利用神经元样本中重复性电活动的分析进行精神活性物质的体外检测和表征的方法和装置的制作方法

专利名称：利用神经元样本中重复性电活动的分析进行精神活性物质的体外检测和表征的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测体外神经元组织样本中的精神活性化合物的方法，其优选通过在将候补样本引入体外神经元组织样本中之前和之后检测细胞外电压的振荡来实施，本发明也涉及实现该方法的装置。对细胞外电压参数的分析产生对候补样本中存在精神活性物质的指示和有关它的药理学活性和化合物的信息。此外，本发明包括在体外样本中引发和维持重复性神经元活动存在的过程。另外，本发明包括通过在体外神经元组织样本中引入刺激成分来刺激或引发重复性神经元活动、例如EEG的方法，其中所述刺激成分包括能促进或模仿乙酰胆碱、5-羟色胺或儿茶酚胺作用的化合物，例如卡巴胆碱。
背景技术：
将小型哺乳动物海马中有节律的活动归入三个频带进行描述4-10Hz(θ)，10-30Hz(β)，和30Hz(γ)以上(Traub等人，1998；1999一个近期讨论)。迄今为止，其中研究最多的是θ，θ与其它情况中的运动活性(Vanderwolf，1969)和记忆编码有关(Landfield等人，1972；Vertes and Kocsis，1997)。根据后一观点，在θ与长期强化之间存在密切关系(Larson和Lynch，1986；Larson等人，1986；1993)，这可能是某种记忆形式的基质。近来较高频率节律的功能关联已成为值得关注的兴趣主题。γ活性首先在嗅觉系统进行了分析(Freeman，1975早期评论)，其结论是，它使得气味到来之前，在嗅球、梨形皮层和内嗅区皮层之间发生联接(Kay和Freeman，1998)。在暗示表达过程中，在视觉皮层内也出现活动归入γ范围(Gray和Singer，1989)，其中建议使细胞与不同的接受域瞬时同步。依照该假说，同步作用使暗示的多个特征组合成相干表达(Singer，1998评论)。在讨论高频海马活动时β节律通常不能与γ波区别开，尽管它们可以在海马切片中被选择性地诱导(Boddeke等人，1997)。在任何情况下，高频同步对端脑皮层中的相关操作非常必要这一观点的越来越多的证据强调确定造成β和γ振荡的通路和神经递质系统的重要性。
上行胆碱能投射作用提高了包括β和γ范围内的那些内源性振荡。尽管早期研究(Stumpf，1965)已经发现胆碱能阻断剂和隔膜病变(septallesion)不会有明显影响，但后来的研究显示，自由运动的小鼠中快波会被胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱增强，并会被拮抗剂显著降低(Leung，1985)。对海马或内嗅区切片的胆碱能刺激通常描述为引发几秒钟长的θ样活动的发作(Konopacki等人，1987；Mac Vicar和Tse，1989；Dickson和Alonso，1997；Williams和Kauer，1997)，但近期实验表明它也可以在皮层和海马切片中触发高频节律(20-40Hz)(Boddeke等人，1997；Fisahn等人，1998)。胆碱能海马隔纤维使海马系统的离散区域受神经支配(Lewis和Shute，1967；Mosko等人，1973；Frotscher和leranth，1985；Matthews等人，1987)，其中它们接触到中间神经元的亚群体并选择主细胞的树突区(Mosko等人，1973；Lynch等人，1978；Matthew等人，1987)。毒蕈碱受体的刺激去极化锥体细胞，抑制从某些中间神经元的释放，并提高其它方面的兴奋性(Pitler和Alger，1992；Behrends和Bruggencate，1993)。体外和体内的组合结果产生以下建议在端脑皮层内，乙酰胆碱在产生高频活动方面起重要作用。
胆碱能驱动的高频节律如何影响皮层运转取决于它们是否是区域性专有和它们是怎样产生的。已经报道卡巴胆碱引发的振荡是在内嗅区皮层(Dickson和Alonso，1997)和海马(Fisahn等人，1998)内的有限位置产生的，但更为普遍的答案是需要在内嗅区海马系统的宽阔区域上进行系统化的映射。本发明利用新近引入的装置(Oka等人，1999)同时从64个位点进行记录，以便为海马皮层内胆碱能引发的高频节律中的起源和区域变化寻址。
除这些信源的位置以外，我们还发现可以利用各种数学工具研究振荡自身，以便确定精神活性物质的存在，在至少某些情况下可以识别并表示精神活性物质的药理学活性或成分的特性。
上面没有一篇文件利用了体外样本中发现的高频振荡来表示精神活性物质的存在、药理学活性或成分的特性。
发明概述在此本发明的方法包括检测体外神经元组织样本中精神活性化合物的药理学活性特征，以及确定其成分的方法。联合的本发明的方法是，通过加入一种成分在不同的刺激引发和刺激重复性神经活动的方法，所述成分能刺激细胞外电压的振荡、或利用神经元组织的共植点、或利用电刺激模式刺激神经元样本。
通常，检测体外神经元组织样本中精神活性化合物的优选方法包括引发、然后检测组织样本中存在的振荡，并提供这些振荡的基线值的步骤。完成这些检测后，使体外样本与精神活性化合物或几种化合物的候补样本接触。然后在引入候补样本的同时(或在这之后)测量振荡，例如EEG波。然后处理两组振荡数据，分别产生两组所谓的“计算值”。然后比较两组计算值，使得可检出并表达样本中应当存在的一种或多种精神活性化合物的药理学活性的特征，并确定其成分，表达其特性。
各种振荡通常是在细胞外电压中发现的振荡。例如，它们可以是θ、β或γEEG波。
理想的是使用多电极盘(“MED”)，以便可以同时或先后对神经元样本上大量不同活动或较少的活动位点进行采样。利用MED可以测量并计算空间关系；既可以测量又可以计算神经的振荡值。MED的多电极特性也可以测量和鉴定给定神经元样本内的区域特异效果。
细胞外电压振荡的适当数学分析法包括对单个空间点处测得的振荡进行快速傅立叶变换(FFT)，以便放大单点测量前后在振幅和频率上的差别。
类似地，可对在一个阵列中获得的作为时间函数的细胞外电压振荡序列进行电流信源密度(CSD)分析，以产生并描述体外神经元组织样本内的电流流动特性曲线。
本发明的另一部分包括利用化学或解剖学成分以及电刺激模式，所述电刺激模式易于在体外神经元组织样本内刺激或引起重复性神经元活动。这些成分可以是能模仿或促进乙酰胆碱、5-羟色胺或儿茶酚胺活动的化合物。它们可以是共沉积的神经元组织。它们可以是类胆碱能化合物。最理想的化合物是卡巴胆碱。也可以使用电刺激。
本发明包括各种检测药理学活性并表示其特性，以及确定精神活性待测化合物成分的方法。鉴别这些待测化合物的许多方法都包括在本发明的方法内。
附图简述附图描述并解释了本发明的原理。它们并不会以任何方式限制本发明的范围。

图1在描述测得的低分辩率图象中描述了“混叠”现象。图2描述了抗混叠的效果。图3A和3B分别表示在8×8检测器阵列上的海马切片方位和一个电极上引出的突触后反应。图4显示对由图3A和3B中海马切片的方位算出的诱发反应进行的连续二维电流信源密度分析。图5A和5B表示利用公知解剖学结构计算的生理学现象排列。图6A到6E表示海马切片的显微图和海马内卡巴胆碱引发的β波分布。图7A-7C表示利用密集微电极阵列测得的海马中卡巴胆碱引发的β波。图8表示对图7A所示海马切片进行的卡巴胆碱引发活动的电流信源密度分析。图9A和9B表示顶部树突与基部树突中复现的卡巴胆碱引发振荡的关系。图10表示电流信源密度在特定时间的计算演化。图11表示海马和皮层中两个截然不同的卡巴胆碱引发节律。图12表示对由区域CA3顺行激活引发的β样活动进行的二维电流信源密度分析。图13表示苯并二氮杂类对卡巴胆碱引发的β波的影响。图14A-C表示地西泮对卡巴胆碱引发的β波的影响。图15A-C表示氟西泮对卡巴胆碱引发β波的影响。图16A-C表示ampakine(CX614)对卡巴胆碱引发的β波的影响。图17A-C表示ampakine(CX691)对卡巴胆碱引发的β波的影响。图18A-C表示比枯枯灵碱对卡巴胆碱引发的β波的影响。图19A-C表示木防己苦毒素对卡巴胆碱引发的β波的影响。图20A-C表示CNQX对卡巴胆碱引发的β波的影响。图21A-C表示DNQX对卡巴胆碱引发的β波的影响。图22A-C表示NBQX对卡巴胆碱引发的β波的影响。图23概括地描述了依照本发明的方法将某类精神活性物质添加到神经元组织前后的振荡节律比较的预测性结果。
本发明的详细描述本发明包括检测或鉴定精神活性成分的方法，优选利用体外神经元组织样本中细胞外电压(或电位)的节律振荡来实施。另外，本发明的方法包括利用下面将详细描述的某类成分或电刺激技术刺激或诱发这些振荡的方法。
在神经样本的空间阵列上测量体外神经元组织中的细胞外电位是公知的。例如，可参见授予Sugihara等人的美国专利第5563067号和第5810725中出现的那些装置的各种描述。测量装置优选与本发明的方法一起使用的细胞电位测量电极阵列包括位于绝缘底板上的多个微电极，将微电极与微电极区域外的某些区域连接在一起的导电图形，与导电图形的末端连接的电触头，覆盖导电图形表面的绝缘薄膜，以及封闭包括绝缘薄膜表面上的微电极区域的侧壁。参考电极的阻抗与测量电极的阻抗相比较低。它们可以设置在被侧壁封闭的区域内的多个位置上，且通常距离微电极指定距离。另外电触头通常连接在每个参考电极导线的导电图形和导电图形的末端之间。参考电极导线的导电图形的表面通常覆盖一层绝缘薄膜。
通常，微电极位于矩形的矩阵排列中，例如所述矩形矩阵的侧边为0.8到2.2mm(在微电极间距为300μm的情况下)或0.8到3.3mm(在微电极间距为450μm的情况下)。四个参考电极设置在一侧为5到15mm的矩形的四个角上。更为优选的是，64个微电极以8行和8列、中心间距约为100到450μm、优选为100到300μm的方式设置。
优选地，微电极和参考电极由镀镍层、镀金层和氧化铟-锡(ITO)薄膜上的铂黑层构成。
绝缘底板(例如玻璃底板)可以是近乎方形的。多个电触头可与导电图形的末端连接，优选设置在绝缘底板的四个侧面上。结果是，多个微电极和参考电极的导线图形布局设计很简单。因为电触头的间距可以做得相对较大，因此通过电触头与外部元件的电连接也很简单。
微电极区域通常很小。当通过显微镜观察样本时，很难区分位置、竖方向和横方向。理想的是，将索引微标记设置在微电极区域附近，以便允许通过显微镜从各个方向、轴和位置进行目视识别。
更为优选的是执行以下序列的事项，以确定与体外神经元样本的解剖学关系相对的电极位置。在阵列上的体外神经元样本上设置一个对照以使阵列覆盖样本的重要区域，对阵列上的对照样本进行拍照，记录对照样本的反应，尽可能精确地将测试样本放置在阵列上与对照样本相同的相对位置，对阵列上的测试样本进行拍照，记录测试样本的反应，比较对照照片和测试照片，比较对照反应和测试反应。
本领域技术人员可以理解的是，可选择的方法是利用目标识别算法，其中目标是体外神经元样本的整个解剖结构，比较目标识别算法数据，并比较对照反应和测试反应。
最优选的细胞电位测量装置由带有细胞电位测量电极的细胞放置单元、与电触头接触的接触部位、和用以通过上下夹持固定绝缘底板的电极支座组成。细胞电位测量电极可与细胞放置组件装置电连接，以便能够处理样本产生和在每个这样的微电极和参考电极之间测得的电压或电位信号。细胞电位测量组件可包括被侧壁包围的区域，用以培养样本神经元的细胞或组织。它也可以优选包括光学装置，用以光学地放大和观察被侧壁包围的区域内培养的细胞和组织。该细胞电位测量装置优选进一步包括图象存储装置，用以存储通过光学装置获得的放大图象。
通常也包括具有安装了测量软件的个人计算机，用以接收测得的细胞电位。为了进行测量，计算机和细胞放置装置通常通过I/O电路板连接。I/O电路板包括A/D转换器和D/A转换器。A/D转换器通常用于测量和转换得到的电位；D/A转换器用于在需要时向样本提供刺激信号。
计算机内安装的测量软件可包括用于为给出刺激信号、形成刺激信号而设定条件的软件和用于记录所得的检测信号的软件。通过利用这样的测量软件，计算机可包括用于向细胞提供刺激信号的装置和用于处理细胞检测信号的装置。计算机也可以控制任何光学观察装置(SIT摄像机和图象存储装置)和细胞培养系统。
理想的是，可以实时显示从细胞检测得到的细胞外电位。另外，可根据愿望通过在细胞显微图象上进行叠置来显示记录的自发活动、电位、或诱发电位。可以选择的是，软件也可以包括图象处理，例如特征识别、边缘检测、边缘增强、算法能力。当测量电位时，通常可视地显示出整个记录波形与神经元样本中的波形位置相关。
说到数据分析或处理，快速傅里叶变换(FFT)分析、相干分析、和相关分析也是理想的。在下面讨论的变化中，电流信源密度分析(CSD)也是非常理想的。其它可用函数可包括利用波形鉴辨的单尖峰信号分离函数、瞬时轮廓显示函数、和形态显示函数。这些分析结果可通过覆盖在图象存储装置中存储的神经元样本的显示的图象上来显示。
当从计算机发出刺激信号时，该刺激信号通过D/A转换器和隔离器发送到细胞放置装置。细胞放置装置包括细胞电位测量电极，例如所述测量电极由玻璃底板上64个的微电极构成，所述微电极以矩阵形式排列，测量电极具有保持神经元样本(例如细胞或组织部分)与微电极和它们的培养液接触的封闭侧壁。优选地，将发送到细胞放置装置的刺激信号施加到64个微电极中的任意电极，然后施加给一个样本或多个样本。
每个微电极和参考电位(这是培养液所处的电位)之间产生的感应、诱发、或自发电位通过64个通道的高灵敏度放大器和A/D转换器输入计算机。放大器的放大因子例如约可以是80-100dB，其频带例如约为0.1到10KHz或到20Hz。然而，当利用低截止滤波器测量刺激信号诱发的电位时，频带优选为100Hz到40kHz或更多。
理想装置可包括具有温度控制器的细胞培养系统、培养液循环装置和提供诸如空气和二氧化碳混合气体的进气装置。细胞培养系统可由商用微型培养箱、温度控制器和CO2气瓶组成。微型培养箱可借助于Peltier元件将温度控制在0到50度范围内，并适用于3.0毫升/分或更低的液体供应速度和1.0升/分或更低的气体流速。或，可以选择的是，可以利用结合了温度控制器的微型培养箱。数据测量与分析通常，此处描述的方法利用同时测量，并优选记录在空间上和时间上每个这样的测量部位处的细胞外电压或电位值。更优选的是观察空间阵列中每个测量部位处的信号频率和振幅。进一步优选的是，既可以利用光学装置也可以利用电传感装置观察样本中神经元样本的位置和固有的自然界限，这些边缘与传感器的位置有关，所有这些都在选定的计算机内。
神经元样本被放置在所述体外细胞电位测量电极阵列上，并可以利用本领域普通技术人员公知的方法保持测试过程中神经元样本的生命力。如果愿意可以培养神经元样本。下面将根据实施例讨论典型方法。为了细胞外电压或电位的节律振荡而监控每个微电极，使其作为时间函数和频率函数。这产生作为时间的函数的频率和振幅信号的阵列。优选的是测量从接近2Hz的DC区域到35Hz以上区域的振荡。这允许测量神经元节律活动中建立的典型的三频带4-20Hz(θEEG)，15-25Hz(βEEG)，和30Hz(γEEG)以上的保持。10到50Hz的较高频带是非常有益的。
我们已经发现，理想的是通过药理学、生理学、或解剖学方法诱发或刺激不同的细胞外电压或电位的振荡。优选的是利用药物组合物，例如一种或多种化合物，它们能促进或模仿该神经元组织中的卡巴胆碱、5-羟色胺、或儿茶酚胺的活性，然而其它刺激方式也是可以接受的。更为优选的是所述化学刺激成分是一种或多种类胆碱能化合物，其中卡巴胆碱(氯化卡巴胆碱)是非常理想的。
一旦已将提到的物质加到体外神经元组织样本中，就可得到一组振荡基线值。
然后使可能包含或不包含精神活性化合物的候补样本成分与体外神经元组织样本接触。接着测量细胞外电压或电位的阵列。我们发现，在引入精神活性化合物前后对这些细胞外电压振荡的比较提供了关于精神活性成分的存在和/或特性的信息。下面在实施例中将提供有关特定化合物的更详细内容。
一种提供有关精神活性化合物存在或特征的重要信息的方法是利用快速傅立叶变换(FFT)。在各个不同领域都使用FFT，通常在所谓的光谱分析仪装置中使用FFT。在测量阵列中对特定测量结果应用FFT，并将该结果与导入候补成分之前相同位置处的特定测量结果相比较，这将对有关精神活性化合物的存在、特性或药理学活性有指导性。明确地说，如果候补物是被分析的神经元样本区域中的精神活性物质，则这样分析得到的信号的比较值可显示出尖峰频率、振幅、或两方面结合上的偏移。
同样有益的另一个分析法是电流信源密度(CSD)分析法。该分析方法的讨论可参见例如在Nicholson等人的“电流信源密度分析理论和无尾动物小脑传导性张量的确定”，神经生理学杂志(Journal ofNeurophysiology)，1975，3月，38(2)356-68。该分析方法可用于转换上述装置测得的电位或电压，并将它们转换成电流的类似结构的阵列，和更为重要的是电流大小。通过关联电流的大小和方向，将它们作成时间的函数，可观察到电流的“吸收”和“信源”。这些“吸收”和“信源”的位置对确定加入到体外神经元样本中的精神活性药物的存在、特征、或药理学活性是有指导性的。
此处所用的术语“吸收”是指电流从细胞外介质吸入神经元中。
此处所用的术语“信源”是指电流从神经元内注入细胞外介质中。
此处所用的术语“海马”是指端脑的一个区域，其位于颞叶后部，并与人类和动物中的记忆形成和重现有关。
此处所用的术语“海马切片”是指通常约为100-500微米厚的海马组织的物理切片，所述海马切片可放在此处所述的电生理学记录装置上。
此处所用的术语“CA1”、“CA2”、“CA3”、和“CA4”是指海马的四个区域中的一个区域。
此处所用的术语“树突”是指从神经细胞的细胞体发出的高度分支的结构。
实施例为同时从64个部位进行记录，以便为海马皮层内胆碱能引发的高频节律中的起源和区域变化寻址，该实施例利用多电极盘(MED)。然后实施与振荡相关的另外的药理学和生理学研究。多电极阵列的制备(MED探针)上面描述了制备多电极盘(Matsushita电气工业有限公司，Osaka，Japan“the MED probe”)的一般方法。Oka等人也描述了MED探针的制备方法(1999)。该装置具有64个平板状微电极，每个微电极的尺寸为50×50μm，以8乘8的方式设置。探针的极间距离有两种类型，150μm(PanasonicMED-P515AP)和450μm(PanasonicMED-9545AP)。
为了提供神经样本切片与MED表面之间有足够的粘结力，室温下用含0.1％聚氮丙啶(SigmaP-3143)、PH为8.4的25mM硼酸盐缓冲溶液将MED探针表面处理8小时。用无菌蒸馏水将探针表面漂洗3次。然后在37℃下至少花1小时用DMEM/F-12混合介质充满探针(腔)，所述混合介质含有10％的胎牛血清(GIBCO16141-079)和10％的马血清(GIBCO16050-122)。DMEM/F-12混合介质是Dulbecco改性的Eagle介质和Ham F-12(GIBCOD/F-12介质，12400-024)为1∶1的且添加了N2添加物(GIBCO17502-014)和氢化可的松(20nM，Sigma，H0888)的混合物。
海马切片的制备在利用氟烷(2-溴-2-氯-1，1，1-三氟乙烷，SigmaB4388)麻醉后，通过断头术杀死17-24天大的Sprague-Dawley大鼠，然后小心地取出整个大脑。立即将脑浸入到冰冷的、饱和了氧且具有以下成分(mM)的制备缓冲液中约2分钟NaCl为124，NaHCO3为26，葡萄糖为10，KCl为3，NaH2PO4为1.25，CaCl2为2，MgSO4为2。修整适当部分的脑，并将其放在振动组织切片机(LeicaVT-1000S)的冰冷台上。立即用饱和了氧的且经冷冻处理的缓冲液充满所述台。每片组织切片的厚度为350μm。用油画毛笔小心地从刀片上取下每片切片，经过修整，然后在室温下立即浸入到饱含氧的制备缓冲液中1小时。然后将切片放置到MED探针的中心。切片要放置在能覆盖8×8阵列的位置。切片定位后，立即将MED探针放置在充满95％O2和5％CO2的箱子中，使其在32℃下恢复1小时。电生理学记录电生理学记录过程中，在32℃下将MED探针上的切片置于小型CO2培养箱(Asahi Lifescience4020型)内1小时。在MED探针上的切片恢复后，用没有血清的DMEM/F-12混合介质取代介质。切片位于接触面上并与加了水分的95％的O2和5％的CO2的气体混合物接触。在该条件下，记录反应超过2小时。
从RBI(地西泮、比枯枯灵碱、CNQX，2-hydroxysaclofen)或Sigma(所有其它的化合物)购买药品。CX614和CX691是由Cortex制药公司(Irvine，CA)生产的。所有这些药品都以公知浓度水浴复温后施用，并日常制备冷冻的等份试样。
利用多通道记录系统(Matsushita电气公业有限公司，“MED64系统”)以20kHz的采样速度同时记录所有64个部位处的自发和诱发场势。在诱发响应的情况下，64个可用微电极中的一个平板微电极可用于刺激阴极。数据采集软件通过隔离器产生双极恒定电流脉冲(10到50μA，0.1微秒)。用64位开关盒选择刺激微电极。然后利用下面讨论的CSD分析法(Nicholson等人)分析测得的场势。电流信源密度(CSD)分析法广泛研究的电流信源密度分析法对测得的场势(φ)进行Laplacian变换(2)，用以试图识别电流信源和吸收(Im)的位置和相对大小(Howland等人，1955；Mitzdorf，1985评论)Im＝-(σx2xφ+σy2yφ+σz2zφ)其中σ是每个正交的三维中的导电率。很少为电生理学测量以完全三维的形式使用该方法(Nicholson，1973；Nicholson和Freeman，1975；Nicholson和Llinas，1975)，而通常是采样一维的简略形式(Haberly和Shepherd，1973；Ketchum和Haberly，1993；Kolta等人，1996)。然而，在二维或多维的材料(例如脑切片)中实施一维电流信源密度分析，结果会检测不到垂直于测量轴产生的任何电流，从而使所得的一维结果另人误解。由此在一维分析中要小心，以确保在横向于测量样本方向的方向上存在极小电流。优选地，当体外神经元样本是大脑海马区域的切片时，要作出测量值线性序列的排列，以便使其与顶部树突生长的方向平行(因为它显示出横向于顶部树突的电流相对于沿顶部邻近轴产生的电流非常小)。该实施例中所用的技术是二维方法，其中由等距阵列中的多个电极记录同时产生的样值，其能保证连续传感切片平面内任何方向上的电流，而不管阵列的行与列的相对方向和切片中存在的树突走向。阵列由64个平板电极构成，每个电极尺寸为50×50μm，以8×8的模式设置，两个电极间的距离为150μm和450μm(Oka等人，1999)。
在100Hz处经低通滤波后，用3×3的加权均数核(01/80，1/81/21/8，01/80)三维地平滑数据，并用3×3Laplacian函数核(010，1-41，010)卷积结果，以产生第二空间导数的离散逼近。优选地，考虑介质具有均匀电导的电阻。在考虑的时间窗(0-3秒)内为所有通道(64个)计算全相关矩阵。通过计算每个时间步长的8×8电流信源密度，并通过双线性插值法计算想要位置处的值，从而获得切片中单个点的电流对时间曲线。由电极间距离(采样分辨率)与切片中出现的电流信源或吸收半径之间的关系产生电流信源密度分析法可承受的分辨率上的公知限制，本领域的普通技术人员可以理解这一点。计算机图形界面领域公知的“混叠”现象是指，当采样点之间的距离大于要被表示的最小现象尺寸时会出现乱真数据“重影”(混叠)。当计算机屏幕分辨率不足以显示要被显示的图形时，在屏幕中就会产生该现象(图1左边的画面——具有平滑边缘的高分辨率图象，图1中间的画面——相同图象利用相对较低分辨率的象素间距离采得，其显得具有高空间频率(参差不齐的阶梯效应)的新特征)。通常用“抗混叠”处理屏幕上出现的乱真图象，所述抗混叠是将图象的低通滤波与图象边缘处局部阴影象素的导入相结合(图1的右边)。抗混叠包括一个能从图象中去除虚假混叠特征的低通滤波器，由此也会(就象在本例子中一样)消除一些由原始图象派生出来的高空间频率细部。可通过同样的抗混叠方法(参见后面的图2)去掉人为因素引入阵列采集到的生理学数据中产生的相应电位，并可消除数据中派生的某些精细的(高空间频率)细部。优选地，分析法利用低通滤波而不是完全抗混叠。可以选择的是，如果数据包含了空间频率太高以致被电极间采样距离析象的现象，则就要对结果进行低通滤波，以便去除杂散混叠，同时也去除高频数据(图2)。
特别地，图2描述了抗混叠的效果。上面的图表示足够分辨采样数据的传感器间间隔的例子。混叠表现为非常高的频率特征；在二分之一传感器间的空间频率(传感器间隔距离的2倍)处的低通滤波消除了所有的混叠，而没有降低采样数据的分辨率。另一方面，图2中左下图表示这样一个例子，其中传感器的间隔不足以分辨采样数据。混叠的空间频率与数据中出现的最高频率重叠。左下图表示在二分之一传感器间隔的空间频率处的低通滤波将不能消除所有的混叠，但会消除数据中一些最细的细部。图2中的右手图表示较低空间频率处的低通滤波成功地消除了所有的杂散混叠，另外还降低了采集数据的分辨率，消除了很多测得数据中可能存在的高频精细细部。仅保留了较低频率或较大部分。
结果连续、二维电流信源密度分析法在将Schaffer-联合刺激输入海马切片制品中的区域CA1的环境下实施二维电流信源密度分析。图3A和3B表示典型实验。图3A表示将切片放置在8×8MED电极阵列上，电极间的间隔为150μm，使电极中央位于海马切片的CA1的顶部树突区域中。在电极阵列上，电极覆盖了CA1的基部树突、CA1的顶部树突、和齿状沟回颗粒细胞区域的上叶。为了防止GABAA-和GABAB-介导的抑制成分，用50μM的木防己苦毒素和100μM的2-hydroxysaclofen进行该实验。图3B表示通过向暗灰色表示的电极(10)施加单刺激脉冲产生(EPSC)的、并通过亮灰表示的电极(12)测得的典型突触后电流。对于这些诱发反应，时标是典型的。竖直虚线标记了所有64个电极测量的时间点，其示于下面的图4中。
图3B表示所示电极上突触后电流的时程和大小，该电极位于CA1顶部树突的邻近部分内。电流吸收和信源方向正如所表示的；开始纤维齐发(volley)(约持续1微秒)后，在大约5微秒时出现电流吸收增加，并在后来的大约13微秒时回到基线之前的5微秒内减少吸收。它变成一个电流信源，并在大约30-40微秒时回到基线前大约持续另一个15～20微秒。对于这些诱发反应，该吸收和信源的相对大小和时程是典型的。
实施二维电流信源密度分析以获得同一反应的电流信源和吸收的可比较测量。图4表示对图3B中所示诱发反应进行的连续二维电流信源密度分析。图4中的每个图都表示在由图3B中竖直虚线表示的选定时刻处计算出的切片内瞬时信源和吸收。阵列位于如图3A中所示切片的位置；海马区域CA1的细胞体层限定了一个离每幅图顶部四分之一距离的大概水平的曲线。虚线表示CA1的细胞体层(顶部)和顶部树突区域的最远范围(底部)。正如在底部标定条所示，与灰色的电流-浅色背景相比，吸收是黑的，而信源是白的。
能够看出，开始纤维齐发后(大概持续1微秒)，在大约5微秒的时间段内CA1的顶部树突中的电流吸收迅速上升(参见标记“6ms”的图)，并在大约11微秒图中消失之前的后续5微秒内下降，同时在刺激部位出现奇点。在大约2微秒的过渡期内，其中电流不能与浅色背景区别开，顶部树突中出现信源(15微秒)，在大约35微秒时的消失之前其大约持续再一个15-20微秒。可以看到单个电极的波形的时程和大小(图3B)与图4中计算出的电流信源密度吸收-信源序列紧密对应。
二维电流信源密度法展示的是电流信源和吸收的空间方面，而其它方法很难辨别该空间方面。大概在启动电流脉冲刺激的Schaffer连合纤维区域内，刺激性突触后电流吸收遍布CA1的顶部区域(从3微秒到9微秒的图)；接着的电流信源大致占据同一区域(15微秒到27微秒的图)。顶部树突内出现的吸收和后面的信源都伴有CA1基部树突区域(在每幅图的顶部附近)内的极性相反的电流。由此可将主要诱发反应的特征表示为电流吸收-信源偶极，它在3到9微秒出现，从15到27微秒反转形成电流信源-吸收偶极。另外，切片中会出现较小电流，在此不对其加以讨论。
在短暂停顿后，这些树突中出现电流信源，其中心比电流吸收的中心稍远。顶部信源加强、扩大、消耗，并在大约50微秒时消失，形成了大约50微秒的诱发反应“时间段”。顶部吸收和随后的顶部信源都伴随有CA1基部树突中出现的极性相反的场(每幅图的顶部)，该极性相反的场增大并消耗，其具有与顶部情况大致相同的时程。
正如所描述的，由于混叠将引起很高空间频率的数据丢失，因此在这些分析中进行了抗混叠以防止引入人为因素。滤波仅能使空间频率至多为二分之一采样频率的那些数据通过；在本实施例中，电极间的距离为150μm，这不能测量对大约小于300μm(半径为150μm)的电流信源或吸收。在海马区域CA1大小的结构中这是一个缺点，可以预期的是，该方法丢掉了精细的空间细部。因此，对于检测通过该方法测得的CSD的空间分辨率是有益的。
图5A和5B描绘了叠置在测量区域上的区域CA1的顶部树突的边界。
图5A表示切片和阵列位置(来自图3A和3B)；右边是在所示电极刺激后6微秒时电极阵列区域中的瞬时CSD(来自图4)。阵列顶部与CA1的基部树突一致；阵列的上部中心部分覆盖CA1中的顶部树突区域，而阵列底部三分之一覆盖齿状沟回的上叶。虚线表示CA1的细胞体层(顶部)和顶部树突区域(底部)的最远范围。
正如图5B所示，主要测得的电流吸收(黑色)仅占据了存在顶部树突的区域，而相反的电流信源(白色，顶部)仅出现在基部树突的区域内。(在对应于刺激电极位置处的计算图象中不存在电流；不能从该电极取得记录，所得的CSD处理留下一个间隙)。在用单电极(用深灰色表示)刺激后的6微秒处通过连续二维电流信源密度分析法计算生理学反应；图象是来自图4B的6微秒祯的特写镜头。通过虚线表示CA1的顶部树突区域的界限。可以看到，诱发电流吸收的范围与顶部树突的界限紧密对应。在刺激电极部位处产生电流吸收中的明显的孔，在该孔内不会进行记录，也不会计算电流信源密度。在细胞体层本身内部存在很小电流，在基部树突(画面顶部)内出现电流信源。在CA1树突顶端(图中部)存在很小电流，在齿状沟回颗粒细胞的顶部树突内出现不强的电流。
能够理解的是，计算出的吸收边界不会与树突区域的解剖学界限位置精确相符，该不精确是由于该方法的分辨率限制导致的。海马内卡巴胆碱引发β波的分布和电流信源图6A包括海马切片的显微照片和下伏的64个电极阵列，该阵列的记录位置之间为450μm(宽阵列)。也可以看到海马的子域和上覆的皮层。图6B表示在20个电极部位上卡巴胆碱引发的自发活动谱图，所述电极部位与切片中的部分海马相接触。每个x轴位于1到100Hz的对数比例尺上。在10-30Hz频率范围内、特别是在区域CA1和CA3的顶部树突内可以看到活动，别处的活动电平较低。标定条为5×10-11V2。正如在图6C中所看到的，基线活动为低压，其通常缺乏振动活性，在子域之间不存在可靠的差异。
在区域CA1和CA3内，注入卡巴胆碱后跟着是逐步发展的节律活动，55个测试切片中的41切片的所述活性接近或位于(该实施例的图6D)β带(10-30Hz)内。四十一个切片中的三十四个切片的β带振荡都在区域CA1和CA3内。在剩余7个切片的区域CA1或CA3内可观察到θ范围上端的低电压活动。横跨切片内CA1对CA3中的相对起伏不是连贯的。在齿状沟回内也发现了振荡高频活动，该活动在结构内侧比在外侧更多(图6B，D)。图6E表示阵列左上电极内卡巴胆碱引发活动的特写图，其表示跨越区域CA1细胞体层的反向极性。在图6E中，标定条为0.1mV；250毫秒。正如在图6E的较高增益记录中所看到的，在锥体细胞区域内，顶部树突的波要大于基部树突的波，在这两个位置之间，波的相位通常相反。
可使用快速傅立叶变换对卡巴胆碱引发节律的频率和分布进行定量分析。对于图6B中所示的实施例，发现谱图中大部分能量都位于10和30Hz之间，并在20Hz处有一个明显的峰。所有切片主CA1频率的组平均值为18.8±5.7Hz(平均值±标准差)，单独对于β例子是19.2±4.8Hz。CA3的相当值为16.4±5.7Hz和17.3±4.2Hz。CA1与CA3之间的差值不会达到统计显著性。10-30Hz带内具有最高能量的记录部位位于区域CA3和CA1的顶部树突内，通常位于较远区域。
正如图7A所看到的，间隔为150μm的阵列(密集阵列)提供了精细的节律活动空间分辨率。在离接近尺寸的远端，位于CA3/CA1边界中心的记录展现出绝对电位的惊人陡坡，最大电位占据了与区域CA3a和CA3b分子层对应的离散区域(图7B)。值得注意的是，电位反向横跨细胞层边界(例如图7B的左上象限)。在CA1内也出现较小的但仍然基本的电压带。所有通道的频谱示于图7C中。
实施连续二维电流信源密度分析，以进一步限定这些以拟胆碱能方式引发振荡的信源。图8表示瞬时信源(白色)和吸收(黑色；与灰色的浅色背景相比)，在图7所示的密集阵列相同自发活动过程中与任意选择的起始时刻0间隔4毫秒。CA3和CA1的颗粒和锥体细胞区域的轮廓与它们顶部树突的范围重叠，以表示该时间段内产生情况的位置。阵列包括齿状沟回的部分上叶。每帧都表示电极阵列区域内瞬时的计算电流信源密度。从任意选择的起始点开始，在区域CA3与CA1之间边界的顶部树突中出现吸收，在基部树突内有横跨细胞界限层的相关信源。顶部CA1内的大吸收伴随有CA1基部树突内的信源。该吸收及其伴随的基部信源在大概12毫秒过程中增强并扩大，到初次显现后的大概16微秒为止，它们都衰退到接近基线水平。在短暂的停顿后，其间不能将活动与背景区别开，在大约20毫秒时顶部树突内出现信源，在基部树突内出现对应吸收。在消耗以前大约后20微秒(40微秒)为止，它们扩大并增强，之后重新出现顶部吸收以重新开始一个周期，该信源(以及伴随它的偶极)在消耗前大概持续20微秒。值得注意的是，顶部信源似乎将其中心设置得比先于它的更集中的顶部吸收的中心更远，位于在电极间间隔为150m的分辨能力范围内。吸收-信源偶极重复出现，并产生图7C所示的频率曲线；从该重复的顶部吸收——信源偶极的一个峰到另一个峰的时程大约为40微秒，其与～25Hz的频率相符。
图9A和9B表示切片中由卡巴胆碱引发的重复性振荡的典型记录。在许多实验中，信源-吸收和吸收-信源偶极以及它们的沿体外神经元样本的锥体细胞体层的信源与吸收之间清晰限定的边界都重复出现一些特征，诸如从一个顶部吸收通过顶部信源到达下一个顶部吸收的等待时间。
图9A表示一个电路板(450μm的电极间间隔)阵列上的海马切片。用浅灰表示用于测量锥体细胞区域基部树突反应的电极；用于测量顶部树突反应的电极为深灰色。图9B表示来自顶部(黑)树突区域的平均反应，而在图9A中示出了切片经过500微秒(0.5秒)时间的基部(浅灰)树突区域。在跨越整个采样期间内，持续存在卡巴胆碱引发(20μM)的振荡，正是这种典型反应的形式。平均顶部与基部反应极性相反；即，相位差为180度。在大部分切片内和采样时间段内可粗略观察到横跨CA3和CA1细胞体层持续出现的位于10-30Hz(β)范围内的交替电流信源-吸收偶极。
采用连续二维电流信源密度分析法并利用电极间隔为450μm的电极阵列可评定较大区域内吸收和信源之间的偏移，所述电极阵列与前面的电流信源密度实施例不同，在前实施例所用的阵列间距为150μm。最后得到的混叠和抗混叠(见图2)必然留下更多的分辨率损失；对于450m的电极间隔和伴随而来的抗混叠，能可靠成象的最小现象为其半径是450μm(直径为900μm)或更大的现象。
图10表示计算出的经过42微秒的电流信源密度演变。每帧都表示利用宽(间隔为450μm)阵列记录自发活动的过程中特定时刻(每帧左上角中表示的微秒)的计算的电流信源密度。黑色表示吸收的最大振幅；白色表示信源的最大振幅。其示出了锥形和颗粒细胞区域的位置。
从任意选定的0微秒时刻开始，区域CA3顶部树突中的弱电流信源被集中在锥体细胞层上的分散信源所包围。区域CA3顶部树突中的强焦点吸收或接近辐射层(S.radiatum)大约开始于6微秒时刻，并伴随有CA3的细胞和基部树突层内的信源。吸收增长和充分发展的集中在CA3b上的吸收-信源关系在9微秒的时间点处很明显。吸收在开始向区域CA1扩展前大概持续12微秒。顶部CA3内的吸收大概在18微秒时消失，接着大约在3微秒后开始CA1中的顶部吸收，在15微秒时所述吸收伴随出现所述细胞体/基部树突信源。注意，截止到该时间点为止，CA3中的吸收——信源关系开始衰退。大概在与它们的有关顶部吸收相同的时刻基部信源开始消失。CA3内的顶部信源大约始于24微秒时，在几毫秒内伴随有CA3中的轻微基部信源；然后顶部信源向CA1扩张，并伴随有CA1中的基部吸收。在大约15-25微秒后这些信源——吸收对开始消失。在该切片中不规则地重复出现这样的周期。波形包含了强烈的顶部树突吸收，该吸收约持续10微秒，之后是顶部信源，该信源约持续两倍于前述持续时间段的时间。这些现象始于CA3中，在3-5微秒时间内可在CA1内看到它。概括来说，以胆碱能方式引发的β范围节律具有位于顶部树突内的电流信源，所述电流信源通常比定位更近的电流吸收得到更好限定。
这些观察表示，在持续较长的顶部信源之间插有较短的顶部吸收。平均电流的检验表明，在各切片之间，贯穿海马的锥体细胞亚类的信源和吸收分布会不同。切片间变化性也会出现在系列电流信源密度分析中，它们的主要区别在于CA3对CA1中的现象集中程度。然而，在所有显示β范围振荡的切片中，顶部树突的简短的顶部吸收——较长的顶部信源序列是很显著的。在后海马皮层内卡巴胆碱引发40Hz的节律利用仔细检测这些切片致力于解决由卡巴胆碱引发的节律是否存在局域性区别的问题，在所述检测过程中，电极阵列位于绝大部分后海马皮层区域以及海马自身的锥体细胞区域下方。图11A表示位于宽阵列上的皮层——海马显微照片。图示出了两个感兴趣的部位——一个在CA1(100)内，一个在内嗅区皮层(102)的深层内。在图11B中比较了卡巴胆碱(50μM)从区域CA1和内嗅区皮层内的所示位置引发的快波。附图中将能值给定为倍数10-11。正如从图11所看到的，内嗅区的振荡频率比海马的振荡频率高。快速傅立叶变换表明，皮层内占优势的频率大约是区域CA1内的两倍。贯穿海马锥体细胞区域的顶部树突可发现峰值接近20Hz的节律活动，而40Hz的活动主要与内嗅部位有关。也可以观察到，40Hz的振荡集中在中间内嗅区皮层的深层内(图11的右上侧谱图)。位于海马与中间内嗅区皮层之间的区域都显示出峰。实际上，这显示出在跨越后海马皮层中包含的序列的升级以有序方式增加的40对20Hz的相对平衡。在具有适当定位的电极的15个切片中的每个切片内，记录了内嗅区皮层深层中40Hz的活动；由此这显示为该区域对胆碱能刺激的特征反应。所有记录部位的结果都概括在图11C(切片内代表性活动的分布(标定条0.1mV，500毫秒))和图11D(切片内低通(0-100Hz)滤波能谱的分布(标定条2×10-11V2))内。卡巴胆碱引发β波所涉及的递质系统用20μM阿托品能完全消除卡巴胆碱引发的高频节律，而利用AMPA受体拮抗剂CNQX(20μM)可大大降低该高频节律。在存在比枯枯灵碱(10μM)时，在锥体层内蕈毒碱的刺激会产生高频尖峰，在某些方面是癫痫样放电，但缺乏节律活动。在这些条件下，卡巴胆碱会引发重复性突发行为和偶发癫痫。癫痫样突发之间的间隔有时接近于β波的时间段(数据未示出)。这些癫痫发作类似于Williams和Kauer(1997)报道的活动。顶部树突中锥体细胞触发β样活动的顺行激励产生顶部信源的γ-氨基丁酸能(GABA能)细胞怎样被激发无疑对理解β振荡的起源很重要。如果涉及锥体细胞的侧突，则在发现卡巴胆碱引发节律的区域内，足够引起重复性尖峰的顺向刺激应当会导致出现β样活动。因为(i)辐射层(radiatum)层内的有效前饲(feed-forward)树突的抑制分流了刺激电流，(ii)躯体周围(perisomatic)抑制能避免重复性放电，所以Schaffer-联合纤维的单脉冲刺激通常不会引起重复性尖峰。能部分阻断GABAa受体郁积的比枯枯灵碱浓度，可用于减少这些抑制反应，由此使锥体细胞响应顺向刺激而发射出4-5个尖峰。
图12A-12D表示对区域CA3的顺向激励诱发的β样活动进行的二维电流信源密度分析。图12A表示阵列(电极间间隔为150μm)相对于集中在区域CA3内的海马切片的位置。将刺激引入到用单色(106)表示的电极上，在圆圈形电极(108)上记录。正如下面所注解的，图12B表示对区域CA3的顺向刺激的典型反应。该反应表示小尖峰的突发，后面接着的是约持续30-40微秒的正向波。箭头表示峰吸收(53微秒)和峰信源(83微秒)。图12C表示切片中能谱的分布最大反应位于CA1的顶部树突和CA3的顶部和近端树突内。傅立叶变换表明，反应频谱的波峰在15-20Hz和100-200Hz(图12C)范围内；要注意，使用的对数标尺从1延伸到1000。图12D表示在两个时间点(刺激后的53微秒和83微秒，用箭头表示)上的二维瞬时电流信源密度分析。在远端顶部树突内表示出15-20Hz的成分，该成分的分布类似于卡巴胆碱引发β波分布。在53微秒时，引发的电流吸收位于它的波峰上，并可以看到该电流吸收主要在CA3的顶部树突内产生，并伴随有基部树突内的相应信源。在83微秒时，返回信源波峰；可看到该现象也发生在CA3的顶部树突内，并伴随有基部树突内的相应吸收。
图12B中所述类型的反应对比枯枯灵碱的浓度敏感，其在20μM的比枯枯灵碱处受到阻滞。对后一个诱发反应的电流信源密度分析表明，在锥体层上方约200-400μm的辐射层内，由位于朝向CA1的门附近的刺激部位产生信源；这与细胞体和基部树突内的密集吸收一致(图12D)。苯并二氮杂蕈类识别和特征图13A-13C表示苯并二氮杂类对卡巴胆碱引发β波的影响。正如在比较图13A(只有20μM卡巴胆碱)和13B(具有卡巴胆碱的相同切片加了3μM地西泮)时所看到的，苯并二氮杂类显著地增强了β振荡的振幅。傅立叶变换表明，增大的振幅并没有伴随波形频率上的显著变化。节律活动得到显著增强，其扩散到相对不活跃的区域。(图13A和13B的标定条0.2mV，500微秒)。
图13C总结了海马范围内记录位置的频谱，并示出了没有(黑色)和存在(灰色)地西泮时能谱的重叠。其表明，在20Hz谱带范围内，地西泮(灰色谱)产生了三倍于只有卡巴胆碱(黑色谱)时的能量增长，且在频率上没有太多偏移。另外，通过加入地西泮可在较高频率(接近40Hzγ)处增加峰值。(标定条5μV)。
另外，表1总结了8个实验的结果，其中在注入地西泮前存在着卡巴胆碱引发的高频节律。对于CA3，波峰频率处的能量增加是321±170％，对于CA1是217±137％。切片内地西泮的影响是相关的(r＝0.93)，在统计方面，CA3内的增加要大于CA1内的增加(p＜0.05，成对的t检验，2个拖尾)。整个切片内，加入地西泮后的振荡频率与只有卡巴胆碱时记录的频率相关(CA3r＝0.85；CA1r＝0.96)。
表1. 8个实验的总结，其中在注入地西泮前就在海马切片中存在卡巴胆碱引发的高频节律。其示出了区域CA3和CA1内波峰频率处能量增加的最大百分比。
正如所看到的，使用苯并二氮杂类化合物中的一种能显著增强β振荡的振幅。对于图14A-14C和15A-C中所示的结果，测量只有卡巴胆碱的各样本的电位，并测量具有卡巴胆碱加上两类苯并二氮杂类的各样本的电位一个例子是3μM的地西泮(图14A-C)，另一个例子是20μM的氟西泮(图15A-C)。
图14A是位于MED阵列顶部的海马切片的显微照片。类似地，图15A是位于所用的MED阵列顶部的海马切片的显微照片。电极间距离为450μM。示出对两组数据进行快速傅立叶变换的结果(在图14B和15B中分别具有浅灰色背景的明显解剖学界限)。这样分析得到的数据表明，注入苯并二氮杂类的增大振幅的数据没有伴随波形频率上的显著变化。正如从图14C和15C中所看到的，两种苯并二氮杂类都引起20Hz频带范围内能量的近三倍增大。波峰频率处能量的增加大约为300％。Ampakine识别和特征在该实施例中，可将宽间隔的MED用于海马样本(分别在图16A和17A中用下伏的微电极表示)。再次测量具有卡巴胆碱的样本和后来加入了10μM Ampakine(在图16A-C中为CX614，在图17A-C中为CX691)的样本的电位。对两组数据进行的快速傅立叶变换结果分别示于图16B和17B中(在浅灰色背景中有显著的解剖学边界，由此与数据相关)。所得数据表明，注入Ampakine的数据的增大频率也伴随波形振幅上的显著变化。特别是，图16C和17C概括了特别选取的记录位置的频谱。这表明，Ampakines不仅引起20Hz频带(箭头)内能量的显著增加，而且导致波峰产生10Hz的偏移。
Ampakines使同步性显著降低，并使第二波峰略大于10Hz。所得数据表明，注入Ampakines的数据的振幅降低伴随着波形频率上的轻微低偏移。两个在结构上不相似的Ampakines不仅引起了20Hz范围内能量的显著降低，而且也导致波峰发生10Hz的偏移。正如所示出的，看起来似乎第二波峰集中在齿状沟回内，区域CA3象是与前Ampakineβ节律的CA1——下脚位置相对。GABA拮抗剂识别和特征GABA能受体的拮抗剂引起显著的缩减，并使用复合尖峰信号刺激的活动失去同步。图18A-C和19A-C分别表示比枯枯灵碱和木防己苦毒素对卡巴胆碱引发的β波的影响。
图18A是位于MED阵列顶部的海马切片的显微照片。类似地，图19A是位于此处所用MED阵列顶部的海马切片的显微照片。电极间的间隔为450μM。测量只有卡巴胆碱的样本的电位，并测量后来加入了以下两种类型的GABA能拮抗剂的样本的电位10μM的比枯枯灵碱(图18A-C)和50μM的木防己苦毒素(图19A-C)。
对这两组数据进行的快速傅立叶变换结果分别示于图18B和19B中(在浅灰色背景中具有明显的解剖学界限，由此与数据相关联)。这样分析得到的数据表明，在施用任何—种GABA能拮抗剂后，注入拮抗剂中的振幅数据显著减小。所述拮抗剂不仅引起20Hz频带范围内能量的显著降低，而且也导致由复合尖峰信号组成的慢成分。这些尖峰信号似乎集中在CA1、脑下脚和皮层内。图18C和19C表示从图18B和19B选出的数据。AMPA拮抗剂识别和特征结构不同的AMPA型谷氨酸受体的拮抗剂引起卡巴胆碱预先处理的体外神经元样本内同步活动的快速损耗。测量仅有卡巴胆碱的样本的电位，并测量后来加入了三类谷氨酸拮抗剂的样本的电位，所述三类谷氨酸拮抗剂分别是一个实施例是20μM CNQX(图20A-C)，—种是20μM DNQX(图21A-C)，另一种10μM NBQx(图22A-C)。对每组数据进行快速傅立叶变换的结果示于图20B、21B和22B中(在浅灰色背景内具有明显的解剖学边界，由此与数据相关联)。所得数据表明了注入了拮抗剂的样本的振幅数据被显著降低/和或消除。所有这三种拮抗剂都引起了能量的显著降低。图20C、21C和22C表示选自图20B、21B和22B的数据。
总结图23以定性方式描述了向神经元组织加入各种影响心理活动的药物引起的诱发电位中的相对差异。观察或定量评价这些相对差异，以检测并鉴定各功能组合和这些组的特定成员，例如，1.GABA拮抗剂，例如比枯枯灵碱、北美黄连碱、木防己苦毒素、SR-95531(Gabazine)2.AMAP拮抗剂，例如CNQX、DNQX、GYKI 52466HCl、Joro蜘蛛毒素、1-萘基-乙酰基精胺、NS257、NBQX。
3.苯并二氮杂类(通常来说，任何具有有效催眠和镇静作用的化学性质类似的影响精神活动的药物组；主要用作抗焦虑和诱发睡眠的药物)，例如阿普唑仑，氯氮杂，替马西泮，氟西泮，胆地西泮氧化物(Cholrdiazepoxide)，奥沙西泮，美达西泮，劳拉西泮，氟托西泮，氟地西泮，阿普唑仑，噁唑仑，氯噻西泮，依替唑仑，氟西泮(FlurazepamHloxazolam)，艾思唑仑，硝基安定，硝甲西泮，氟硝西泮，trizolam，rimazafone，氟马西尼，溴西泮等。
4.AMPA受体调谐剂，例如Ampakine(苯(甲)酰哌啶药物(BDP))CX516(BDP-12)，CX554(BDP-20)，CX614，CX691，吡拉西坦类的吡乙酰胺(nootropics)-茴拉西坦、奈非西坦。
5.抗精神病药物，通常例如吩噻嗪衍生物、噻吨衍生物、丙基苯基酮衍生物(多巴胺受体拮抗剂)、亚胺基二苯基衍生物、Dibenzotthiazepine衍生物，苯甲酰胺衍生物、Theipine衍生物、苯并异噁唑衍生物(5-羟色胺和多巴胺拮抗剂)，特别是卡马西平、氯丙嗪、氯普噻吨、氯氮平、丙戊酸钠与丙戊酸复合剂、氟奋乃静、氟哌丁醇、碳酸锂、枸椽酸锂、洛沙平、甲砜哒嗪、吗茚酮、奥氮平、奋乃静、匹莫其特、quetiapine、利螺环酮、硫利哒嗪、替沃噻吨、三氟啦嗪，以及三氟丙嗪。
6.抗抑郁药物，通常例如三环或四环类抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSIRs)、5-羟色胺和去甲肾上腺素吸收抑制剂、以及单胺氧化抑制剂，其特别例如氨基酮、阿米替林、阿莫沙平、安非他酮、多塞平、地昔帕明、氯米帕明、氟西汀、氟伏沙明、金丝桃属、贯叶金丝桃属、丙咪嗪、异卡波肼、马普替林、米尔塔扎平、奈法唑酮、去甲替林、帕罗西汀、苯哌嗪、苯乙肼、普罗替林、舍曲林、反苯环丙胺、曲唑酮、三唑吡啶、曲米帕明，和文法拉星。
7.中枢神经系统兴奋药，通常例如为黄嘌呤和苯丙胺，特别是例如右旋苯丙胺、麻黄、草麻黄(Ephedra sinica)、Melamphetamine、哌醋甲酯、匹莫林。
8.抗惊厥药物，通常例如巴比妥酸盐、噁唑烷二酮衍生物、碳酸酐酶抑制剂，苯丙二氮杂类和GABA递质抑制剂；特别是例如卡马西平、氯巴占、地近胺、丙戊酸钠与丙戊酸复合剂、非氨酯、氟桂利嗪、磷苯妥英、加巴喷丁、拉莫三嗪、左乙拉西坦、咪达唑仑、米拉醋胺、MK-801、奥卡西平、苯巴比妥、扑米酮、氟柳双胺、司替戊醇、噻加宾、托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸、和唑尼沙胺。
9.抗焦虑药物，通常例如抗组胺药、巴比妥酸盐、苯并二氮类、β阻滞剂、丁螺环酮、1，2-丙二醇、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSIR)、5-羟色胺受体兴奋剂、和三环抗抑郁药；特别例如阿替唑 、丁螺环酮、氯氮、氯米帕明、氯氮、地西泮、氟西汀、氟伏沙明、哈拉西泮、劳拉西泮、甲丙氨酯、奥沙西泮、苯巴比妥、胡椒、卡瓦胡椒素(pipermethysticam)、普拉西平，和普萘洛尔。
10.催眠药(通常，催眠药是有关睡眠或催眠的药物，或是能通过抑制传入冲动或通过抑制大脑皮层中心内对感觉印象的接受而对疼痛不敏感、由此引起局部或完全不清醒的药物)，催眠药通常包括镇静剂、镇痛剂、麻醉药、和中毒药物，当用于引起睡眠时有时称为安眠药和催眠剂。特定催眠药包括脂族醇、巴比妥酸盐、苯并二氮类、金丝桃属、贯叶金丝桃、褪黑激素、某种非巴比妥酸盐、胡椒(piper)、卡瓦胡椒素(piper methysticum)、缬草和缬草officinalis。
11.麻醉镇痛剂，例如鸦片受体兴奋剂，特别例如海洛因和吗啡。
12.多巴胺能试剂，例如金刚烷胺、苯扎托品、卡比多巴/左旋多巴和苯海索。
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权利要求
1.一种检测体外神经元组织样本中精神活性化合物的方法，它包括a)将在所述体外神经元组织样本内的细胞外电位的振荡与基线作比较，评价所述振荡与所述基线之间的差值，其中该组织样本已与精神活性化合物的候补样本接触，以及b)根据所述振荡与所述基线之间的差值检测所述候补样本成分内存在或不存在精神活性化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述精神活性化合物候补样本成分与所述体外神经元组织样本相接触的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括以下步骤在使所述精神活性化合物候补样本成分与所述体外神经元组织样本接触以前，检测所述体外神经元组织样本内细胞外电位振荡的基线。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括根据所述基线与所述细胞外电位振荡之间的差值表示所述精神活性化合物的成分特征的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述差值是从以下差值组中选出的细胞外电位的频率、振幅、以及所述频率和所述振幅的组合与所述基线之间的差值。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对所述获得的细胞外电位振荡和所述基线进行快速傅立叶转换的处理步骤。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对所述振荡和所述基线的时间序列进行电流信源密度分析以产生电流特性曲线的处理步骤。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述比较步骤包括将所述振荡的振幅或频率与所述基线作比较以检测所述候补样本成分中存在或不存在精神活性化合物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述比较步骤包括将大量所述振荡与对应的大量的所述基线比较以检测所述候补样本成分中存在或不存在精神活性化合物的步骤。
10.一种检测体外神经元组织样本中的精神活性化合物并表示其特征的装置，其包括a)细胞电位测量电极阵列，其具有多个可与计算机连接的微电极，所述微电极既适于检测所述体外神经元组织样本中的细胞外电位的振荡，又适于向所述体外神经元组织样本提供电刺激，b)样本导引器，用于导入精神活性化合物的候补样本成分，使其与体外神经元组织样本接触，以及c)所述计算机，所述计算机包括以下程序i)在向所述体外神经元组织样本导入所述精神活性化合物候补样本前后都检测所述体外神经元组织样本内的细胞外电位的振荡，以及ii)比较所述细胞外电位的前后振荡，以检测存在或不存在精神活性化合物，如果检测到，就根据细胞外电位的所述前后振荡之间的差值表示所述精神活性化合物的特征。
11.根据权利要求10所述的装置，其中细胞外电位的所述基线和所述振荡是从以下组中选择的值的空间阵列细胞外电位的频率，细胞外电位的振幅、和细胞外电位的所述频率和所述振幅的组合，其中所述计算机包括比较所述前后值的空间阵列的比较程序。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述计算机包括对所述前后值的空间阵列进行快速傅立叶变换的程序。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述计算机包括数字信号处理器。
14.根据权利要求10所述的装置，其中所述计算机包括对细胞外电位的时间序列进行电流信源密度分析以产生电流特性曲线的程序。
15.根据权利要求10所述的装置，其中所述计算机包括比较所述前后值的振幅和频率以检测所述候补样本成分内存在或不存在精神活性化合物的程序。
16.一种检测体外神经元组织样本内的精神活性化合物、并表示其特征的方法，其包括以下步骤a)检测所述体外神经元组织样本内细胞外电位的振荡基线值，b)使候补样本成分与所述体外神经元组织样本相接触，c)检测得到的所述体外神经元组织样本内细胞外电位的所述振荡的值，以及d)比较振荡的所述结果值与所述基线值，以检测所述候补样本成分内存在或不存在精神活性化合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤分别处理所述获得的细胞外电位的振荡值和细胞外电位振荡的所述基线值，以获得计算出的结果值和计算出的基线值，以及其中所述比较步骤包括比较所述计算出的结果值和所述计算出的基线值，以检测所述候补样本成分内存在或不存在精神活性化合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括根据所述计算出的结果值与所述计算出的基线值的差值表示检测出的精神活性化合物特征的步骤。
19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括在检测细胞外电位振荡的所述基线值之前加入刺激成分的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括能促进或模仿乙酰胆碱、5-羟色胺或儿茶酚胺作用的一种或多种化合物。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括一种或多种类胆碱作用的化合物。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括卡巴胆碱。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述刺激成分包括共培养的组织样本。
24.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括存储细胞外电位振荡的所述基线值的步骤。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞外电位振荡的所述基线值和细胞外电位的所述获得的振荡值选自以下组中θ、β和γEEG波。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述EED波的所述基线值和所述得到的EEF波值是β波。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞外电位振荡的基线值和细胞外电位的所述得到的振荡值是从以下组中选出的值的空间阵列细胞外电位的频率，细胞外电位的振幅，细胞外电位的所述频率和所述振幅的组合。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述处理步骤包括以下步骤分别对每个细胞外电位的所述得到的振荡值和细胞外电位振荡的基线值进行快速傅立叶变换，以产生所述计算出的结果值和所述计算出的基线值。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述处理步骤包括在数字信号处理器内对细胞外电位的所述得到的振荡值和细胞外电位振荡的所述基线值进行快速傅立叶变换。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述处理步骤包括在通用计算机内对细胞外电位的所述得到的振荡值和细胞外电位振荡的所述基线值进行快速傅立叶变换。
31.根据权利要求16所述的方法，其中所述处理步骤包括对所述计算出的结果值和所述计算出的基线值的时间序列进行电流信源密度分析以产生电流特征曲线的步骤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述处理步骤包括在数字信号处理器内对细胞外电位的所述得到的振荡值和细胞外电位振荡的所述基线值进行快速傅立叶变换。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述处理步骤包括在通用计算机内对细胞外电位的所述得到的振荡值和细胞外电位振荡的所述基线值进行快速傅立叶变换。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述比较步骤包括以下步骤将所述计算出的结果值的频率或振幅与所述计算出的基线值作比较，以检测所述候补样本成分内存在或不存在精神活性物质。
35.根据权利要求28所述的方法，其中所述比较步骤包括以下步骤将大量所述计算出的结果值与对应的大量所述计算出的基线值作比较，以检测所述体外神经元组织样本内细胞外电位振荡的变化，并检测所述候补样本成分中存在或不存在精神活性化合物。
36.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括以下步骤在检测细胞外电位振荡的所述基线值以前，通过对所述体外神经元组织样本进行电刺激引发细胞外电位的基线振荡。
37.根据权利要求16所述的方法，其中细胞外电位值的所述得到的振荡和细胞外电位振荡的所述基线值是从以下组中选出的值的空间分布细胞外电位的频率，细胞外电位的振幅，细胞外电位的所述频率和所述振幅的组合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中通过将体外神经元组织样本的电位阵列与解剖学特征作比较而获得电位的空间分布。
39.根据权利要求38所述的方法，其中通过显微镜观察所述解剖学特征。
40.根据权利要求38所述的方法，其中通过显微图象和图象处理算法分析所述解剖学特征。
41.根据权利要求16所述的方法，其中所述处理步骤进一步包括计算所述计算出的基线值和所述计算出的结果值的区域性分布的步骤。
42.根据权利要求28所述的方法，其中所述处理步骤进一步包括计算所述计算出的基线值和所述计算出的结果值的区域性分布的步骤。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述处理步骤进一步包括计算所述计算出的基线值和所述计算出的结果值的区域性分布的步骤。
44.根据权利要求41所述的方法，其中通过将计算出的值与体外神经元组织样本的解剖学特征作比较来获得计算出的基线值和计算出的结果值的区域性分布。
45.根据权利要求42所述的方法，其中通过将计算出的值与体外神经元组织样本的解剖学特征作比较来获得计算出的基线值和计算出的结果值的区域性分布。
46.根据权利要求42所述的方法，其中通过将计算出的值与体外神经元组织样本的解剖学特征作比较来获得计算出的基线值和计算出的结果值的区域性分布。
47.根据权利要求44所述的方法，其中通过显微镜观察所述解剖学特征。
48.根据权利要求45所述的方法，其中通过显微镜观察所述解剖学特征。
49.根据权利要求41所述的方法，其中通过显微镜观察所述解剖学特征。
50.根据权利要求44所述的方法，其中通过显微图象和图象处理算法分析所述解剖学特征。
51.根据权利要求45所述的方法，其中通过显微图象和图象处理算法分析所述解剖学特征。
52.根据权利要求40所述的方法，其中通过显微图象和图象处理算法分析所述解剖学特征。
全文摘要
本发明涉及通过在向体外神经元组织样本导入候补样本前后检测细胞外电压的振荡来检测体外神经元组织样本内的精神活性化合物的方法，以及用于实施该方法的装置。细胞外电压参数的分析产生对候补样本内存在精神活性物质的指示和有关其药理学活性和/或成分的信息。此外，本发明涉及在体外样本内激发并维持重复性神经活动的存在的方法。另外，本发明包括通过导入能促进或模拟乙酰胆碱、5－羟色胺或儿茶酚胺作用的促进成分诸如卡巴胆碱，或通过使体外神经样本遭受电刺激作用，来刺激或激发体外神经元组织样本内的重复性神经活动、例如EEG的方法。
文档编号G01N33/94GK1457430SQ00809285
公开日2003年11月19日 申请日期2000年6月21日 优先权日1999年6月21日
发明者G·林克, 竹谷诚, 下野健, 杉原宏和 申请人:松下电器产业株式会社, 加利福尼亚大学董事会