基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨sted显微成像系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统。皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器输出的激光脉冲入射到光子晶体光纤上得到宽带激光光源；宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器上得到重复频率的激光脉冲；激光脉冲光束的光路上设有光束分离器和若干个反射镜，将激光脉冲光束分离为2束平行的输出光束；1束输出光束通过波长选择器得到STED光束，STED光束的光路上设有位相板，STED光束经过位相板后再依次通过直角棱镜和二向色性滤光片后入射到光学显微镜；另1束输出光束通过波长选择器得到激发光束，激发光束的光路上依次设有二向色性滤光片和带通滤光片，激发光束经过二向色性滤光片和带通滤光片后入射到光电探测器。
【专利说明】基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微
成像系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，属于光学显微成像领域。
【背景技术】
[0002]光学显微成像以其非侵入式三维成像能力，在生命科学成像研究中仍然占据大约80% 的份额(Stefan ff.Hell, et al.，Science, 316，25 (2007))。但是由于光学衍射原理的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的空间分辨率(一般在200nm?500nm)，限制了它在纳米尺度对分子结构和功能进行研究中的应用。
[0003]近几年各国研究人员提出了几种突破衍射极限的方法。其中光活化定位显微镜[3] (Photoactivated localization microscopy-PALM)和随机光学重构显微镜(Stochastic optical reconstruction microscopy-STORM)通过触发光活化突光蛋白发光，然后利用点扩展函数拟合实现高分辨率单分子定位，获得了好于30nm的横向空间分辨率。该超分辨成像技术中单分子的定位精度受信噪比影响很大，而且要求样品含有较低浓度的荧光分子。
[0004]受激福射耗尽(Stimulated emission depletion-STED)显微镜通过使用一束STED光束形成空壳形状焦斑，将衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射态，也已经实现了好于30nm的横向空间分辨率。由于全部使用光学设置，图像采集时间大致与普通共聚焦显微镜相同，对样品准备没有特殊要求，因此可以实现活细胞内生物分子的实时成像和动态跟踪。
[0005]与普通荧光显微镜不同的是，STED显微镜要求激发和STED两束光，最早实现的STED显微成像是采用两个脉冲激光器，其中STED光脉冲比激发光脉冲延迟几个皮秒，以便及时将激发光激发的荧光分子退激发，其困难之一在于两列脉冲的同步调节。而且脉冲激光器往往只有几个固定的输出波长，只能提供为数不多的荧光分子所需要的激发和STED光波长，设备花费也非常昂贵。
[0006]连续输出激光器可以提供大多数荧光分子所需要的激发和STED波长，而且无需同步调节即可实现STED显微成像，设备构建较为简单，但是基于连续输出激光的STED显微镜需要很强的激光功率实现所需的STED功率密度，极易造成荧光分子的光漂白，不适合于单分子成像。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，所述显微成像系统中，只需一个光源同时提供STED显微镜所需要的激发和STED光，不存在两光束的同步失调问题，设备成本也大大降低。同时，通过激光脉冲重复频率调节器，可以获得较低的激光脉冲重复频率，降低荧光分子光漂白的影响。使用波长选择器可以方便地选择需要的激发光和STED光波长,适用于大多数突光标记物,扩展STED显微镜的应用范围。
[0008]本发明所提供的一种基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器输出的激光脉冲入射到光子晶体光纤上得到宽带激光光源；所述宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器上得到重复频率的激光脉冲；所述激光脉冲光束的光路上设有光束分离器和若干个反射镜，将所述激光脉冲光束分离为2束平行的输出光束；
[0009]I束所述输出光束通过波长选择器得到STED光束，所述STED光束的光路上设有位相板，所述STED光束经过所述位相板后再依次通过直角棱镜和二向色性滤光片后入射到光学显微镜；
[0010]另I束所述输出光束通过波长选择器得到激发光束，所述激发光束的光路上依次设有二向色性滤光片和带通滤光片，所述激发光束经过所述二向色性滤光片和所述带通滤光片后入射到光电探测器。
[0011]上述的超分辨STED显微成像系统中，应用所述光子晶体光纤的超连续产生可以提供高亮度超宽带光谱，由同一台宽带脉冲激光器同时提供荧光激发和STED的波长。
[0012]荧光分子光漂白的主要原因之一是由于荧光分子跃迁到三重态所致，由于三重态为亚稳态，平均寿命大约在微秒量级，不能及时跃迁到分子的基态，导致荧光分子漂白。适当调节选择激发光脉冲重复频率，使得处于三重态的分子有充分的时间跃迁到基态，就可以有效地降低光漂白效应。
[0013]上述的超分辨STED显微成像系统中，所述STED光束的光路上，所述波长选择器与所述位相板之间可设有光纤耦合器。
[0014]上述的超分辨STED显微成像系统中,所述光纤稱合器可为单模光纤稱合器,输出高质量的单模光束。
[0015]上述的超分辨STED显微成像系统中，所述激发光束的光路上，所述波长选择器与所述反射镜之间设有光纤耦合器。
[0016]上述的超分辨STED显微成像系统中,所述光纤稱合器可为单模光纤稱合器,输出高质量的单模光束。
[0017]上述的超分辨STED显微成像系统中，所述带通滤光片与所述光电探测器之间设有光纤稱合器。
[0018]上述的超分辨STED显微成像系统中，所述光纤稱合器可为多模光纤稱合器,输出高质量的多模光束。
[0019]上述的超分辨STED显微成像系统中，所述直角棱镜由两只垂直放置的反射镜组成。
[0020]为了获得最佳的STED显微成像效果，激发脉冲和STED脉冲的同步延迟时间应该小于分子振动弛豫时间，以有效耗尽荧光态分子。STED光路中设有直角棱镜或者两只垂直放置的反射镜组成的光学延迟线，通过调节其中的直角棱镜实现激发脉冲和STED脉冲的同步时间调节。
[0021]本发明具有以下优点:(1)由所述宽带激光光源提供照明，可以提供从近紫外到中红外的宽广波带范围内的激光波长，而且可以达到InJAim以上的光谱能量密度，可以适用于绝大多数荧光样品的激发；(2)由同一台所述脉冲激光器同时提供具有多个激发波长的激光光源，克服了多台脉冲激光器同步失调和波长数有限的缺点，同时降低了设备的成本；(3)由同一台所述脉冲激光器输出的所述激光光源提供照明，克服了连续输出激光器连续激发样品导致的样品变性甚至损坏的缺点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例1的超分辨STED显微成像系统的结构示意图。
[0023]图2为本发明实施例1中的STED激光脉冲再经过位相板进行波前调制后在物镜焦平面上获得空壳型焦斑。
[0024]图3为使用实施例1的超分辨STED显微成像系统对荧光标记的纳米微球的共聚焦和STED显微图像。
[0025]图中各标记如下:1皮秒脉冲激光器、2非线性光子晶体光纤、3声光调制器、4光束分离器、5波长选择器、6单模光纤稱合器、7位相板、8直角棱镜、9,10 二向色性过滤片、11光学显微镜、12带通滤波片、13多模光纤耦合器、14光电探测器。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[0027]实施例1、基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统
[0028]本发明提供的基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，在皮秒脉冲激光器I输出的激光光源入射到非线性光子晶体光纤2上，得到了宽带激光光源；该宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器3上,通过控制声光调制器3的射频脉冲重复频率即可控制输出激光脉冲的重复频率，得到了合适的重复频率的激光脉冲光束；该激光光束通过光束分离器4，得到两束平行的输出光束；每路输出光束通过波长选择器5获得合适的激发和STED波长，波长选择后的输出激光脉冲经过单模光纤耦合器6输出高质量的单模激光脉冲；其中STED激光脉冲再经过位相板7进行波前调制，在物镜焦平面上获得空壳型焦斑，如图2所示，再经过由直角棱镜组成的光学延迟线，通过调节其中的直角棱镜实现激发脉冲和STED脉冲的同步时间调节，再通过二向色性滤光片10后入射到光学显微镜11上。另I束激发光束得到的单模激光脉冲依次经过反射镜、二向色性过滤片9、带通滤波片12和多模光纤耦合器13后入射到光电探测器14上。
[0029]上述的基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，激光光源还可为飞秒激光器。
[0030]使用上述基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统对荧光标记的直径为40纳米的荧光纳米微球进行了共聚焦和受激辐射耗尽显微(STED)成像试验，通过波长选择器选择合适的激发和受激辐射耗尽波长，通过光学延迟线调节合适的同步延迟时间，获得了图2右图所示受激辐射耗尽显微图像(IOumX 10um，1024像素X 1024像素)。其中左图为其对应的共聚焦显微图像，可以看到在受激辐射耗尽显微图像中箭头所指纳米微球亮度的半高全宽为42纳米，而对应的共聚焦图像中亮斑的半高全宽为540纳米，实现了光学超分辨成像。
【权利要求】
1.基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像系统，其特征在于: 皮秒脉冲激光器或飞秒脉冲激光器输出的激光脉冲入射到光子晶体光纤上得到宽带激光光源；所述宽带激光光源输出的脉冲激光入射到声光调制器上得到重复频率的激光脉冲；所述激光脉冲光束的光路上设有光束分离器和若干个反射镜，将所述激光脉冲光束分离为2束平行的输出光束； I束所述输出光束通过波长选择器得到STED光束，所述STED光束的光路上设有位相板，所述STED光束经过所述位相板后再依次通过直角棱镜和二向色性滤光片后入射到光学显微镜； 另I束所述输出光束通过波长选择器得到激发光束，所述激发光束的光路上依次设有二向色性滤光片和带通滤光片，所述激发光束经过所述二向色性滤光片和所述带通滤光片后入射到光电探测器。
2.根据权利要求1所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述STED光束的光路上，所述波长选择器与所述位相板之间设有光纤耦合器。
3.根据权利要求2所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述光纤耦合器为单模光纤稱合器。
4.根据权利要求1所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述激发光束的光路上，所述波长选择器与所述反射镜之间设有光纤耦合器。
5.根据权利要求4所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述光纤耦合器为单模光纤稱合器。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述带通滤光片与所述光电探测器之间设有光纤耦合器。
7.根据权利要求6所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述光纤耦合器为多模光纤稱合器。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的超分辨STED显微成像系统，其特征在于:所述直角棱镜由两只垂直放置的反射镜组成。
【文档编号】G01N21/01GK103616330SQ201310576406
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】袁景和, 于建强, 方晓红 申请人:中国科学院化学研究所