专利名称：大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于发情期雌性动物体内雌激素变化的检测方法，特别是涉及一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法。
背景技术：
大熊猫作为我国特有的珍稀濒危野生动物，其独特的生理特点吸引了大量的科研人员对其进行研究。雌性大熊猫为周期性单发情动物，多为春季发情、秋季产仔，在一次发情期中只有I 3天接受自然交配。在圈养条件下，只有50%左右的大熊猫自然交配，有一半左右的大熊猫需要通过人工授精完成繁殖。在最短的时间内判断大熊猫是否排卵，并进行人工授精，是圈养条件下大熊猫繁殖成功的关键。在早期的圈养大熊猫繁殖中，最主要的判断大熊猫是否发情排卵的依据来源于大熊猫的发情行为观察，包括精神、食欲、外阴颜色、乳头变化、是否有咩叫、是否出现待配姿势以及雄性大熊猫是否对雌性大熊猫出现交配欲望等。但由于以上方法无法完全量化，或者是某些行为在整个发情期均出现，所以无法非常准确地判断大熊猫是否排卵，从而是导致早期圈养大熊猫繁殖效率低下的重要原因。在实际大熊猫配种过程中，我们至少需要采集到大熊猫雌二醇峰值后2个以上的样品才能基本确定雌二醇峰值出现的时间，每次从收到尿样到得到结果至少需要3 5小时，往往我们得到的雌二醇峰值时间距我们收样的时间已经过去了近15小时，这使得我们进行适时自然交配或人工授精的时间非常紧促。
发明内容
本发明要解决的技术问题是一种缩短雌性大熊猫尿样检测时间、保障大熊猫有充裕自然交配时间或人工授精时间的大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法。为解决上述技术问题，本发明一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法，包括以下步骤:( 1)对雌性大熊猫进行尿样收集，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存；(2)用雌激素抗体R522-2将96孔酶标板过夜包被6 48小时；所述的包被是将抗体吸附在酶标板，目的是为了获得最高的灵敏度、特异性、均一性和稳定性；(3)将同一份尿样分成多小份；在96孔酶标板上选定好检测用孔；将浓度范围在0、1.95to500pg/孔，共10个等级的雌激素标准品做一系列等倍稀释；将一小份尿样按1:20,1:40,1:80U:160U:320……等等比例做一系列等倍稀释，越接近雌性大熊猫发情高峰时收集的尿样，其稀释倍数越高；然后分别将已稀释的雌激素标准品和尿样按顺序依次加入到已经包被好的96孔酶标板的检测用孔中；在96孔酶标板的每个检测用孔中加A Horseradish peroxidase溶液0.05mL,在37°C下孵育0.5小时后，用主要成分为NaCl、Tween20、H2O的洗液洗涤5次96孔酶标板；(4)将 0.04ml、浓度 0.5M 的 H2O2 和 0.125ml、浓度为 40mM 的 ABTS 加入到 12.5ml柠檬酸底液中，混合均匀成显色溶液；(5)往洗涤后的96孔酶标板的每个检测用孔中加入已配制好的显色溶液0.1ml,室温下孵育30 60分钟后用酶标仪读取光吸收值，所得数值为该大熊猫雌二醇值；(6)将另一小份尿样按1:10 40比例稀释，将浓度为0.lmg/ml的肌酐标准品稀释成0、6.25、12.5、25、50、100ug/ml，然后在另一 96孔酶标板上选定好检测用孔，将稀释的尿样和肌酐标准品稀稀分别按顺序依次加入到96孔酶标板上的检测用孔，再在每检测用孔中加入0.05mL、浓度为0.75N的NaOH和0.05mL、浓度为0.4N的苦味酸，在室温下孵育10 20分钟后，用酶标仪检测光密度值，所得数值为该大熊猫尿样肌酐值；当肌酐值低于
0.lmg/mL时认为样品被过度稀释，须重新采用其它小份尿样进行检测，直到所检测尿样的肌酐值不低于0.lmg/mL时为止；(7)用测到的该大熊猫雌二醇值除以该大熊猫肌酐值，所得结果为该大熊猫雌二醇浓度值，此浓度值为校正值。所述的一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤:(I)清洁并拖干兽舍地面；(2)将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍；(3)用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冰箱冷冻或冷藏。所述的一种大熊猫 雌 二醇浓度值的快速检测方法,其Horseradish peroxidase的中文名称为辣根过氧化物酶；其酶标仪的滤波片参数分别为405nm、450nm、540nm、490nm和630nm ;其ABTS的中文名称为联胺盐发色团；其Tween20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物；其计量单位中，HiL为毫升、M为摩尔、mM为毫摩尔、mg为毫克、ug为微克、pg为皮克、nm为纳米、N为当量。将12份雌性大熊猫尿样中的每I份均分为3小份，然后分别在三种不同条件下进行雌二醇浓度值的检测和相关性检验，结果如表I和表2所示:表1.三种检测方法得到的雌二醇浓度值
权利要求
1.一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法，包括以下步骤: (1)对雌性大熊猫进行尿样收集，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存； (2)用雌激素抗体R522-2将96孔酶标板包被6 48小时； (3)将雌激素标准品和尿样稀释后，分别按顺序依次加入到已经包被好的96孔酶标板孔中；在96孔酶标板孔中加入Horseradish peroxidase溶液,在37°C下孵育0.5小时后，用洗液洗漆96孔酶标板； (4)将H2O2和ABTS加入到柠檬酸底液中，混合均匀成显色溶液； (5)往洗涤后的96孔酶标板孔中加入已配制好的显色溶液，室温下孵育30 60分钟后用酶标仪读取光吸收值，所得数值为该大熊猫雌二醇值； (6)将尿样和肌酐标准品稀稀释后分别按顺序依次加入到96孔酶标板中，再在96孔酶标板孔中加入NaOH和苦味酸，在室温下孵育10 20分钟后，用酶标仪检测光密度值，所得数值为该大熊猫尿样肌酐值； (7)用测到的该大熊猫雌二醇值除以该大熊猫肌酐值，所得结果为该大熊猫雌二醇浓度值。
2.根据权利要求2所述的一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法，其每一次大熊猫尿样收集包括以下步骤: (1)清洁并拖干兽舍地面； (2)将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍； (3)用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即放入冰箱冷冻或冷藏。
全文摘要
本发明公开了一种大熊猫雌二醇浓度值的快速检测方法，在尿样检测结果没有差异的前提下，通过将传统室温下孵育2小时改变为37℃孵育0.5小时，使得大熊猫雌二醇浓度值的全部检测过程由原来的5小时缩短到2小时，检测时间缩短了60%，为适时自然交配和人工授精争取了宝贵的时间。
文档编号G01N21/17GK103217384SQ20131009247
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者罗娌, 侯蓉, 张志和, 黄河, 王成东, 兰景超, 黄祥明 申请人:成都大熊猫繁育研究基地