专利名称：变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种应用电激发信号的条件阈值来衡量独立阈值以下变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，尤其涉及一种在基于微电极阵列的神经信号激励与探测系统下研究独立阈值以下变浓度的药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，属于神经科学与生物电子学的交叉领域。
背景技术：
神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，对于神经科学方面的研究一直是现代科学研究的热点问题。目前关于药物对神经系统作用方面的研究主要是从分子、细胞、动物三个水平进行，其中细胞水平的研究由于具有快速、简便、易操作等特点受到研究者的广泛关注。而药物对神经细胞的影响主要表现在神经细胞的放电活动、神经递质的合成与释放、膜受体、离子通道的改变等方面。1972年，Thomas等人引入了微电极阵列(MEA)的概念，自此科学家们开发了各种形式的微电极阵列，用来对包括神经元在内的多种细胞进行电信号记录实验。微电极阵列的出现，为神经科学的研究提供了一种新的细胞外记录方法。现在国际上众多科学家都在应用微电极阵列进行药理、毒理、药物筛选方面的研究，如美国约翰霍普金斯大学研究小组应用微电极阵列研究软骨藻酸对大鼠皮层神经元的自发放电活动的影响；德国罗斯托克大学研究小组应用微电极阵列研究免疫抑制剂环孢霉素A对大鼠脑神经网络电活动的影响。但是，目前国际上应用微电极阵列进行的药物对神经细胞放电活动影响的研究主要集中在药物单独作用下对神经细胞自发放电活动的影响，表现为峰电位幅值、峰电位频率、爆发电位频率、爆发电位持续时间等参数与药物浓度之间的变化曲线，进一步来确定待测药物对神经细胞放电的影响(兴奋作 用或抑制作用)。但是这些研究需要长时程观察药物施加前后神经细胞放电活动的变化，并且研究的药物浓度范围只是阈值浓度以上范围内的，无法研究待测药物在阈值以下浓度时对神经细胞放电的影响。
发明内容
本发明提供一种能够快速确定神经细胞放电性能的变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法。本发明所述方法采用以下技术方案:步骤I取带有生物相容性玻璃套环(2)的微电极阵列芯片(I)；步骤2将体外培养的神经细胞制备成每毫升10000 100000个细胞的细胞悬液，再将I 2ml的细胞悬液加入到生物相容性玻璃套环(2)中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列(3)的微电极接触，形成生物电接口 ；步骤3使用光学显微镜观察微电极阵列芯片(I)的微电极阵列上的神经细胞，并选定微电极阵列上有神经细胞跨接的两个电极分别作为激励电极和探测电极，将微电极阵列芯片(I)放于微电极阵列MEA系统的支架(7)上，随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中原有的培养液，取含有I μ g/ml浓度的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中；令11=1, η为当前检测次数，步骤4由微电极阵列MEA系统产生电压幅值为ImV的激发脉冲信号并施加到激励电极上，使用微电极阵列MEA系统实时监测探测电极上电信号的变化，以ImV为增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，直到微电极阵列MEA系统监测到探测电极上产生标准神经动作电位信号，将产生标准神经动作电位信号时的激发脉冲信号的电压幅值作为当前药物浓度下神经细胞产生动作电位的电激发信号条件阈值；随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中的药物培养液，并令η=η+1，步骤5将药物加到培养液中，配制得到质量浓度为I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的药物培养液，如果药物培养液的浓度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于药物的独立阈值，则取浓度为I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中，返回步骤4，否则，检测结束。与现有技术相比，本发明具有如下优点:I)本发明将电信号与药物同时作为神经细胞的激发因子，将电激发信号条件阈值作为一种尺度来衡量独立阈值以下变浓度药物对神经细胞放电性能的影响。相比于其他应用微电极阵列研究药物对神经细胞放电活动作用的方法，本发明不必长时间观察并记录神经细胞的峰电位和爆发电位参数变化，根据获得的电压信号激发条件阈值与药物浓度之间的变化曲线，可以快速确定独立阈值以下各浓度的待测药物对神经细胞放电的影响程度。2)本发明提供了一种研究独立阈值以下变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，弥补了现有方法只能研究独立阈值及以上浓度药物对神经细胞放电性能影响的缺陷。通过获得电压信号激发条件阈值与药物浓度之间的变化曲线，定量的研究独立阈值以下的个浓度药物对神经细胞放电性能的影响。3)本发明提供了一 种当待测药物的种类确定、其浓度-激发电压条件阈值变化曲线已知而浓度未知时，利用测量得到的神经细胞动作电位激发电压的条件阈值来确定培养液中待测药物浓度的方法。
图1是本发明中使用的电信号激励脉冲信号波形图。图2是本发明中应用微电极阵列芯片培养神经细胞的示意图。图3是本发明应用的神经信号激励与探测系统示意图。图4是本发明实施的流程图。图5是本发明实施例中PC12类神经细胞的电信号激发条件阈值与乙酰胆碱浓度关系折线图。图6是本发明验证例中PC12类神经细胞的平均峰电位发放数目与乙酰胆碱浓度关系折线图。
具体实施例方式实施例1变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，操作如下
步骤I取带有生物相容性玻璃套环(2)的微电极阵列芯片(I);步骤2将体外培养的神经细胞制备成每毫升10000 100000个细胞的细胞悬液，再将I 2ml的细胞悬液加入到生物相容性玻璃套环(2)中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列(3)的微电极接触，形成生物电接口 ；步骤3使用光学显微镜观察微电极阵列芯片(I)的微电极阵列上的神经细胞，并选定微电极阵列上有神经细胞跨接的两个电极分别作为激励电极和探测电极，将微电极阵列芯片(I)放于微电极阵列MEA系统的支架(7)上，随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中原有的培养液，取含有I μ g/ml浓度的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中；令η=1, η为当前检测次数，步骤4由微电极阵列MEA系统产生电压幅值为ImV的激发脉冲信号并施加到激励电极上，使用微电极阵列MEA系统实时监测探测电极上电信号的变化，以ImV为增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，直到微电极阵列MEA系统监测到探测电极上产生标准神经动作电位信号，将产生标准神经动作电位信号时的激发脉冲信号的电压幅值作为当前药物浓度下神经细胞产生动作电位的电激发信号条件阈值；随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中的药物培养液，并令η=η+1，步骤5将药物加到培养液中，配制得到质量浓度为I μ g/ml+ (η_1)*1 μ g/ml的药物培养液，如果药物培养液的浓度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于药物的独立阈值，则取浓度为I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中，返回步骤4，否则，检测结束。本实施例中应用的药物为神经递质、受体拮抗剂、受体激动剂、离子通道阻断剂、免疫抑制剂、酶抑制剂、抗过敏药物、抗癫痫药、麻醉药、β -淀粉样物质、抗氧化物、酒精及有毒物质中的一种，所述神经递质为多巴胺DA、去甲肾上腺素NE、肾上腺素Ε、5-羟色胺、Y-氨基丁酸GABA、甘氨 酸、谷氨酸、组胺及乙酰胆碱中的一种；所述受体拮抗剂为荷包牡丹碱，DL-2-氨基-5-磷羧基戊酸ΑΡ5、环噻嗪、苦味毒及盐酸美金刚胺中的一种；所述受体激动剂天门冬氨酸NMDA、地佐环平ΜΚ-801、喹喔啉NBQX及SDF-1 α中的一种；所述离子通道阻断剂为河豚毒素、钕蝎毒、4-氨基吡啶、利诺吡啶及普瑞巴林中的一种；所述免疫抑制剂为环孢霉素Α、环磷酰胺、甲氨喋呤及顺钼化合物中的一种；所述酶抑制剂为胆碱酯酶抑制剂和甲硫氨酸亚矾胺中的一种；所述抗过敏药物为扑尔敏、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪、咪唑斯汀、地氯雷他定及左西替利嗪中的一种；所述抗癫痫药为左乙拉西坦、加巴喷丁及奥卡西平中的一种；所述麻醉药为吗啡、利多卡因、大麻素、海洛因及阿片中的一种；所述抗氧化物为甲硫氨酸和左旋肉碱中的一种；所述有毒物质为拟除虫菊酯、避蚊胺、软骨藻酸、蜘蛛毒素、三甲基氯化锡ΤΝΤ、甲基氯化汞、对硫磷、对氧磷及醋酸锌中的一种。本实施例中药物的独立阈值的确定方法如下:步骤5.1取带有生物相容性玻璃套环(2)的微电极阵列芯片(I)；步骤5.2取与上述步骤2中相同的神经细胞，将体外培养的神经细胞制备成每毫升10000 100000个细胞的细胞悬液，再将I 2ml的细胞悬液加入到生物相容性玻璃套环(2)中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列(3)的微电极接触，形成生物电接Π ；步骤5.3将微电极阵列芯片(I)放于微电极阵列MEA系统的支架(7)上，随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中存在的培养液，取含有I μ g/ml浓度的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中；$m=l，m为当前检测次数，步骤5.4使用微电极阵列MEA系统实时监测所有探测电极上电信号的变化，检测是否有标准神经动作电位产生，若产生标准神经动作电位，则把此时的药物浓度作为该药物的独立阈值，停止检测；若未产生标准神经动作电位，则用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中的药物培养液,并令m=m+l,继续步骤5.5 ；步骤5.5将药物加到培养液中，配制得到质量浓度为I μ g/ml+ (m_l )*1 μ g/ml的药物培养液，返回步骤5.4。实施例2PC12类神经细胞是指小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞经神经生长因子作用后向神经细胞分化的类神经细胞，具有交感神经细胞的功能。本实施例介绍了一种变浓度乙酰胆碱作用下PC12类神经细胞放电性能的检测方法。第一步，制备细胞悬液并接种到微电极阵列芯片上。使用胶头滴管将培养在细胞培养瓶内的PC12类神经细胞从瓶壁上吹下，使其悬浮在细胞培养瓶内的细胞培养液内，将细胞培养瓶内的细胞悬液取出放入50ml离心管内，使用IOml移液枪将离心管内的细胞悬液混匀，然后使用血球计数板计数上述细胞悬液的细胞浓度，通过加入PC12类神经细胞培养液将细胞悬液的细胞浓度调整为IX IO4个/ml，取I 2ml细胞悬液添加到由德国MCS公司购买的微电极阵列芯片I的生物相容性玻璃套环2内，微电极阵列芯片上事先已加入I 2ml PDL液包被12小时，使PC12类神经细胞在微电极阵列芯片I上培养一段时间；第二步，获得乙酰胆碱的独立阈值。PC12类神经细胞在芯片I上培养3天以后，在光学显微镜下观察PC12类神经细胞的生长状态，将存在PC12类神经细胞贴壁生长并形成细胞间连接的微电极阵列芯片I放于微电极阵列系统的微电极阵列支架7上，事先将购买的乙酰胆碱粉末溶解在 PC12类神经细胞培养液中，按照I μ g/ml的浓度梯度配制成I μ g/ml 10 μ g/ml的10种乙酰胆碱培养液，选定乙酰胆碱的起始浓度为I μ g/ml，首先将生物相容性玻璃套环2内原有的培养基小心吸出，并将浓度为I μ g/ml的乙酰胆碱培养液加入到微电极阵列芯片I的生物相容性玻璃套环2内，同时通过微电极阵列系统实时监测微电极阵列芯片I上所有微电极探测到的PC12类神经细胞的电信号，若PC12类神经细胞未产生标准神经动作电位，则按照I μ g/ml的浓度梯度增加乙酰胆碱的浓度，直至PC12类神经细胞初次产生标准神经动作电位为止，将使PC12类神经细胞初次产生标准神经动作电位的乙酰胆碱浓度作为乙酰胆碱的独立阈值；第三步，获得PC12类神经细胞在独立阈值以下变浓度乙酰胆碱作用下的电信号激发条件阈值，在光学显微镜下观察已在芯片I上培养3天的PC12类神经细胞的生长状态，选择细胞贴壁生长并形成细胞间连接的微电极阵列芯片1，如图2所示，选择在两个电极之间有神经细胞跨接的电极分别作为激励电极4和探测电极6，然后将微电极阵列芯片I放于微电极阵列系统的微电极阵列支架7上,按照第二步方法事先配制I μ g/ml 8μ g/ml的8种乙酰胆碱培养液，通过第二步已得到乙酰胆碱的独立阈值为8 μ g/ml，选定乙酰胆碱的起始浓度为I μ g/ml，首先将生物相容性玻璃套环2内原有的培养基小心吸出，并将浓度为I μ g/ml的乙酰胆碱培养液加入到微电极阵列芯片I的生物相容性玻璃套环2内，通过微电极阵列MEA系统支架7上的刺激信号发生器产生如图1所示的电荷平衡双向非对称激发电压脉冲，其中电信号激发电压幅值可调，在生物相容性玻璃套环2中加入乙酰胆碱培养液的同时，由微电极阵列MEA系统产生电压幅值为ImV的激发脉冲信号并施加到激励电极4上，使用微电极阵列MEA系统实时监测探测电极6上电信号的变化，以ImV为增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，直到微电极阵列MEA系统监测到探测电极6上产生标准神经动作电位信号，将产生标准神经动作电位信号时的激发脉冲信号的电压幅值作为I μ g/ml浓度乙酰胆碱作用下PC12类神经细胞产生动作电位的电激发信号条件阈值；随后按照I μ g/ml的浓度梯度依次增加乙酰胆碱的浓度直至8 μ g/ml独立阈值，并按照上述I μ g/ml浓度下电激发信号条件阈值的获得方法，得到2 μ g/ml 8 μ g/ml浓度乙酰胆碱作用下的电压信号激发条件阈值。如表I所示，分别得到I μ g/ml 8μ g/ml浓度乙酰胆碱作用下，电压信号激发PC12类神经细胞产生动作电位的条件阈值；为了实验的完整性，在未将乙酰胆碱加入微电极阵列芯片之前，通过微电极阵列MEA系统支架7上的刺激信号发生器产生如图1所示的电荷平衡双向非对称激发电压脉冲，首先将电压幅值为ImV的激发脉冲信号施加到激励电极4上，使用微电极阵列MEA系统实时监测探测电极6上电信号的变化，以ImV为 增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，直到微电极阵列MEA系统监测到探测电极6上产生标准神经动作电位信号，当前的激发脉冲信号电压幅值则为
Oμ g/ml乙酰胆碱作用下的电压信号激发条件阈值，如表I所示。根据电信号激发条件阈值与乙酰胆碱浓度关系折线图，如图4所示，可以看出在乙酰胆碱浓度在I 2 μ g/mL时，PC12类神经细胞产生响应的电信号激发幅值为33、30mV，与未加乙酰胆碱时的电信号激发幅值35mV比较接近，当再加大乙酰胆碱的浓度时，PC12类神经细胞产生响应所需的电信号激发幅值逐渐减小，并且浓度越大时，每增加一个单位的浓度，电信号激发幅值减少量逐渐减少，直到浓度为8 μ g/ml时，乙酰胆碱单独作用也能产生动作电位，此时为乙酰胆碱的独立阈值。同时根据电信号激发条件阈值与乙酰胆碱浓度关系折线图可以看出，乙酰胆碱对PC12类神经细胞具有兴奋性作用，并且这种兴奋作用具有浓度依赖特性，当加入乙酰胆碱的浓度逐渐增加之后，PC12神经细胞受电信号激发产生动作电位的激发幅值也逐渐降低，表明乙酰胆碱对PC12类神经细胞的放电性能具有增强作用。本实施例中根据独立阈值以下8种浓度乙酰胆碱作用下PC12类神经细胞的电压信号激发条件阈值，快速确定了乙酰胆碱作用下PC12类神经细胞放电性能的变化。表I不同乙酰胆碱浓度下，电信号对PC12类神经细胞的激发条件阈值
权利要求
1.一种变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，其特征在于， 步骤I取带有生物相容性玻璃套环(2)的微电极阵列芯片(I); 步骤2将体外培养的神经细胞制备成每毫升10000 100000个细胞的细胞悬液，再将I 2ml的细胞悬液加入到生物相容性玻璃套环(2)中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列(3)的微电极接触，形成生物电接口 ； 步骤3使用光学显微镜观察微电极阵列芯片(I)的微电极阵列上的神经细胞，并选定微电极阵列上有神经细胞跨接的两个电极分别作为激励电极和探测电极，将微电极阵列芯片(I)放于微电极阵列MEA系统的微电极阵列支架(7)上,随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中原有的培养液，取含有I μ g/ml浓度的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中；令η=1, η为当前检测次数， 步骤4由微电极阵列MEA系统产生电压幅值为ImV的激发脉冲信号并施加到激励电极上，使用微电极阵列MEA系统实时监测探测电极上电信号的变化，以ImV为增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，直到微电极阵列MEA系统监测到探测电极上产生标准神经动作电位信号，将产生标准神经动作电位信号时的激发脉冲信号的电压幅值作为当前药物浓度下神经细胞产生动作电位的电激发信号条件阈值；随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中的药物培养液，并令η=η+1， 步骤5将药物加到培养液中，配制得到质量浓度为I μ g/ml+ (η-1)*1 μ g/ml的药物培养液，如果药物培养液的浓度I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml小于药物的独立阈值,则取浓度为I μ g/ml+ (n-1) *1 μ g/ml的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中，返回步骤4，否则，检测结束。
2.根据权利要求1所述的变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，其特征在于 ，所述药物为神经递质、受体拮抗剂、受体激动剂、离子通道阻断剂、免疫抑制剂、酶抑制剂、抗过敏药物、抗癫痫药、麻醉药、β_淀粉样物质、抗氧化物、酒精及有毒物质中的一种，所述神经递质为多巴胺DA、去甲肾上腺素NE、肾上腺素Ε、5-羟色胺、Y -氨基丁酸GABA、甘氨酸、谷氨酸、组胺及乙酰胆碱中的一种；所述受体拮抗剂为荷包牡丹碱，DL-2-氨基-5-磷羧基戊酸ΑΡ5、环噻嗪、苦味毒及盐酸美金刚胺中的一种；所述受体激动剂天门冬氨酸NMDA、地佐环平ΜΚ-801、喹喔啉NBQX及SDF-1 α中的一种；所述离子通道阻断剂为河豚毒素、钕蝎毒、4-氨基吡啶、利诺吡啶及普瑞巴林中的一种；所述免疫抑制剂为环孢霉素Α、环磷酰胺、甲氨喋呤及顺钼化合物中的一种；所述酶抑制剂为胆碱酯酶抑制剂和甲硫氨酸亚矾胺中的一种；所述抗过敏药物为扑尔敏、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪、咪唑斯汀、地氯雷他定及左西替利嗪中的一种；所述抗癫痫药为左乙拉西坦、加巴喷丁及奥卡西平中的一种；所述麻醉药为吗啡、利多卡因、大麻素、海洛因及阿片中的一种；所述抗氧化物为甲硫氨酸和左旋肉碱中的一种；所述有毒物质为拟除虫菊酯、避蚊胺、软骨藻酸、蜘蛛毒素、三甲基氯化锡ΤΝΤ、甲基氯化汞、对硫磷、对氧磷及醋酸锌中的一种。
3.根据权利要求1所述的变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，其特征在于，所述药物的独立阈值的确定方法如下: 步骤5.1取带有生物相容性玻璃套环(2)的微电极阵列芯片(I)； 步骤5.2将体外培养的神经细胞制备成每毫升10000 100000个细胞的细胞悬液，再将I 2ml的细胞悬液加入到生物相容性玻璃套环(2)中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列(3)的微电极接触，形成生物电接口 ； 步骤5.3将微电极阵列芯片(I)放于微电极阵列MEA系统的支架(7)上，随后用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中存在的培养液，取含有I μ g/ml浓度的药物培养液Iml添加到生物相容性玻璃套环(2)中；令111=1, m为当前检测次数， 步骤5.4使用微电极阵列MEA系统实时监测所有探测电极上电信号的变化，检测是否有标准神经动作电位产生，若产生标准神经动作电位，则把此时的药物浓度作为该药物的独立阈值，停止检测；若未产生标准神经动作电位，则用移液枪吸出生物相容性玻璃套环(2)中的药物培养液，并令m=m+l，继续步骤5.5 ； 步骤5.5将药物加到培养液中，配制得到质量浓度为I μ g/ml+μ g/ml的药物培养液，返回步骤5. 4。
全文摘要
本发明公开一种变浓度药物作用下神经细胞放电性能的检测方法，其特征在于首先将体外培养的神经细胞制成细胞悬液加入到微电极阵列芯片的生物相容性玻璃套环中，并使神经细胞的部分胞壁结构与微电极阵列的微电极接触，形成生物电接口，将1μg/ml浓度的药物添加到生物相容性玻璃套环中，将微电极阵列芯片放入微电极阵列系统支架上，由微电极阵列MEA系统产生1mV的激发脉冲信号激励神经细胞，以1mV为增量由低到高逐渐改变激发脉冲信号的电压幅值，将神经细胞产生标准动作电位信号时的激发脉冲信号的电压幅值作为当前药物浓度下的电激发信号条件阈值；随后按照1μg/ml浓度梯度改变药物浓度，继续探测相应的电信号激发条件阈值。
文档编号G01N27/92GK103245724SQ20131019115
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月21日 优先权日2013年5月21日
发明者吕晓迎, 王志功, 李贤 申请人:东南大学