专利名称：一种基于单一标准品的四色荧光定量pcr方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒核酸检测，属于生物技术领域。本发明采用基于单一标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，通过一步法PCR扩增检测各类处理后标本中A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV) RNA，用于引起腹泻症候群的轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒的实验室快速检测和疫情监控。本发明对引物和探针的设计以及实验的实施也提出了更高的要求。
背景技术：
WHO估计全世界每年腹泻病例高达30-50亿例次，有50-100万病例因严重腹泻死亡，平均每天死亡2.5万人，特别在儿童更为突出。临床上小儿各种急性胃肠炎比较常见，可以引起患者呕吐、腹痛、腹泻等症状，是一种急性传染病，一般起病较急，可有发热及全身不适症状。引起急性腹泻的病原很多，可以包括细菌病毒或者其他微生物。自1972年发现诺瓦克病毒后，已相继发现和确立了多种引起腹泻的病毒并能在腹泻患者大便中直接检出病毒。目前研究较多的是各种致病性病毒包括轮状病毒(Rotavirus，RV)、诺如病毒(Norovirus, NV)、人星状病毒(Human Astrovirus, HAstV)以及肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71 )、柯萨奇病毒(Coxsackie virus, CAV)、札如病毒(Sapovirus, SV)和肠腺病毒(Enteric adenovirus, EADV)等。
轮状病毒主要感染婴幼儿，秋冬季高发；肠道腺病毒主要感染2岁以下患儿，夏秋季发病率较高。轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子呈圆形，由形似车轮而得名，为无囊膜病毒，病毒基因含有11个节段的双股线型RNA。目前将人和动物状病毒分为A D4个组。A组为普通轮状病毒(主要引起婴幼儿腹泻)；B组为猪轮状病毒和成人腹湾轮状病毒(Adult diarrhea rotavirus), C组为人和猪轮状病毒；D组为鸡和鸟类轮状病毒。具有11个片断的双股RNA基因组编码6个结构蛋白(VP1-4，VP6-7)和五个非结构蛋白(NSP1-5)，包裹在三层蛋白衣壳内；外层由两个蛋白组成，VP4和VP7，VP4(相对分子质量为88000)蛋白，呈穗状刺突突出于病毒粒子的表面，VP5包含宿主细胞融合区氨基酸384-401，与潜在融合区序列和抗原环绕的氨基酸305有关。VP7是病毒主要的衣壳蛋白。本发明主要针对A组轮状病毒检测。
诺如病毒最早是从1968年在美国诺瓦克市暴发的一次急性腹泻的患者粪便中分离的病原体，是单股正链RNA,全长约7642nt,包括3个开放阅读框(Open Reading Frame,0RF)。目前已对其100多个分离株进行基因测序。世界不同地区、不同时间流行的NV基因RNA多聚酶区序列相对保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的达到90%以上。NV包括5个基因群，感染人的包括基因1、11和IV群，其中以II群最多见，I群偶见，IV罕见报道。基因群I (Genogroup I，NVG I )还包括南安普顿病毒(Southampton virus)、沙漠风暴病毒(Desert Shield virus);基因群II (Genogroup II, NVG II)还包括雪山病毒(Snow Mountain virus)、夏威夷病毒(Hawaii virus)、多伦多病毒(Toronto virus)等。因此目前诺如病毒的检测引物以针对I (NVG I)和II (NVG II)群两种基因型为主。诺如病毒与在日本发现的札幌样病毒(Sapporo-like Virus, SLV)，现在的正式名称为札如病毒(Sapovirus, SV),合称为人类杯状病毒。
星状病毒性胃肠炎主要发生在5岁以下儿童，也可见于老年人。星状病毒于1975年由Appleton和Higgins采用电镜在腹泻儿童的粪便标本中首次发现，星状病毒科包括哺乳类星状病毒(Mamastroviruses)和鸟星状病毒(Avastroviruses)两个属，人类星状病毒归属于哺乳类星状病毒属。星状病毒呈球形，核衣壳为规则20面体，无胞膜，病毒颗粒直径为28nm，约10%的病毒颗粒有特征性的5 6个角；细胞培养获得的病毒颗粒直径为41nm，包括IOnm的刺突。人类星状病毒可分为7个血清型(AstV21 AstV27)，7个基因型，人类星状病毒血清型I (HastV21)是流行最广泛的血清型。核酸为单正链RNA，7.0kb，两端为非编码区，中间有三个重叠的开放读码框架(0RF)。该病毒呈世界性分布。
近年来，随着国家卫生主管部门对病毒性腹泻临床诊断和疫情防控的日益重视，病毒性腹泻症候群的病原体如A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)等的实验室检测成为一项极其重要的工作。
上述各种病毒血清型众多，临床上腹泻综合征往往是由一种或者多种病毒共同导致，这是病毒性感染性腹泻的普遍现象。在实验室诊断方法中，传统的病毒培养与血清中和试验方法是重要依据，但具有费时、繁琐且敏感性不高等局限性，而血清型的多样性又限制其血清学检测方法的应用。分子生物学检测技术的发展为肠道病毒的诊断与分类提供了快捷准确的方法。
基于RT-PCR方法的RNA病毒诊断技术是目前灵敏度最高的RNA检测技术。它以RNA为模板逆转录成互补DNA(cDNA)的第一条链，再以该链为模板进行PCR反应，由此可以检测出样品中极低拷贝数病毒核酸的特异性检测，克服了传统方法检测灵敏度低、操作繁琐的缺点。该方法准确快捷，一般可以在3-4个小时内得到准确的检测结果，是目前较理想的诊断技术，已在医学和生物学领域内得到了广泛应用。该方法主要依赖于针对A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)等设计特异性的引物，并对样品进行扩增后进行检测。
随着PCR技术的发展，以特异性Taqman荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RT-PCR技术，敏感性特异性都更具有明显优势，经临床样本的检测比较，该方法具有高的特异性，能检测IO2数量级的病毒核酸拷贝数，而且 比常规RT-PCR和病毒分离法更敏感、快速和简便。普通的RT-PCR从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需3-4小时左右，而采用荧光定量PCR技术从核酸提取至完成检测，仅需约2小时，并且能同时完成对多个样本检测同一个病毒核酸的检测。
多重荧光定量PCR克服了单种病毒单基因检测的缺点，可以同时针对多种病毒多基因进行检测，真正意义上实现了高通量检测。在同一PCR反应管里通过一步法PCR扩增检测各类处理后标本中A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV) RNA,并使用不同的荧光定量标准品，进行PCR扩增的监控和病毒负荷的定量，用于引起腹泻症候群的A组轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒的实验室快速检测和疫情监控。
本发明的方法为基于单一个荧光定量标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，根据如果基因扩增效率一致，那么相同的CT (Threshold Cycle)值对应相同的模板起始拷贝数的数学原理，针对A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒构建同一个扩增标准品，在同一 PCR反应管里通过一步法PCR扩增检测A组轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒RNA的存在以及病毒负荷。
本发明对引物和探针的设计以及实验的实施也提出了更高的要求。
本发明的创新之处在于突破了传统多重荧光定量PCR需要制备多种标准品的的不足，提高了试剂制备的工艺和检测的效率。
本发明进一步涉及一种基于单一标准品的A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四重四色荧光定量PCR检测试剂盒。发明内容
本发明的方法为基于单一个荧光定量标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，在基因扩增效率一致的条件下，相同的CT (Threshold Cycle)值对应相同的模板起始拷贝数，针对A组轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒四种病毒设计特异性的引物和探针，采用FAM、HEX、R0X和CY5四种荧光信号通道，优化反应体系和反应条件，在同一 PCR反应管里通过一步法PCR扩增检测上述病毒RNA。
本发明的检测方法实验步骤包括: O感染或疑似样本采集和运送； 2)样本预处理和提取RNA； 3)一步法四重四色荧光定量PCR对样本进行检测； 4)根据单一标准品的扩增曲线标本中的病毒进行精确定量。
本发明的创新之处在于突破了传统多重荧光定量PCR需要制备多种标准品的的不足，提高了试剂制备的工艺和检测的效率。
根据上述技术突破，本发明进一步提供了一种基于单一标准品的A组轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒四重四色荧光定量PCR检测试剂盒。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明对引物和探针的设计提出了更高的要求。
根据本发明的一个 优选实施方案，按照多重荧光定量PCR的引物和探针的设计原理和要求，对A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒进行充分的生物信息学分析，根据保守区设计特异性的引物和荧光探针如下: A组轮状病毒:上游引物 HRVA-Fl:5’ -TGACCCTCTATGAGCACAATAGTT-3’ (SEQ ID N0.1)； 下游引物 HRVA-Rl:5，-CACATAACGCCCCTATAGCC-3，(SEQ ID N0.2)； 荧光探针HRVA-P:5’-FAM-AAAGCTAACACTGTCAAAAACCTAA-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.3)； 诺如病毒I群:上游引物 NVG 1-Fl:5’ -TGGATGCGBTTCCATGA-3’ (SEQ ID N0.4)；下游引物 NVG 1-Rl:5，-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3，(SEQ ID N0.5)； 荧光探针NVG 1-P:5’ -HEX-CAGGAGATCGCAATCTCCTGCCCGA-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.6)； 诺如病毒II群:上游引物 NVG I1-Fl:5’ -ATTCTCDGAYCTSAGCACRT-3’ (SEQ ID N0.7)；下游引物 NVG I1-Rl:5，-TCGACGCCATCTTCATTCAC-3，(SEQ ID N0.8)；荧光探针 NVG I1-P:5’ -R0X-AGGGCGATCGCAATCTGGCTCCC-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.9)； 人星状病毒:上游引物 HAstV-Fl:5’ -CATCTGGAAGCCGCGG-3’ (SEQ ID N0.10)；下游引物 HAstV-Rl:5’ -TAAAATAATCTAAACAGAGACAGAAAAG-3’ (SEQ ID N0.11)；荧光探针 HAstV-P:5’ -CY5CACGCCGAGTAGGAACGAGGGTACAG-BHQ1-3’ (SEQ ID N0.12)；根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测对A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒RNA的特异性靶区域为: A组轮状病毒:TGACCCTCTATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAAAAACCTAAATGGCTATAGGGGCGTTATGTG(SEQ ID N0.13)； 诺如病毒I群:TGGATGCGCTTCCATGATCTCGGATTGTGGACAGGAGATCGCGATCTCCTGCCCGAATTCGTAAATGATGATGCCGTCTAAGG (SEQ ID N0.14)； 诺如病毒II群:ATTCTCGGACCTGAGCACGTGGGAGGGCGATCGCAATCTGGCTCCCAGTTTTGTGAATGAAGATGGCGTCGA(SEQ ID N0.15)； 人星状病毒:CATCTGGAAGCCGCGGCCACGCCGAGTAGGAACGAGGGTACAGCTTCCTTCTTTTCTGTCTCTGTTTAGATTATTTTA (SEQ ID N0.16)。
本发明为单一标准品的四重四色荧光定量PCR方法，根据本发明的一个优选实施方案，针对上述A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒的靶序列进行分析并在各序列之间引入无义序列，设计4段不同的标准品序列，每个片段在100-120bp之间，接`头处有不少于6-8个序列重复，以病毒靶片段为模版进行第二次扩增。在体外将所有对应的片段混合作为模板经第三次PCR扩增即可拼接得到单一的长片段基因，作为单一标准品的核酸序列，克隆入PMD18-T载体，制备成标准品。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说试剂盒是一种用于快速实时定量检测A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒的试剂盒，该试剂盒包括: 1)病毒核酸提取试剂； 2)逆转录酶系和Taq酶系；3)四色荧光PCR反应体系(PCRMIX)； 4)单一阳性标准品和阴性质控品等。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的检测上述四种病毒RNA的四荧光定量PCR反应体系(PCR MIX)是由A组轮状病毒(HRVA)特异性上游和下游弓I物、一条特异性荧光探针(FAM荧光标记)、诺如病毒I群(NVG I )的特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(HEX荧光标记)、诺如病毒II群(NVG II)特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(R0X荧光标记)、人星状病毒(HAstV)的特异性上游和下游引物、一条特异性荧光探针(CY5荧光标记)、PCR Buffer (内含镁离子、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体(dNTPs)、PCR扩增增强剂和去离子水等成分构成的反应体系。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的PCR反应体系(PCR MIX)的按照如下方式配制: 每份反应液(PCR MIX)体积为20.0ul，制备方法如下: IOXBuffer2.5ul dNTP (IOmM)0.75ul HRVA-Fl (50uM) 0.2ul HRVA-Rl (50uM) 0.2ul NVG 1-Fl (50uM) 0.2ul NVG 1-Rl (50uM) 0.2ul NVG I1-Fl (50uM) 0.2ul NVG I1-Rl (50uM) 0.2ul HAstV-Fl (50uM) 0.2ul HAstV-Rl (50uM) 0.2ul HRVA-P (50uM) 0.15ul NVG 1-P (50uM) 0.15ul NVG I1-P (50uM) 0.15ul HAstV-P (50uM)0.15ul NH4C1 (0.5M)0.5ul DDH2014.55ul 总计20.0ul 使用时依次按量加入如下试剂，_
权利要求
1.本发明的基于单一标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，其特征在于采用单一的标准品作为实验的阳性对照和定量标准通过一步法PCR扩增检测各类处理后标本中A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV) RNA，用于引起腹泻症候群的常见的A轮状病毒、诺如病毒I群、诺如病毒II群和人星状病毒的实验室快速高通量检测和疫情监控。
2.根据权利要求1所述的一种检测方法，本发明的检测方法实验步骤包括:1)感染或疑似样本采集和运送；2)样本预处理和提取RNA ；3) 一步法四重四色荧光定量PCR样本进行检测；4)根据单一标准品的扩增曲线标本中的病毒进行精确定量。
3.根据权利要求1所述的检测方法和试剂盒，用于检测A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)特异性的引物和荧光探针为:A组轮状病毒上游引物HRVA-Fl (SEQ ID N0.1)、下游引物HRVA-Rl (SEQ ID N0.2)和荧光探针HRVA-P (SEQ ID N0.3);诺如病毒I群上游引物NVG 1-Fl (SEQ ID N0.4)、下游引物NVG 1-Rl (SEQ ID N0.5)和荧光探针NVG 1-P (SEQ ID N0.6);诺如病毒II群上游引物 NVG I1-Fl (SEQ ID N0.7)、下游引物 NVG I1-Rl (SEQ ID N0.8)和荧光探针 NVG I1-P(SEQ ID N0.9);人星状病毒上游引物 HAstV-Fl (SEQ ID N0.10)、下游引物 HAstV-Rl (SEQID N0.11)和荧光探针 HAstV-P (SEQ ID N0.12)。
4.根据权利要求3所述的特异性引物和探针，四种病毒RNA的四重四色荧光定量PCR特异性扩增检测的靶区域分别是:A组轮状病毒(SEQ ID N0.13)、诺如病毒I群(SEQ IDN0.14)、诺如病毒 II群(SEQ ID N0.15)和人星状病毒(SEQ ID N0.16)。
5.根据权利要求1所述的一种试剂盒，针对A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV)四种病毒的靶序列进行分析并在各序列之间引入无义序列，设计4段不同的标准品序列，每个片段在100-120bp之间，接头处有不少于6-8个序列重复，以病毒靶片段为模版进行第二次扩增，在体外将所有对应的扩增片段混合作为模板经第三次PCR扩增即可拼接得到单一的长片段基因，作为单一标准品的核酸序列，克隆入PMD18-T载体，制备成标准品。
6.根据权利要求1所述的一种单一标准品的四重四色荧光定量PCR检测试剂盒，制备该种制备成 标准品的用到的引物为A组轮状病毒上游引物HRVA-F2 (SEQ ID N0.17)和下游引物HRVA-R2 (SEQ ID N0.18)，扩增片段为(SEQ ID N0.19);诺如病毒I群上游引物NVG 1-F2 (SEQ ID N0.20)和下游引物 NVG 1-R2 (SEQ ID N0.21)，扩增片段序列为(SEQID N0.22);诺如病毒 II群上游引物 NVG I1-F2 (SEQ ID N0.23)、下游引物 NVG I1-R2 (SEQID N0.24)，扩增片段序列为(SEQ ID N0.25);针对人星状病毒上游引物HAstV_F2 (SEQ IDN0.26)和下游引物HAstV-R2 (SEQ ID N0.27)，扩增片段序列为(SEQ ID N0.28)，最终经过第三次扩增HRVA-NVG 1-NVG I1-HAstV单一标准品的模板片段序列为(SEQ ID N0.29)。
7.根据权利要求1其中所述的试剂盒，反应体系(PCRMIX)的按照如下方式配制:每份反应液(PCR MIX)体积为20.0ul，然后加入逆转录酶系1.0ul、Taq酶系1.0ul、RNA/标准品/阴性对照3.0ul，无需经过单独进行逆转录反映直接一步法进行扩增。
8.根据权利要求1所述的四重荧光定量PCR试剂盒，每个反应槽同时选择FAM、HEX、ROX和CY5荧光通道，分别对应A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒I群(NVG I )、诺如病毒II群(NVG II)和人星状病毒(HAstV) RNA的检测。
9.根据权利要求1所述的四重荧光定量PCR试剂盒，使用Stratagene公司的Mx3000P和 Mx3005P、ABI PRISM7300/7500, ABI PRISM 7700、ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、MJ Opticon等使用荧光定量PCR仪，扩增条件为42°C—20分钟，然后93°C—2分钟，然后930C 30秒一55°C 45秒(在此步骤采集荧光信号)，40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种基于单一标准品的四重四色的荧光定量PCR技术，通过一步法四重光PCR扩增检测各类处理后标本中的A组轮状病毒(HRVA)、诺如病毒Ⅰ群(NVGⅠ)、诺如病毒Ⅱ群(NVGⅡ)和人星状病毒(HAstV)RNA，并对病毒负荷进行定量。本发明的创新之处在于针对四种病毒的四重四色荧光定量PCR检测采用单一标准品作为阳性对照和定量标准，突破了传统多重荧光定量PCR需要制备多个标准品的不足，提高了实验检测的效率，降低了污染的机会，同时提高了试剂盒制备和生产的效率。可用于引起腹泻症候群的A组轮状病毒、诺如病毒和星状病毒的实验室快速高通量检测和疫情监控。本发明属于生物技术领域。
文档编号G01N21/64GK103146846SQ20131009207
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者刘健翊, 周孟, 陈瑶, 王宝玉, 廖杰, 叶奕东, 黄佳柳, 莫海月, 徐德峰, 黄常艳, 徐贵云 申请人:广州维伯鑫生物科技有限公司