专利名称：检测神经细胞电信号的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测神经细胞电信号的装置，特别涉及微电极阵列传感器检测 神经细胞电信号的装置。
背景技术：
神经电信号的分析是目前神经信息学的研究的主要内容之一。现在比较常用的装置是微电极阵列传感器(Micro-Electrode Array, MEA)。 MEA由嵌在基底 物质上的微电极组成。微电极主要由金属材料例如铂，金，钛氮化物和铟锡氧 化物等构成。微电极在基底物质(通常是玻璃)上排成阵列。微电极与用金或 透明的铟锡氧化物制成的导线相连，导线将微电极信号传送到外部的放大器， 或将外部施加的刺激传送到微电极。在MEA设备中，被试细胞或组织直接在电 极涂层物质上培养，可以允许测量到细胞外直接相邻的局部电变化，同时并行 记录多个细胞的电生理信号。基于体外MEA技术的神经生物学的研究有两个突 出优点， 一是可以同时记录和刺激不同位点，二是非侵入式不会损伤细胞。所 以MEA适用于在同一个培养样本上进行长时程记录，因而允许监视培养物对刺 激的响应的较长时间的演变。但是现有MEA技术存在一个固有的瓶颈无法使 细胞定向生长，在体外培养的神经细胞的突触连接是随机的，跟实际生物体中 突触的连接有很大不同，而且每一次体外培养，神经细胞的连接也是不同的。 而每个神经元发放的电信号与这个神经元和周围神经元的连接方式有很大关 系。现有的这种体外随机连接方式不仅让神经生理的实验无法具有精确的重复 性，而且无法得到神经细胞连接的拓扑结构与神经信号对应关系。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种可控制神经细胞生长的图案并获得 其电信号的检测神经细胞电信号的装置。为了克服现有技术中体外培养的神经细胞随机连接这个缺点，本发明检测 神经细胞电信号的装置通过在各微室之间设置连通的微通道，使得在MEA上培养的细胞可以按照特定的方式连接，通过MEA的微电极记录细胞的电信号，这样可检测到特定连接方式下的细胞的电信号，得到细胞电信号与其连接方式的 关系。微室与微通道的排列方式可以根据生物体中的神经细胞和神经突触的连 接方式设置，这样培养在该装置上的祌经细胞构成的网络将可以模拟实际生物 体内的神经网络，因此检测到的神经电信号与生物体内真实的神经电信号接近， 从而检测到的神经电信号会包含大量的生物学信息。微室与微通道的排列方式 也可以按照人们想创造的神经网络的连接方式设置，这样培养在本装置上的神经细胞就可以按照人们需要的连接方式连接，从而可以得到人工神经网络，MEA 的微电极可以将这个人工神经网络的电信号检测出来。 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下本发明检测神经细胞电信号的装置主要包括微电极阵列传感器和细胞生长 室，所述微电极阵列传感器包括基底、设于所述基底上的大微电极和小微电极， 所述细胞生长室固定在微电极阵列传感器的基底上，所述细胞生长室包括两个 以上的敞口微室和对应的微通道，所述微电极阵列传感器上的大微电极对应地 置于所述微室内，相邻的两个微室内的大微电极之间由对应的微通道连通，所 述微电极阵列传感器上的小微电极对应地置于所述微通道内。进一步地，本发明所述微室沿宽度方向置有一个大微电极，在所述微室内 沿着微室的长度方向置有两个以上大微电极，所述相邻的两个微室之间沿长度 方向有两个以上微通道，所述各微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。进一步地，本发明每个微室内仅置有一个大微电极，相邻的两个微室之间 有一个微通道，所述微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。与现有技术相比，本发明的优点是(1)由于本发明设有微室和微通道， 使得体外培养的神经细胞在微室和微通道内，按照微室和微通道的排列方式进 行定向生长；(2)微室与微通道的排列方式可以根据生物体中的神经细胞和神经突触的连接方式设置，这样培养在该装置上的神经细胞构成的网络将可以模 拟实际生物体内的神经网络，通过微室与微通道内的微电极检测到神经电信号， 因此检测到的神经电信号与生物体内真实的神经电信号接近，从而检测到的神经电信号会包含大量的生物学信息。(3)微室与微通道的排列方式也可以按照 人们想创造的神经网络的连接方式设置，这样培养在本装置上的神经细胞就可 以按照人们需要的连接方式连接，从而可以得到人工神经网络，微电极可以将 这个人工神经网络的电信号检测出来。
图1是本发明检测细胞电信号装置的第一种实施方式的结构示意图； 图2是图1的A-A剖视图3是本发明检测细胞电信号装置的第二种实施方式的结构示意图4是图3的A-A剖视图5刻有微通道图案的掩膜的结构示意图6是本发明在制作细胞生长室过程中光刻胶与掩膜覆盖于硅基底上时的 结构示意图7是本发明光刻胶微通道固定于硅基底上的结构示意图； 图8是本发明光刻胶微室与微通道位于硅基底上时的结构示意图； 图9是本发明PDMS浇注在光刻胶模具上的结构示意图； 图10是脱模PDMS腔壁的结构示意图； 图11是本发明微电极阵列传感器的结构示意图； 图12是图11的俯视图。
具体实施例方式
图1和图2示出了本发明检测细胞电信号装置的第一种实施方式的结构。 该检测神经细胞电信号的装置包括微电极阵列传感器和细胞生长室。微电极阵 列传感器包括基底l，在基底1上设有大微电极和小微电极；细胞生长室固定在 基底1上。细胞生长室包括第一微室51、第二微室52、第三微室53和第一微 通道7、第二微通道6。其中，第一微室51、第二微室52和第三微室53的上方 均为敞口状。第一微室51、第二微室52和第三微室53平行排列。各微室之间 通过腔壁46隔离。微电极阵列传感器上的大微电极对应地置于微室内，具体地 说，可在第一微室51内沿着其长度方向a置有三个大微电极54，在第二微室 52内沿着其长度a的方向置有三个大微电极55，在第三微室53内沿着其长度a 的方向置有三个大微电极56。第一微室51内的大微电极和与第一微室51相邻 的第二微室52内的大微电极之间对应地通过三个第一微通道7连通，第二微室 52的大微电极和与第二微室52相邻的第三微室53的大微电极之间对应地通过 三个第二微通道6连通。图1只示出了分别在第一微室51和第二微室52内且 处于同一水平线上的大微电极之间由第一微通道7连通的结构形式。事实上， 本发明可以通过第一微通道7将第一微室51内的任一大微电极与第二微室52 内的任一大微电极连通，但各微通道之间不应交叉。同样，图1只示出了分别在第二微室52和第三微室53内且处于同一水平线上的大微电极之间由第二微 通道6连通的结构形式。而本发明也可以通过第二微通道6将第二微室52内的 任一大微电极与第三微室53内的任一大微电极连通，各微通道之间不交叉。微 电极阵列传感器上的小微电极对应地置于微通道内，在各第一微通道7和第二 微通道6内，沿着微通道长度c的方向，每个微通道内均可置有两个小微电极3。
各第一微通道7和各第二微通道6的宽度d为仅够容纳一条神经突触。这 样做的目的是 一条神经突触上的电信号仅被一个微通道中的小微电极检测到， 一个微通道中的小微电极仅能检测到一条神经突触的电信号，从而使得微通道 中的小微电极检测到的电信号与神经突触形成一一对应关系。
小微电极3的直径与所要检测的神经突触的直径相等或者略小于神经突触 直径，这是为了既使小微电极能构完全位于微通道中，又能检测到神经突触的 电信号。否则，若小微电极过小，会导致小微电极与神经突触可能不接触，从 而检测不到神经突触的电信号。
大微电极的直径约为所要检测的神经细胞的直径，这样做的目的是既使 大微电极能构完全位于微室中，又能检测到神经细胞的电信号。否则，若大微 电极过小，只能检测到神经细胞部分表面上的电信号。
图3和图4示出了本发明检测细胞电信号装置的第二种实施方式的结构。 该检测神经细胞电信号的装置包括微电极阵列传感器和细胞生长室。微电极阵 列传感器包括基底l，在基底1上设有大微电极和小微电极；细胞生长室固定在 基底1上。在该实施方式中，细胞生长室包括九个微室和二十四个微通道，九 个微室在基底1上排列成三排三列的阵列，其中每个微室的上方均为敞口。微 室之间通过腔壁46隔离。相邻的两个微室之间通过一个微通道连通。具体地说， 例如，第一微室10和第二微室11通过第一微通道15连通，第二微室11与第 四微室12通过第二微通道16连通，第四微室12和第三微室9通过第三微通道 17连通，第三微室9与第一微室10通过第四微通道14连通，其它微室之间的 连接与此类似。除了图3已示出的微室之间微通道的连接方式外，本发明还可 以选择在第一微室10和第四微室12之间连通有微通道，或者是在第三微室9 和第二微室ll之间连通有微通道(未在图中示出)，但各微通道之间不应交叉。
如图3所示，微电极阵列传感器上的大微电极18对应地置于微室内，微电 极阵列传感器上的小微电极19对应地置于微通道内。具体地说，每个微室内置 有一个大微电极18，每个微通道内沿着长度e方向可置有两个小微电极19。每个微室的大小为仅容纳一个神经细胞。微室的大小可略大于一个神经细 胞的大小，但不能过大，否则一些较短的神经突触可能伸不进微通道内。
每个微通道的宽度f为仅容纳一条神经突触。这样做的目的是 一条神经 突触上的电信号仅被一个微通道中的小微电极检测到， 一个微通道中的小微电 极仅能检测到一条神经突触的电信号，使得微通道中的小微电极检测到的电信 号与神经突触形成一一对应关系。
大微电极18的直径约为所要检测的神经细胞的直径，这样做的目的是既 使大微电极18能构完全位于微室中，又能检测到神经细胞的电信号，否则，若 大微电极18过小，只能检测到神经细胞部分表面上的电信号。
小微电极19的直径与所要检测的神经突触的直径相等或者略小于神经突触 直径，这是为了既使小微电极能构完全位于微通道中，又能检测到神经突触的 电信号，否则，若小微电极过小，会导致小微电极与神经突触可能不接触，从 而检测不到神经突触的电信号。
以上是本发明的两种实施方式，在应用中，可根据所要检测的细胞的数量 设置微室的数量；根据生物体中不同的神经细胞排列和连接的方式设置微室和 微通道的排列方式，从而在本发明装置上培养的神经细胞的连接方式可以模拟 生物体中的神经细胞的连接方式，因此培养在本装置上的神经细胞的电信号与 生物体中的神经细胞的电信号类似，测到的电信号携带了更多生物学信息；也 可以按照想要创造的人工神经网络的连接方式设置微室与微通道的排列方式， 从而本装置上培养的细胞就会连接成想要的人工神经网络，通过MEA的微电极 检测得到人工神经网络的电信号。
下面给出本发明第二种实施方式的制备方法。
一、细胞生长室的制备
(1) 用CAD软件设计出需要的图案，如图5所示，制作出有微通道图案23的 掩膜20。
(2) 硅基底准备。将硅片放入Piranha溶液(16%浓硫酸30%双氧水二7:3)煮沸 清洗15min，用去离子水冲洗5遍后用氮气吹干，并在20(TC热板上烘焙30rain，如 图6所示，制成硅基底22。
(3) 甩涂。甩涂第一层光刻胶21，如图6所示，将光刻胶SU-8 5胶21倒在 硅基底22中央，用手握住硅片边缘使之倾斜并缓慢旋转，使SU - 8 5胶21覆盖住硅 基底22大部分区域。静置15min，使SU-8 5胶21初步平坦化，同时消除掉倾倒过程中产生的气泡。用旋涂机以4000rpm的速度甩涂60秒，使胶分布较为均匀，厚度 大约为3Mm，静置10min。
(4) 软烘。将甩涂有光刻胶21的硅基底22放在热板上，以5'C/min的速率由 室温逐步升到13'C，期间在65'C和13'C分别保持3min和6min。之后以O. 5°C/min
的速率缓慢降至室温。
(5) 曝光。将刻有图案23的第一层掩膜20覆盖在光刻胶21的表面，如图6所 示，然后曝光。采用I线接触式曝光机(波长365nm)。如图7所示，制作出光刻胶 微通道24模具。光刻胶21在曝光后留下的部分即形成光刻胶微通道24。
(6) PEB(Post Exposure Bake，曝光后烘)烘焙。将上述模具置于热板上，以 5"C/min的速率由室温逐步升到13'C，期间在65'C和13'C分别保持lmin和5min。 之后以O. 5'C/min的速率缓慢降至室温。
(7) 制作掩膜。用CAD软件设计出需要的图案，制作出微室的掩膜。
(8) 甩涂第二层光刻胶。SU-8 50光刻胶作为第二层光刻胶，以1000rpm的速 度在有微通道的硅基底上甩涂60秒。
(9) 软烘。
(10) 曝光。将刻有微室图案的第二层掩膜与第一层光刻图形对准，第二次曝 光，如图8所示，制作出光刻胶微室25模具。由于第一层光刻胶和第二层光刻胶 的材料不同，调整曝光时间和光源波长，可保证此次曝光不损坏已经制作出的 微通道。
(11) PEB(Post Exposure Bake，曝光后烘)烘焙。将上述光刻胶模具进行PEB 烘焙，具体方法同步骤6。
(12) 显影。显影在通风橱中进行,显影液的主要成分是PGMEA。在光刻胶模 具与显影液分别静置达到室温后，将模具放入显影液中显影6min，光刻胶的非感 光区溶解于显影液中，之后分别用异丙醇和去离子水清洗干净，并用氮气吹干。
(13) 硬烘。将上述光刻胶模具置于热板上，缓慢加热到200。C,保持30min，
再缓慢降温至室温。
(14) P函S浇注。按照PDMS预聚体(Sylgardl84硅橡胶)和PDMS固化剂(3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷)的比例为10: 1，称量PDMS预聚体6.5克，PDMS固 化剂0.65克置于试管中，混合均匀。分别用低真空抽30分钟，高真空抽15分钟， 至无气泡生成为止。将混合液体缓慢浇注于光刻胶模具上，在70° C的环境下静 置一小时使之固化，形成如图9所示的PDMS腔壁46，腔壁46中有光刻胶微室24和光刻胶微通道25。
(15)脱模处理。将上述PDMS腔壁从光刻胶模具上剥离，这样，光刻胶模具上 的图案就完好地转移到PDMS腔壁上，在P腿S腔壁中形成了微室和微通道，如图 10。沿着图10虚线处切割PDMS腔壁，使微室的开口暴露出来，成为敞口的微室， 即形成细胞生长室，"敞口"的目的是为了细胞可以放入。
二、 定制的MEA
电极的位点和大小如图11和图12所示。大微电极18和小微电极19的排列方式对 应微室和微通道的排列方式。
三、 细胞生长室与MEA的封装
将MEA水平放置，将细胞生长室的下端粘合在MEA的基底1表面，封装过 程中要保证微室和微通道覆盖微电极阵列传感器上的对应电极。覆盖是指电极 完全位于微室或微通道的下方而没有暴露出来。最终完成品如图3和图4。
四、 本发明装置的工作过程
将不同的神经细胞培养在不同的微室内的大微电极上，几天以后每个细胞 的突触将沿着微通道生长，在微通道内连接起来，形成了定向生长的神经网络， 这时可以通过微电极将神经细胞电信号检测出来。
权利要求
1.一种检测神经细胞电信号的装置，其特征是它包括微电极阵列传感器和细胞生长室，所述微电极阵列传感器包括基底、设于所述基底上的大微电极和小微电极，所述细胞生长室固定在微电极阵列传感器的基底上，所述细胞生长室包括两个以上的敞口微室和对应的微通道，所述微电极阵列传感器上的大微电极对应地置于所述微室内，相邻的两个微室内的大微电极之间由对应的微通道连通，所述微电极阵列传感器上的小微电极对应地置于所述微通道内。
2. 根据权利要求l所述的检测神经细胞电信号的装置，其特征是所述微 室沿宽度方向置有一个大微电极，在所述微室内沿着微室的长度方向置有两个 以上大微电极，所述相邻的两个微室之间沿长度方向有两个以上微通道，所述 各微通道的宽度为仅容纳一条神经突触。
3. 根据权利要求l所述的检测神经细胞电信号的装置，其特征是每个微 室内仅置有一个大微电极，相邻的两个微室之间有一个微通道，所述微通道的 宽度为仅容纳一条神经突触。
全文摘要
本发明公开了一种可控制神经细胞生长的图案并获得其电信号的检测神经细胞电信号的装置。它主要包括微电极阵列传感器和细胞生长室，微电极阵列传感器包括基底、设于基底上的大微电极和小微电极，细胞生长室固定在微电极阵列传感器的基底上，细胞生长室包括两个以上的敞口微室和对应的微通道，微电极阵列传感器上的大微电极对应地置于微室内，相邻的两个微室内的大微电极之间由对应的微通道连通，微电极阵列传感器上的小微电极对应地置于微通道内。本发明使得体外培养的神经细胞可按照微室和微通道的排列方式进行定向生长，可得到与生物体内神经细胞接近的神经电信号，或得到人们需要的连接方式的人工神经网络的电信号。
文档编号G01N33/483GK101629945SQ20091010098
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者军 刘, 峰 刘, 叶学松, 李一乔, 鹏 王, 高天昀 申请人:浙江大学