电绝缘性浆状材质或电绝缘性胶带，例如热干燥型或紫外光干燥型的绝缘漆，或PVC或PET材质的绝缘胶带。较佳地，该电绝缘层具有厚度为0.1至0.25毫米。根据本发明的一较佳实施，该电绝缘隔离层局部覆盖于基片上的电极系统，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔。本文中所说的反应层，系指位于上述电化学电极反应区，含有与被测物质反应的生物试剂。反应层中包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。较佳地，该调配物可以涂覆或滴加的方式加至该反应层后，于60°C下干燥。本发明的尿糖的测定方法和生物传感器中，上述尿液浓缩系数测定部的上述工作电极和对电极之间的施加电压优选大于等于水电解的电压，优选为1-5V的范围，进一步优选为1-3V的范围。通过施加大于等于水电解电压的电压，能够以更高的灵敏度测定仅依赖于尿液浓缩的电流，且能够得到不受尿液中所存在的其它氧化还原物质的影响、不依赖于个人差异的稳定的电流。另外，施加时间例如为1-10秒、更优选为1-5秒。为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明实施例做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。任何熟悉此项技术的人上可轻易做到的修饰及改变均包含于本案所附申请专利权利要求的范围内。实施例1本实施例提供一电极式尿糖试纸的制备实例，从而说明本发明的电化学生物传感器及制备方法。如图1-8所示:首先，采用丝网印刷技术在0.25mm厚PET塑料基片上制作反电极2、工作电极3、浓缩系数测定电极4，反电极2、工作电极3、浓缩系数测定电极4采用由Acheson公司购买的导电碳墨制作。通过丝网印刷将导电油墨在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到80°C烘箱中烘干60min。其次，采用丝网印刷技术在印好电极系统的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘隔离层5，绝缘漆由Acheson公司购买。通过丝网印刷将绝缘漆在PET塑料基片上铺上分散均匀的油墨薄层后，放到紫外烘干机一分钟烘干。接着，在电极表面固定酶反应膜7用于尿液葡萄糖的检测，反应层仅覆盖反电极、工作电极，而不覆盖浓缩系数测定电极。所取酶反应液的各组分及其重量百分比如下:
权利要求
1.尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于分为尿糖检测部和浓缩系数检测部；尿糖检测部具有第I电极系统和试剂层，上述试剂层具有尿糖的氧化还原酶和介体；浓缩系数检测部具有工作电极和对电极，在上述工作电极上不配置介体，而在对电极上配置介体；所述生物传感器包括绝缘基片，即具有平直的表面及电绝缘特性的薄层片；包括位于绝缘基片上的电极系统，该电极系统设置有三条状导电电极，分别为参比电极、工作电极、浓缩系数测定电极；包括局部覆盖于电极系统上的电绝缘层，使得在未覆盖电绝缘层所裸露出的电极系统区域，形成一容纳样品溶液空间的电化学电极反应区及排气孔；包括位于电化学电极反应区的反应层，该反应层包括至少一种氧化还原酶、一种电子介体，还包括缓冲液、粘合剂及表面活性剂，反应层仅覆盖参比电极、工作电极，而不覆盖浓缩系数测定电极。
2.如权利要求1所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述绝缘基片选自下列所组成的群:聚氯乙烯片、玻璃纤维片、聚酯、电木片、PET片、PC片、PP片、PE片、PA片、PS片、玻璃片及陶瓷片。
3.如权利要求1所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述电极系统系以电绝缘层局部覆盖，使裸露于电绝缘隔离层一端分别形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极而与电化学电极反应区相连，而另一端则形成工作电极、参考电极、浓缩系数测定电极的接头，与检测样品在电化学反应时产生电效应的检测装置相连。
4.如权利要求3所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述电极系统的材料选用适合网版印刷的导电性浆状材质，例如碳胶、金胶、银胶、碳银混合胶、挥发性石墨或铜胶或其组合，或其它适合网版印刷的导电性浆状材料。
5.如权利要求1所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述电绝缘层的材料选用适合网版印刷的电绝缘性浆状材质或电绝缘性胶带，如热干燥型或紫外光干燥型的绝缘漆，或PVC或PET材质的绝缘胶带。
6.如权利要求5所述的 尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述电绝缘层的厚度为0.1至0.25毫米。
7.如权利要求1所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述反应层中包括与被测物质反应的酶和一种电子传递介体，同时还含有缓冲液、粘合剂及表面活性剂的调配物薄层。
8.如权利要求7所述的尿糖的测定方法中使用的生物传感器，其特征在于所述反应层的调配物薄层是以涂覆或滴加的方式加至该反应层后，于60°C下干燥。
9.尿糖的测定方法，其步骤为: a,在介体的存在下，利用氧化还原酶将尿液中的葡萄糖氧化还原； b，通过电极系统检测此时产生的氧化电流或还原电流，以上述电流值为基础计算葡萄糖浓度； C，测定上述尿液中的电导率、并利用该电导率校正尿液葡萄糖浓度的校正工序；电导率的测定方法为:准备含有工作电极和对电极的电极系统，在上述两电极中的工作电极上不配置介体，而在对电极上配置介体；将尿液导入至上述电极系统，在该状态下对上述电极系统施加电压，由此检测流至上述两电极间的氧化电流或还原电流，以该电流值为基础计算电导率值。
10.如权利要求9所述的尿糖的尿糖的测定方法，其特征在于所述电子介体为铁氰化钾，其含量为3% (m/m)至20% (m/m)。
11.如权利要求9所述的尿糖的尿糖的测定方法，其特征在于所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液组成的组中的一种；所述粘合剂采用淀粉、糊精、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述表面活性剂为TritonX-1OO或TW-20。
12.如权利要求9所述的尿糖的尿糖的测定方法， 其特征在于所述氧化还原酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖脱氢酶。
全文摘要
本发明的目的在于提供通过以高精度和高可靠性测定尿液电导率而能够充分且正确地校正的尿糖测定方法及该方法中使用的生物传感，制作工艺简单，成本低，使用方便。该方法的步骤为a，在介体的存在下，利用氧化还原酶将尿液中的葡萄糖氧化还原；b，通过电极系统检测此时产生的氧化电流或还原电流，以上述电流值为基础计算葡萄糖浓度；c，测定上述尿液中的电导率、并利用该电导率校正尿液葡萄糖浓度的校正工序。所述生物传感器包括绝缘基片、位于绝缘基片上的电极系统、电绝缘层和位于电化学电极反应区的反应层。
文档编号G01N27/416GK103105426SQ20131001833
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者梁明龙, 李中 申请人:桂林中辉科技发展有限公司