一种激光扫描位相显微成像方法及系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种激光扫描位相显微成像方法及系统，它包括由激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器组成的激光共聚焦荧光扫描显微系统和由激光透光部件和荧光挡光部件组成的相位探测系统；激光器出射的激光经激光透光部件发射到二向色镜分光；出射的激光经物镜聚焦到扫描平台上的样品上，聚焦在样品的激光透过样品发射到样品下面的荧光介质上，激光光斑区域与能够激发可探测荧光区域部分重叠，重叠区域被激光激发发射荧光；荧光透射样品经物镜发射到二向色镜分光，出射的荧光经会聚透镜、针孔发射到光电探测部件探测得到样品某一测量点相位，扫描平台带动样品和荧光介质移动，将探测的样品的所有测量点的相位处理得到样品的浮雕状结构图像。本发明可以广泛应用于生物样品的荧光成像过程中。
【专利说明】一种激光扫描位相显微成像方法及系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种光学成像方法及系统，特别是关于一种激光扫描位相显微成像方法及系统。
【背景技术】
[0002]激光共聚焦荧光扫描显微技术是利用置于探测器前的针孔，高质量地对荧光实现点扫描和点探测的成像过程。激光共聚焦荧光扫描显微技术图像的对比度来自于激光激发样本产生的荧光强度，因此不能单独实现对透明样品进行非荧光标记的结构成像。
[0003]现有技术中可以与激光共聚焦荧光扫描显微技术结合的生物组织显微位相成像方法主要包括:1、激光斜射照明显微成像方法是在共聚焦显微系统的基础上，利用入射激光光轴和探测光轴所成的角度获得斜入射的照明光，从而获得浮雕效果。但是由于需要调节探测光路和入射光路的角度，难以实现在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量。2、微分干涉相差显微成像方法利用两块渥拉斯顿棱镜(Wollaston Prism)，起偏器(Po I ar i z er )和检偏器(Analyzer )完成成像,成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是上述显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪切角进行位相差分探测，其所采用的偏振元件价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品进行探测。
【发明内容】
[0004]针对上述问题，本发明的目的是提供一种激光扫描位相显微成像方法及系统，能够在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量。
[0005]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:一种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤:1)设置一包括有激光共聚焦荧光扫描显微系统的激光扫描位相显微成像系统，激光共聚焦荧光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器；2)将一生物样品放置在扫描平台上；3)根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4)在生物样品上方添加荧光介质，并对突光介质上的突光物质的浓度进行调制，突光介质的不同位置代表不同的突光物质浓度；在对生物样品扫描过程中需要满足照射到荧光介质上的激光光斑能够照亮荧光物质浓度发生变化的区域；5)激光器发出确定光斑尺寸的激光，并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上；6)聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，且荧光介质被激光激发发射荧光；7)激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光发射到会聚透镜并经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相；8)扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤5)?7)直到得到生物样品的所有测量点的位相；9)将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。[0006]所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述步骤5)在激光器出射光路的方向上固定设置所述激光透光部件，激光器出射的激光经所述激光透光部件后发出确定光斑尺寸的激光并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上。
[0007]—种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤:1)设置一包括有激光共聚焦荧光扫描显微系统和位相探测系统的激光扫描位相显微成像系统，其中，激光共聚焦荧光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器，位相探测系统包括有荧光挡光部件，其中，会聚透镜和荧光挡光部件构成一探测荧光组件；2)将一生物样品放置在扫描平台上；3)根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4)在激光入射到生物样品的方向，生物样品上方添加荧光介质；5)在二向色镜与针孔之间固定设置探测荧光组件；6)激光器发出确定光斑尺寸的激光发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上；7)聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；8)激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光被探测荧光组件部分遮挡，未经探测荧光组件阻挡的荧光经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相；9)扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤6)?8)直到得到生物样品的所有测量点的位相；10)将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
[0008]所述位相探测系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件固定设置在激光出射光路上，所述步骤6)中激光器发出的激光经激光透光部件形成确定光斑尺寸的激光，经激光透光部件发射出的具有确定光斑尺寸的激光发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上。
[0009]所述步骤8)当荧光挡光部件固定设置在二向色镜与会聚透镜之间时，激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光被荧光挡光部件部分遮挡，未经荧光挡光部件阻挡的荧光经会聚透镜会聚到针孔并由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相。
[0010]所述步骤8)当荧光挡光部件设置在会聚透镜与针孔之间时，激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光发射到会聚透镜，经会聚透镜会聚的荧光发送到荧光挡光部件部分遮挡，未经荧光挡光部件阻挡的荧光经针孔并由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相。
[0011]—种实现激光扫描位相显微成像方法的成像系统，其特征在于:它包括一激光扫描位相显微成像系统，所述激光扫描位相显微成像系统包括一激光共聚焦突光扫描显微系统，所述激光共聚焦荧光扫描显微系统包括一激光器、一二向色镜、一物镜、一扫描平台、一会聚透镜、一针孔和一光电探测器；所述激光器出射的激光发射到所述二向色镜进行分光；经所述二向色镜出射的激光通过所述物镜聚焦到设置在所述扫描平台上的生物样品上，聚焦在生物样品上的激光透过生物样品发射到设置在生物样品下面的荧光介质上，其中激光光斑区域与荧光介质上的荧光物质浓度变化的区域重叠，荧光介质被激光激发发射荧光；荧光经生物样品透射并通过所述物镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光经所述会聚透镜会聚并经所述针孔发射到所述光电探测部件进行探测得到生物样品某一测量点的位相，所述扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，通过将探测的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
[0012]所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件设置在所述激光器的出射光路上，所述激光器出射的光斑经所述激光透光部件后发射到所述二向色镜进行分光。
[0013]所述激光扫描位相显微成像系统还包括一荧光挡光部件，所述荧光挡光部件设置在所述二向色镜与所述针孔之间。
[0014]—种实现激光扫描位相显微成像方法的成像系统，其特征在于:它包括一激光共聚焦突光扫描显微系统和一位相探测系统，所述激光共聚焦突光扫描显微系统包括一激光器、一二向色镜、一物镜、一扫描平台、一会聚透镜、一针孔和一光电探测器，所述位相探测系统包括一荧光挡光部件，其中，所述会聚透镜和所述荧光挡光部件构成一组探测荧光组件；所述激光器出射的激光发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的激光通过所述物镜聚焦到设置在所述扫描平台上的生物样品上，聚焦在生物样品上的激光透过生物样品发射到设置在生物样品下面的荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；荧光经生物样品透射并通过所述物镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光被设置在透射光路上的所述探测荧光组件阻挡一部分荧光，未被所述探测荧光组件的另一部分荧光经所述针孔发射到所述光电探测部件进行探测得到生物样品某一测量点的位相，所述扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，通过将探测的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
[0015]所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件设置在所述激光器的出射光路上，所述激光器出射的光斑经所述激光透光部件后发送到所述二向色镜进行分光。
[0016]所述荧光挡光部件设置在所述二向色镜与所述会聚透镜之间，经所述二向色镜出射的荧光发射到所述荧光挡光部件阻挡一部分荧光，未被所述荧光挡光部件阻挡的另一部分荧光经所述会聚透镜会聚并经所述针孔发射到所述光电探测部件。
[0017]所述荧光挡光部件设置在所述会聚透镜与所述针孔之间，经所述二向色镜透射的荧光经所述会聚透镜后发射到所述荧光挡光部件，经所述会聚透镜会聚的荧光被所述荧光挡光部件阻挡一部分荧光，未被所述荧光挡光部件阻挡的另一部分荧光经所述针孔发射到所述光电探测部件。
[0018]本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点:1、本发明中由于设置有激光透光部件和荧光挡光部件，激光透光部件用于确定激光激发荧光区域，荧光挡光部件用于确定探测荧光区域，通过样本扫描过程中两个区域重合面积的变化可以探测得到经荧光透射的生物样品的测量点的位相，随着扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，则可以探测得到生物样品的所有测量点的位相，进而得到生物样品的浮雕状结构图像，因此不仅可以在完全不破坏原有共聚焦光路的基础上实现位相测量，而且成像过程并没有使用各种偏振元件，成本较低。2、本发明与现有技术相比，由于不需要微分干涉相差显微成像技术中特有的光学元件，因此大大降低了显微成像系统的复杂性；也不需要重新调整激光和探测光路的光轴角度，操作简单方便。3、本发明由于设置有激光共聚焦荧光扫描显微系统和位相探测部件，单独使用激光共聚焦荧光扫描显微系统时，利用生物样品本身标记的荧光，实现传统荧光成像，因此可以在扫描光学成像中完成对生物样品结构成像或荧光成像，即原位探测样本本身的荧光共聚焦图像，将两者结合使用时，利用设置在生物样品后方的荧光介质激发的荧光照射生物样品，实现生物样品的浮雕状结构成像，切换过程简单易行，极大方便了荧光模式和位相模式的切换。本发明可以广泛应用于生物样品的荧光成像过程中。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明激光扫描位相显微成像系统的结构示意图；
[0020]图2是本发明激光激发荧光区域和探测荧光区域的叠加剖面示意图；
[0021]图3是本发明的激光光斑和经调制荧光介质的位置示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
[0023]如图1所示，本发明的激光扫描位相显微成像系统包括一激光共聚焦荧光扫描显微系统和一位相探测系统。其中，激光共聚焦突光扫描显微系统与现有技术基本相同，它包括一激光器11、一二向色镜12、一物镜13、一扫描平台14、一会聚透镜15、一针孔16和一光电探测器17。位相探测系统包括一激光透光部件21和一荧光挡光部件22，其中，会聚透镜15和荧光挡光部件22可以构成一组探测荧光组件。
[0024]激光器11出射的激光经设置在激光出射光路上的激光透光部件21发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12反射(也可以透射激光，根据所选择的二向色镜进行确定，在此不作限定)的激光通过物镜13聚焦到设置在扫描平台14上的生物样品3上，聚焦在生物样品3上的激光由于生物样品折射率和厚度的变化而发生偏折，并发射到设置在生物样品3上方的荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；荧光又经生物样品3透射并通过物镜13发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12透射(相应地也可以反射荧光，根据所选择的二向色镜进行确定，在此不作限定)的荧光被设置在透射光路上的荧光挡光部件22阻挡一部分荧光，未被荧光挡光部件22阻挡的另一部分荧光通过会聚透镜15会聚并经针孔16发射到光电探测部件17进行探测得到生物样品3某一测量点的位相，扫描平台14移动带动生物样品3和荧光介质移动，通过将探测的生物样品3的所有测量点的位相进行处理得到生物样品3的浮雕状结构图像。
[0025]上述实施例中，荧光挡光部件22还可以设置在会聚透镜15与针孔16之间，经二向色镜12透射的荧光经会聚透镜15会聚后发射到荧光挡光部件22，经会聚透镜15会聚的荧光被荧光挡光部件22阻挡一部分荧光，未被荧光挡光部件22阻挡的另一部分荧光经针孔16发射到光电探测部件17。
[0026]上述各实施例中，如图2所示，激光透光部件21用于确定激光激发荧光区域，即用于确定照射到荧光介质上的激光光斑的区域大小，激光透光部件21可以采用方形、圆形或者其他形状的透光器件，如果试验时所采用的激光器11所发出的激光光斑的大小尺寸本身是确定的能够符合实验需求，则可以不采用激光透光部件21，即激光器11发出的具有确定光斑尺寸的激光直接发射到二向色镜12进行分光，其它光路传播与设置有激光透光部件21的光路传播完全相同，在此不再赘述。[0027]荧光挡光部件22通过对二向色镜12透射的荧光进行遮挡确定探测荧光区域，即未被荧光挡光部件22遮挡的区域为探测荧光区域。激光激发荧光区域与探测荧光区域重叠的区域不再完全重合，通过样本扫描过程中两个区域重叠面积的变化可以探测得到经荧光透射的生物样品3的测量点的位相，随着扫描平台14移动带动生物样品3和荧光介质移动，则可以探测得到生物样品3的所有测量点的位相。
[0028]上述各实施例中，二向色镜12的作用是分光，可以采用反射激光透射荧光，也可以采用透射激光反射荧光，在具体实验中可以根据实际需要进行设定，在此不做限制。
[0029]上述各实施例中，生物样品3可以采用透明生物样品和部分透明生物样品，经由光电探测器17接收处理获得的浮雕效果表现为生物样品的位相信息。
[0030]上述各实施例中，光电探测器17可以根据实际需要选择具有光电探测功能的光学元件，在此不作限定。针孔16的直径可以采用微米到毫米量级，在此对尺寸大小不做限定。
[0031]上述各实施例中，本发明还可以包括一滤波片，滤波片可以设置在会聚透镜15之前，用于对进入到会聚透镜15的荧光进行滤波，滤波片可以根据所采用的荧光介质所激发的荧光的波长对应进行选择。
[0032]上述各实施例中，扫描平台14的结构为现有技术，在此不再赘述，扫描方式可以采用其他一维或者二维的扫描方式，也可以采用振镜扫描的方式，在此不做限定。
[0033]上述各实施例中，如图3所示，本发明还可以不采用荧光挡光部件22，通过对放置的荧光介质区域的荧光物质的浓度进行调制，荧光介质的不同位置代表不同的荧光物质浓度；在对生物样品3扫描过程中需要满足照射到荧光介质上的激光光斑能够照亮荧光物质浓度发生变化的区域，即:通过样本扫描过程中两个区域重叠面积的变化可以探测得到经荧光透射的生物样品3的测量点的位相。
[0034]上述各实施例中，如图3所示，本发明还可以在荧光介质区域调制的基础上同时设置有荧光挡光部件22，通过调制的荧光介质区域、激光光斑区域以及探测荧光区域的三个区域重叠面积的变化探测得到经荧光透射的生物样品3的测量点的位相，具体原理前面内容已做阐述，此不做赘述。
[0035]如图1所示，实际对生物样品3进行荧光成像时，激光共聚焦荧光扫描显微系统可以采用正置荧光显微镜或倒置荧光显微镜的方式完成成像，两者的区别仅是将光路进行上下翻转，当采用正置式荧光显微镜时，荧光介质设置在生物样品的底部，当采用倒置式荧光显微镜时，荧光介质设置在生物样品的顶部；本发明以倒置式激光共聚焦荧光扫描显微系统为具体实施例详细说明本发明的激光扫描位相显微成像方法。
[0036]实施例1:本发明的激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤:
[0037]1、将一生物样品切片放置在扫描平台14上，生物样品切片从下到上依次是盖玻片、生物样品3以及载玻片；
[0038]2、根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；
[0039]3、在载玻片的顶部添加荧光介质，该荧光介质是可以被入射激光有效激发的荧光材料；
[0040]4、在激光的出射光路中固定设置一激光透光部件21，在二向色镜12与针孔16之间固定设置一探测荧光组件，探测荧光组件包括会聚透镜15和荧光挡光部件22，其中，荧光挡光部件22可以设置在二向色镜12与会聚透镜15之间,突光挡光部件22也可以设置在会聚透镜15与针孔16之间，在此不做限定，本发明以荧光挡光部件22固定设置在二向色镜12与会聚透镜15之间；
[0041]5、激光器11发出的激光经激光透光部件21后发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12出射的激光发射到物镜13，经物镜13出射的激光通过盖玻片聚焦到生物样品3上；
[0042]6、聚焦到生物样品3的激光由于生物样品3折射率和厚度的变化发生偏折，照射到荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；
[0043]7、激发的荧光透过生物样品3沿着原光路返回，荧光经物镜13发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12透射的荧光被荧光挡光部件22部分遮挡，未经荧光挡光部件22遮挡的荧光经会聚透镜15会聚通过针孔16由光电探测器17接收得到生物样品3某一测量点的位相；
[0044]8、扫描平台14移动带动生物样品3和荧光介质移动，重复步骤5?7直到得到生物样品3的所有测量点的位相；
[0045]9、将光电探测器17探测得到的生物样品3的所有测量点的位相经现有的图像处理方法进行处理形成生物样品3的浮雕状结构图像。
[0046]实施例2:本发明的激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤:
[0047]1、将一生物样品切片放置在扫描平台14上；
[0048]2、根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；
[0049]3、在生物样品切片的顶部添加荧光介质，并对荧光介质上荧光物质的浓度进行调制，荧光介质的不同位置具有不同的荧光物质浓度，如图3所示，本实施例中经过荧调制后无荧光物质区域荧光物质浓度为0，有荧光物质区域的荧光物质浓度大于O ;
[0050]4、在激光的出射光路中固定设置激光透光部件21用以限制荧光介质上的激光光斑尺寸,样本扫描过程中需要满足荧光介质上激光光斑能够照亮荧光物质浓度发生变化的区域，如图3所示，激光光斑需要照亮荧光物质浓度发生变化的分界线；
[0051]5、激光器11发出的激光经激光透光部件21后发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12出射的激光发射到物镜13，经物镜13出射的激光聚焦到生物样品3上；
[0052]6、聚焦到生物样品3的激光由于生物样品3折射率和厚度的变化发生偏折，照射到荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；
[0053]7、激发的荧光透过生物样品3沿着原光路返回，荧光经物镜13发射到二向色镜12进行分光，经二向色镜12出射的荧光发射到会聚透镜15会聚并经针孔16由光电探测器17接收探测得到生物样品3某一测量点的位相；
[0054]8、扫描平台14移动带动生物样品3和荧光介质移动，重复步骤5?7直到得到生物样品3的所有测量点的位相；
[0055]9、将光电探测器17探测得到的生物样品3的所有测量点的位相进行处理得到生物样品3的浮雕状结构图像。
[0056]上述各实施例中，本发明的所有光学部件在使用过程中均可以采用相应的外部支架进行定位，本发明对每一光学元件的具体位置不作限定，可以根据具体实验要求进行调整，但是所有的光学元件组合形成的光路传播必须与本发明的光路传播一致，满足本发明对生物样品的照射和检测要求。
[0057]上述各实施例仅用于说明本发明，其中各光学元件的位置、实施方法的步骤等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
【权利要求】
1.一种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤: 1)设置一包括有激光共聚焦荧光扫描显微系统的激光扫描位相显微成像系统，激光共聚焦突光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器； 2)将一生物样品放置在扫描平台上； 3)根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共辄关系； 4)在生物样品上方添加突光介质,并对突光介质上的突光物质的浓度进行调制，突光介质的不同位置代表不同的荧光物质浓度；在对生物样品扫描过程中需要满足照射到荧光介质上的激光光斑能够照亮荧光物质浓度发生变化的区域； 5)激光器发出确定光斑尺寸的激光，并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上； 6)聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，且荧光介质被激光激发发射荧光； 7)激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光发射到会聚透镜并经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相； 8)扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤5)~7)直到得到生物样品的所有测量点的位相； 9)将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
2.如权利要求1所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于:所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述步骤5)在激光器出射光路的方向上固定设置所述激光透光部件，激光器出射的激光经所述激光透光部件后发出确定光斑尺寸的激光并发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上。
3.一种激光扫描位相显微成像方法，其包括以下步骤: O设置一包括有激光共聚焦突光扫描显微系统和位相探测系统的激光扫描位相显微成像系统，其中，激光共聚焦荧光扫描显微系统包括有激光器、二向色镜、物镜、扫描平台、会聚透镜、针孔和光电探测器，位相探测系统包括有荧光挡光部件，其中，会聚透镜和荧光挡光部件构成一探测荧光组件； 2)将一生物样品放置在扫描平台上； 3)根据实际需要，调节各光学元件之间的距离，使成像系统满足光学显微系统的物象共辄关系； 4)在激光入射到生物样品的方向，生物样品上方添加荧光介质； 5)在二向色镜与针孔之间固定设置探测荧光组件； 6)激光器发出确定光斑尺寸的激光发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上； 7)聚焦到生物样品的激光透过生物样品后照射到荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光； 8)激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光被探测荧光组件部分遮挡，未经探测荧光组件阻挡的荧光经针孔由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相； 9)扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，重复步骤6)~8)直到得到生物样品的所有测量点的位相； 10)将光电探测器探测得到的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
4.如权利要求3所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于:所述位相探测系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件固定设置在激光出射光路上，所述步骤6)中激光器发出的激光经激光透光部件形成确定光斑尺寸的激光，经激光透光部件发射出的具有确定光斑尺寸的激光发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的激光发射到物镜，经物镜出射的激光聚焦到生物样品上。
5.如权利要求3或4所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于:所述步骤8)当荧光挡光部件固定设置在二向色镜与会聚透镜之间时，激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光被荧光挡光部件部分遮挡，未经荧光挡光部件阻挡的荧光经会聚透镜会聚到针孔并由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量 点的位相。
6.如权利要求3或4所述的一种激光扫描位相显微成像方法，其特征在于:所述步骤8)当荧光挡光部件设置在会聚透镜与针孔之间时，激发的荧光透过生物样品沿着原光路返回，荧光经物镜发射到二向色镜进行分光，经二向色镜出射的荧光发射到会聚透镜，经会聚透镜会聚的荧光发送到荧光挡光部件部分遮挡，未经荧光挡光部件阻挡的荧光经针孔并由光电探测器接收探测得到生物样品某一测量点的位相。
7.一种实现如权利要求1~2任一项所述激光扫描位相显微成像方法的成像系统,其特征在于:它包括一激光扫描位相显微成像系统，所述激光扫描位相显微成像系统包括一激光共聚焦荧光扫描显微系统，所述激光共聚焦荧光扫描显微系统包括一激光器、一二向色镜、一物镜、一扫描平台、一会聚透镜、一针孔和一光电探测器；所述激光器出射的激光发射到所述二向色镜进行分光；经所述二向色镜出射的激光通过所述物镜聚焦到设置在所述扫描平台上的生物样品上，聚焦在生物样品上的激光透过生物样品发射到设置在生物样品下面的荧光介质上，其中激光光斑区域与荧光介质上的荧光物质浓度变化的区域重叠，荧光介质被激光激发发射荧光；荧光经生物样品透射并通过所述物镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光经所述会聚透镜会聚并经所述针孔发射到所述光电探测部件进行探测得到生物样品某一测量点的位相，所述扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，通过将探测的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
8.如权利要求7所述的一种激光扫描位相显微成像系统,其特征在于:所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件设置在所述激光器的出射光路上，所述激光器出射的光斑经所述激光透光部件后发射到所述二向色镜进行分光。
9.如权利要求7或8所述的一种激光扫描位相显微成像系统,其特征在于:所述激光扫描位相显微成像系统还包括一荧光挡光部件，所述荧光挡光部件设置在所述二向色镜与所述针孔之间。
10.一种实现如权利要求3~6任一项所述激光扫描位相显微成像方法的成像系统,其特征在于:它包括一激光共聚焦荧光扫描显微系统和一位相探测系统，所述激光共聚焦荧光扫描显微系统包括一激光器、一二向色镜、一物镜、一扫描平台、一会聚透镜、一针孔和一光电探测器，所述位相探测系统包括一荧光挡光部件，其中，所述会聚透镜和所述荧光挡光部件构成一组探测荧光组件； 所述激光器出射的激光发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的激光通过所述物镜聚焦到设置在所述扫描平台上的生物样品上，聚焦在生物样品上的激光透过生物样品发射到设置在生物样品下面的荧光介质上，荧光介质被激光激发发射荧光；荧光经生物样品透射并通过所述物镜发射到所述二向色镜进行分光，经所述二向色镜出射的荧光被设置在透射光路上的所述探测荧光组件阻挡一部分荧光，未被所述探测荧光组件的另一部分荧光经所述针孔发射到所述光电探测部件进行探测得到生物样品某一测量点的位相，所述扫描平台移动带动生物样品和荧光介质移动，通过将探测的生物样品的所有测量点的位相进行处理得到生物样品的浮雕状结构图像。
11.如权利要求10所述的一种激光扫描位相显微成像系统,其特征在于:所述激光扫描位相显微成像系统还包括一激光透光部件，所述激光透光部件设置在所述激光器的出射光路上，所述激光器出射的光斑经所述激光透光部件后发送到所述二向色镜进行分光。
12.如权利要求10或11所述的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于:所述荧光挡光部件设置在所述二向色镜与所述会聚透镜之间，经所述二向色镜出射的荧光发射到所述荧光挡光部件阻挡一部分荧光，未被所述荧光挡光部件阻挡的另一部分荧光经所述会聚透镜会聚并经所述针孔发射到所述光电探测部件。
13.如权利要求10或11所述的一种激光扫描位相显微成像系统，其特征在于:所述荧光挡光部件设置在所述会聚透镜与所述针孔之间，经所述二向色镜透射的荧光经所述会聚透镜后发射到所述荧光挡光部件，经所述会聚透镜会聚的荧光被所述荧光挡光部件阻挡一部分荧光，未被所述荧光挡光部件阻挡的另一部分荧光经所述针孔发射到所述光电探测部件。
【文档编号】G01N21/64GK103604787SQ201310566342
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】谢浩, 丁翼晨, 席鹏 申请人:北京大学