用于表征循环免疫复合物的多重层析-免疫测定方法

用于表征循环免疫复合物的多重层析-免疫测定方法
【专利摘要】因此,本文中报道了用于分析/表征体内形成的循环免疫复合物(CICs)的方法，所述方法包括获自被施用至少一次药物的哺乳动物的样品的用于确定免疫复合物的重量/尺寸的尺寸排阻层析,任选地第二种非-SEC层析,和至少一种免疫测定,其中通过将免疫复合物尺寸和免疫测定结果/示值读数关联来表征免疫复合物。本文中还报道的是如本文报道的方法用于确定与改变的药物动力学的相关性,用于确定功效的损失或降低,用于确定药物的天然对应物的中和作用,用于确定免疫和超敏反应(包括血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病)的用途。
【专利说明】用于表征循环免疫复合物的多重层析-免疫测定方法
[0001] 本文报道了通过包括尺寸排阻层析(SEC)和免疫测定的多步骤方法用于检测和表征生物基质中的循环免疫复合物的(尺寸和组成)的方法。
_2] 发明背景
[0003]大多数生物治疗剂可以诱导在安全和功效方面具有可能的后果的不需要的免疫应答，其中这些响应在频率和严重度方面不同(Buttel，1.C.等，B1logicals39(2011) 100-109 ;C0MMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEAGuideline on Immunogenicity Assessment of B1technology-derived TherapeuticProteins (生物技术来源的治疗性蛋白的免疫原性EMEA评估指南)，http://www.emea.europa.eu (2007))。
[0004]抗药物抗体(ADA)的形成可以导致改变的药物动力学，功效的损失或降低，天然对应物(counterpart)的中和作用以及一般免疫和超敏反应，包括血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病(Buttel, 1.C.等，B1logicals 39(2011) 100-109 ；⑶MMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP)，EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技术来源的治疗性蛋白的免疫原性EMEA评估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu(2007))。
[0005]作为形成ADA-D复合物的结果，血清病样综合征是公知的不良事件并且对于多种临床前研究中(Ponce, R.等，Regul.Toxicol.Pharmacol.54(2009) 164-182)和临床实践中(COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技术来源的治疗性蛋白的免疫原性EMEA评估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu (2007)；Dreyfus, D.H.等,Ann.Allergy Asthma Tmmunol.96 (2006) 624-627 ；Gamarra, R.M., J.Emerg.Med.30 (2006) 41-44 ；Goto, S.等,Int.J.Hemato1.89 (2009) 305-309 ；Hansel, T.T.等,Nat.Rev.药物 Discov.9 (2010) 325-338 ；Pilette, C.等,J.Allergy Clin.1mmunol.120(2007)972-973 ；Tamilvanan, S.等，J.Drug Target 18(2010)489-498)的生物制品已有报道。
[0006]对于投入市场的药物，临床诊断主要反应(比如血清病或严重过敏反应)特征。在施用相关HiAb后出现不良事件的情况下，所述反应被归因于抗体应答(COMMITTEEFOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP), EMEA Guideline on ImmunogenicityAssessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技术来源的治疗性蛋白的免疫原性EMEA评估指南)，http://www.emea.europa.eu(2007))。的确，仅可以找到研究ADA的形成并与临床观察到的信号相关联的非常有限的数据(Goto，S.等，Int.J.Hematol.89(2009)305-309)。
[0007]考虑到免疫原性潜在的严重性，EMEA强调证实和表征ADA形成的重要性(COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE (CHMP)，EMEA Guideline onImmunogenicity Assessment of B1technology-derived Therapeutic Proteins (生物技术来源的治疗性蛋白的免疫原性EMEA评估指南)，http:1Iwm.emea.europa.eu (2007))。
[0008]典型地使用被设计以检测ADA的免疫测定进行免疫原性的评估(Mire-Sluis，A.R.等，J.1mmunol.Methods 289 (2004) 1-16 ;Shankar, G.等，J.Pharm.B1med.Anal.48 (2008) 1267-1281 ；Koren, E.等，J.1mmunol.Methods 333 (2008) 1-9)。
[0009]然而，直到现在，ADA发生率的信息不能使临床发现和改变的药物动力学深入相关。
[0010]形成的ADA-药物复合物的量和尺寸依赖于数个参数，例如ADA和药物浓度 / 比例以及表位和效价(Abbas, A.K.和 Lichtman, A.H., Diseases caused byimmunity responses: Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders (2003)中；Murphy,K.等,Janeway's Immunob1logy,于:Garland Science, Taylor & FrancisGroup,LLC(2008)中)。
[0011]复合物尺寸和电荷是复合物清除或诱导不良事件的重要的决定因素。典型地，较大的复合物被网状内皮系统清除，小的复合物通常不引发炎症，然而中间尺寸的复合物可以结合补体并且可以引起组织损伤(Abbas, A.K.和Lichtman, A.H.，Diseases causedby immunity responses:Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders(2003)中；Murphy, K.等，Janeway’s Immunob1logy,于:Garland Science, Taylor & FrancisGroup,LLC (2008)中；Mannik, M.，Serum Sickness and pathophys1logy of immunecomplexes,于:Clinical Immunology:Principles and Practices, Rich R.R., FleisherT.A.S.B.D.，Shearer ff.T.，Strober ff.(编辑)1062-1071 (1996)中；Sicherer, S.H.，LeungD.Y.M., Serum Sickness,于:Nelsons textbook of pediatrics, Kliegman R.M., BehrmanR.E., Jenson H.B.J., Stanton B.F.(编辑)，Saunders Elsevier, pp.985-986 (2007)中。此外，复合物的电荷对于复合物的组织沉积是重要的因素(Abbas, A.K.和Lichtman, A.H., Diseases caused by immunity responses:Hypersensitivity and Autoimmunity,于:Saunders(2003)中；Mannik, M., Serum Sickness and pathophys1logy of immunecomplexes,于:Clinical Immunology:Principles and Practices, Rich R.R., FleisherT.A.S.B.D.，Shearer ff.T.，Strober ff.(编辑)1062-1071 (1996)中)。
[0012]对于ADA应答的深入评价，应该就尺寸和电荷表征可能形成的ADA-药物复合物。此外，如果药物的内源对应物存在，则形成的ADA是否与这些分子交叉反应和内源对应物是否也是复合物的一部分的信息是有价值的信息。此外，免疫复合物中抗原/药物的结构表征为发病机理提供信息。
[0013]Coyle等报道了在多发性硬化脑脊液中检测和分离免疫复合物(Journal ofNeuroimmunology 15 (1987) 97-107)。由 Kneba, Μ.,等报道了与 ELISA 技术联合的聚焦层析-用于分析免疫复合物的灵敏方法(J.1mmunol.Meth.61 (1983) 233-243)。Matousovic, K.,等报道了 IgA肾病患者的尿液中的包含IgA的免疫复合物(NephrologyDialysis Transplantat1n21 (2006) 2478-2484)。由 Rattan, B.，等报道了从牛痕病毒感染中存活下来的兔中的循环免疫复合物(Acta Vir.38(1994) 105-110)。在W02008/031532中报道了抗药物抗体测定。Stubenrauch，K.，等，报道了以药物耐受性评价通用免疫测定，以在来自施用人抗体后的称猴的血清样品中检测免疫复合物(J.Pharm.B1med.Anal.52(2010)249-254)。在W02011/056590中报道了用于检测抗-TNF药物和自身抗体的测定。Wang Shui Long等报道了使用新的均相迁移率改变测定(homogeneous mobilityshift assay)对患者血清中对阿达木单抗(Adalimumab)的抗药物抗体(ADA)的分析(Am.J.Gastroent.105 (Sup 1，2010) S444-S445。在 EP 2 354 792 中报道了用于检测抗药物抗体的方法。Lambert, P.H.，等报道了对于评价用于检测血清中免疫复合物的十八种方法的WHO 协作研究(J.Clin.Lab.1mmunol.1 (1978) 1-15)。由 Levinson, S.S.等报道了用于测量循环免疫复合物的方法(Clin.1mmunol.Newsletter 3(1987)39-42)。
[0014]发明概沭
[0015]已经发现，以用于检测和表征生物基质中循环免疫复合物(例如包含针对给定药物的ADA的复合物)的(尺寸和组成)的、包括使用与至少一种免疫测定联合的尺寸排阻层析(SEC)的多步骤方法的方法，可以确定与改变的药物动力学的关联性、功效的损失或降低、天然对应物的中和作用以及一般免疫和超敏反应(包括血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病)。
[0016]如本文报道的一个方面是用于分析/表征体内形成的循环免疫复合物(CIC)的方法，所述方法包括:
[0017]a)样品的尺寸排阻层析，其用于确定免疫复合物的重量/尺寸，所述样品获自已经被施用药物至少一次的哺乳动物，
[0018]b)任选地第二种非-SEC层析，
[0019]c)至少一种免疫测定，和
[0020]d)任选地基于质谱法的分析，
[0021]其中通过将免疫复合物尺寸和免疫测定或质谱法测定结果/示值读数(read-out)相关联来表征所述免疫复合物。
[0022]如本文报道的一个方面是用于分析确定体内形成的包含(外源)治疗性多肽和内源抗药物抗体的循环复合的抗药物抗体免疫复合物的方法，所述方法包括
[0023]a)样品的尺寸排阻层析，其用于确定免疫复合物的重量/尺寸，所述样品获自已经被施用药物至少一次的哺乳动物，
[0024]b)任选地第二种非-SEC层析，
[0025]c)用于检测抗药物抗体的至少一种多相(heterogeneous)免疫测定，和
[0026]d)和任选地基于质谱法的分析，
[0027]其中通过将免疫复合物尺寸和免疫测定或质谱法测定示值读数/结果相关联来表征所述免疫复合物，
[0028]其中所述治疗性多肽是合成的或非天然存在的治疗性多肽。
[0029]在所有方面的一个实施方案中，所述样品是血清或脑脊液。
[0030]在所有方面的一个实施方案中，所述免疫复合物是药物特异的免疫复合物。
[0031]药物特异的免疫复合物包括与其它非药物分子一起的药物。
[0032]在所有方面的一个实施方案中，所述免疫测定选自包括以下各项的组:抗药物抗体检测测定，中和药物的抗体的检测测定，药物动力学测定(药物定量测定)，抗体同种型测定，用于确定对内源药物对应物(counterpart)的ADA交叉反应性的测定(如果所述药物包含也内源存在于哺乳动物中的部分)，补体结合测定(结合的补体或对于补体的结合能力)，用于确定包含在免疫复合物内的药物的内源对应物的测定(如果所述药物包含也内源存在于哺乳动物中的部分)。
[0033]在所有方面的一个实施方案中，所述免疫测定是均相(homogeneous)免疫测定或多相免疫测定。在一个实施方案中，所述免疫测定是放射免疫测定(RIA)，或酶免疫测定(EIA, ELISA, EMIT),或荧光偏振免疫测定(FPIA)，或发光免疫测定(LIA)，或免疫放射免疫测定(IRMA)，或微珠酶免疫测定(MEIA)，或酶联荧光测定(ELFA)，或凝集素酶免疫测定(LEIA)，或免疫荧光测定(IFA)，或电化学发光测定(ECLIA)，或免疫磁性电化学发光测定(MECL)，或化学发光斑点-免疫结合测定(CDIA)，或浊度测定，或颗粒增强免疫比浊测定。在一个实施方案中，所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)，或电化学发光测定(ECLIA)，或化学发光斑点-免疫结合测定(CDIA)，或荧光偏振免疫测定(FPIA)，或浊度测定，或颗粒增强免疫比浊测定。
[0034]在所有方面的一个实施方案中，所述第二种非-SEC层析是离子交换层析(阳离子-或阴离子交换层析)，或反相层析，或亲水相互作用层析(HILIC)，或疏水相互作用层析(HIC)，或疏水性电荷相互作用层析(HCIC)，或限制访问材料层析(restricted accessmaterial chromatography, (RAMC))。
[0035]在所有方面的一个实施方案中，所述尺寸排阻层析是以级分(in fract1ns)收集洗脱物的尺寸排阻层析。在一个实施方案中在免疫测定中分析各个级分。
[0036]在所有方面的一个实施方案中，进一步通过以等分部分(in aliquots)收集洗脱物的第二种非-SEC层析分离尺寸排阻层析的级分中的至少一个。在一个实施方案中在免疫测定中分析各个级分。在一个实施方案中，通过第二种非-SEC层析分析尺寸排阻层析中的各个级分。
[0037]在所有方面的一个实施方案中所述级分是等分部分。
[0038]在所有方面的一个实施方案中所述免疫测定是酶联免疫吸附测定。
[0039]在所有方面的一个实施方案中，所述至少一种免疫测定是一种，或两种，或三种，或四种，或五种，或六种免疫测定。
[0040]在所有方面的一个实施方案中，所述免疫测定是抗药物抗体免疫测定。
[0041]在所有方面的一个实施方案中，免疫测定中的至少一种是桥接(bridging)酶联免疫吸附测定。
[0042]阳性桥接酶联免疫吸附测定指所述抗药物抗体是ADA-D复合物的一部分。在较高分子量级分中(即在尺寸排阻层析的初期洗脱级分中)检测抗药物抗体，指所述抗药物抗体是较高分子量复合物的一部分。
[0043]在所有方面的一个实施方案中，酶联免疫吸附测定中至少一种是用于检测ADA-D复合物的复合物测定。在一个实施方案中，所述复合物测定包括药物特异的捕获抗体和作为检测抗体的抗物种(ant1-species)特异性抗体。
[0044]在所有方面的一个实施方案中，免疫测定中至少一种是用于检测结合于药物和/或结合于药物的内源对应物的抗药物抗体的直接测定。在一个实施方案中，所述直接测定包括作为捕获分子的固定化的药物或药物的内源对应物和作为检测抗体的抗物种特异性抗体。
[0045]所述直接测定利用通过尺寸排阻层析移除游离抗药物抗体后，结合于样品中药物和/或内源对应物的抗药物抗体和固定化的药物的平衡的建立。
[0046]在所有方面的一个实施方案中，所述药物表面覆层(coating)是稠密的药物表面覆层。
[0047]通过稠密的表面覆层，(使用抗药物抗体的亲和力)正好引起平衡向与表面结合的药物结合的方向移动。
[0048]在所有方面的一个实施方案中，在免疫测定中将所述样品孵育达16至32个小时的时间段。
[0049]如本文报道的一个方面是用于从ADA-D复合物分离药物以增加随后的ADA测定/免疫测定的药物耐受性的方法。同样如本文报道的方法可以用于增加免疫测定的药物耐受性。
[0050]如本文报道的一个方面是用于表征体内形成的抗药物抗体-药物(ADA-D)复合物的方法，所述方法包括
[0051]a)样品的尺寸排阻层析，其用于确定ADA-D复合物的重量/尺寸，所述样品获自已经被施用药物至少一次的哺乳动物，
[0052]b)用于检测抗药物抗体的至少一种酶联免疫吸附测定，
[0053]其中所述免疫复合物表征为
[0054]-通过阳性酶联免疫吸附测定的和重量介于约150kDa和约400 kDa之间的低分子量复合物，
[0055]-通过阳性酶联免疫吸附测定的和重量介于约400kDa和约1，500 kDa的中分子量复合物，或
[0056]-通过阳性酶联免疫吸附测定的和重量介于约1，500kDa和约7，OOOkDa的高分子量复合物。
[0057]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于将免疫复合物特性与改变的药物动力学相关联的用途。
[0058]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定药物功效的降低的用途。
[0059]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定药物的天然对应物的中和作用的用途。
[0060]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定针对药物的免疫和超敏反应的用途。
[0061]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定IgG神经纤维球沉积的用途。
[0062]在所有方面的一个实施方案中，所述免疫和超敏反应是血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病。
[0063]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定包含免疫复合物的自身免疫抗体的存在的用途。
[0064]如本文报道的一个方面是如本文报道的方法用于确定修饰的/复合的药物的存在的用途主张。
[0065]在所有方面的一个实施方案中，所述药物是人抗体或人源化抗体。
[0066]发明详沭
[0067]定义
[0068]术语“抗药物抗体”指针对药物的抗原性区域的抗体。该抗原性区域可以是药物的抗原性氨基酸序列，或药物的糖结构。在一个实施方案中，所述抗药物抗体针对药物的二级修饰，所述二级修饰由所述药物抗体在非人细胞(比如，CHO细胞，HEK细胞，或BHK细胞)中的重组生产导致。通常，抗药物抗体针对药物的抗原性区域，所述抗原性区域由被施用所述药物的动物的免疫系统识别。此种抗药物抗体是“特异抗药物抗体”。将药物设计为包含尽可能少的抗原性区域。例如，可以将意在用于人的药物在用于人患者之前人源化以最小化针对药物的免疫应答的产生。该免疫应答将是针对此种人源化药物的非人部分的抗药物抗体的形式(参见例如Pan, Y.，等，FASEB J.9 (1995) 43-49)。
[0069]术语“色原”指荧光或发光基团和染料。
[0070]术语“可检测标记”是指酶，NMR-活性基团或金属颗粒，半抗原，比如，例如，洋地黄毒苷。可检测标记还可以是可光活化的交联基团，例如叠氮或氮丙啶(azirine)基团。可以通过电化学发光检测的金属螯合物也是优选的信号发射基团，其中尤其优选钌螯合物，例如钌(二吡啶)32+螯合物。例如，在EP 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511，和WO 92/14138中描述了合适的钌标记基团。
[0071]术语“药物”指可以施用于个体用于治疗疾病的多肽(比如抗体或非抗体分子)。药物(比如治疗性多肽或治疗性单克隆抗体)正被广泛用于治疗各种疾病，比如肿瘤疾病(例如包括非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’ s lymphoma),乳腺癌(breast cancer),和结直肠癌(colorectal cancer)的血液和实体肿瘤)，免疫疾病，中枢神经系统疾病，血管疾病，或感染性疾病。例如，? Levine, A.P.,等，Journal of the Royal Societyof Medicine 98 (2005) 145-152描述了此种药物。此种药物例如是针对CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250,⑶3，HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, Levis Y 抗原，IL-6受体，或 IGF-1 受体的抗体。还由 Groner, B.,等，Curr.Mol.Meth.4 (2004) 539-547 ;和Harris, Μ.，Lancet Oncol.5 (2004) 292-302 描述了治疗性抗体。
[0072]术语“哺乳动物”指属于脊椎动物纲的生物。在一个实施方案中，术语哺乳动物指灵长类，猫，狗，绵羊，大鼠，小鼠和兔。在一个实施方案中，术语哺乳动物，指灵长类目的各科的成员，包括绒猴和絹毛猴(绒科)，新世界猴(卷尾猴科)，旧世界猴(猕猴科)，侏儒和鼠狐猴(鼠狐猴科)，指猴(指猴科)，丛猴和婴猴(婴猴科)，长臂猿和小猿(lesserapes)(长臂猿科)，大狐猴，原狐猴，和亲缘动物(大狐猴科)，真狐猴(狐猴科)，懒猴(懒猴科)，鼬狐猴(鼬狐猴科)，眼镜猴(跗猴科)，以及其交叉。在一个实施方案中，所述哺乳动物选自包括绒猴和絹毛猴，旧世界猴，侏儒和鼠狐猴，长臂猿和小猿，真狐猴，以及其交叉的各科的成员的组。在该特定的实施方案中，与人类最接近的亲缘动物，大猿(great apes),尤其黑猩猩，倭黑猩猩，大猩猩和红毛猩猩的组是排除在外的。
[0073]术语〃样品〃指来自已经被施用药物的哺乳动物的任何量的物质。此种物质包括但不限于来自该哺乳动物的全血，血清，或血浆，其是临床前例行程序中最广泛使用的样品来源。在一个实施方案中，所述样品是液体样品，如唾液，尿液，滑液，全血，血浆，或血清。在一个实施方案中，所述样品是全血，血浆，或血清。
[0074]术语〃固相〃意为非流体物质，并且包括由比如聚合物，金属(顺磁的，铁磁的颗粒)，玻璃，和陶瓷的材料制成的颗粒(包括微粒和珠子)；胶体物质(比如二氧化硅，氧化铝，和聚合物凝胶)；可以由聚合物，金属，玻璃和/或陶瓷制成的毛细管；沸石和其它多孔物质；电极；微量滴定板；固体条带；和比色皿，管，或其它光谱计样品容器。测定法的固相组分区别于测定可以接触的惰性固体表面，因为"固相"包含其表面上的用于与捕获抗体相互作用的至少一结构部分(moiety)。固相可以是固定的组分，比如管，条带，比色皿，或微量滴定板，或可以是非固定的组分，比如珠子和微粒。微粒还可以用作用于均相测定形式的固相。可以使用允许非共价或共价附着多肽和其它物质的多种微粒。此种颗粒包括聚合物颗粒，比如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，比如金纳米颗粒和胶体金；和陶瓷颗粒，比如二氧化娃，玻璃，和金属氧化物颗粒。参见例如Martin, C.R.，等，Analytical Chemistry-News&Features, 5 月 I 日，1998，322A-327A,其通过引用并入本文。
[0075]多重免疫复合物分析方法
[0076]已经发现，使用用于检测和表征生物基质中针对施用的药物的免疫复合物(尺寸和组成)的方法，所述方法包括使用与免疫测定联合的尺寸排阻层析(SEC)的多步骤方法，可以获得对改变的药物动力学的关联性，功效的损失或降低，天然对应物的中和作用以及一般免疫和超敏反应(包括血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病)。
[0077]因此，作为一个方面，本文中报道了用于分析/表征体内形成的循环免疫复合物(CICs)的方法，所述方法包括:样品的尺寸排阻层析，用于确定免疫复合物的重量/尺寸，所述样品获自已经施用所述药物至少一次的哺乳动物；任选地第二种非-SEC层析；和至少一种免疫测定，其中通过免疫复合物尺寸和免疫测定结果/示值读数的关联性来表征所述免疫复合物。
[0078]作为一个方面，本文中进一步报道了用于表征体内形成的抗药物抗体-药物(ADA-D)复合物的方法，所述方法包括:样品的尺寸排阻层析，用于确定ADA-D复合物的重量/尺寸，所述样品获自已经施用所述药物至少一次的哺乳动物；和至少一种用于检测抗药物抗体的酶联免疫吸附测定，其中所述免疫复合物表征为通过阳性(positive)酶联免疫吸附测定的和重量介于约150 kDa和约400 kDa之间的低分子量复合物，表征为通过阳性酶联免疫吸附测定的和重量介于约400 kDa和约1,500 kDa之间的中分子量复合物，或表征为通过阳性酶联免疫吸附测定的和重量介于约1，500 kDa和约7，000 kDa之间的高分子量复合物。
[0079]本文中还报道的是如本文报道的方法用于确定对改变的药物动力学的关联性，用于确定功效的损失或降低，用于确定药物的天然对应物的中和作用，用于确定免疫和超敏反应(包括血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病)的用途。
[0080]例如，向哺乳动物施用药物后，哺乳动物的免疫系统可以将施用的药物识别为外来的并产生抗药物抗体以中和施用的外来物质。如果药物包含相对哺乳动物是内源的成分，则所述抗药物抗体还可以针对药物的该成分并且同样也靶向哺乳动物中的内源对应物。
[0081]针对施用的治疗性药物的免疫应答/AM形成/补体激活可以导致形成免疫复合物。免疫复合物(ADA-D复合物)的形成可以导致改变的药物动力学性质或临床后遗症，例如血清病样综合征。
[0082]免疫复合物性质可以是诱导的后续影响的重要决定因素:
[0083]-复合物尺寸
[0084]大尺寸复合物的形成可以导致通过RES系统的增强的清除。
[0085]中尺寸复合物的形成可以导致补体结合，随后是组织沉积和，，血清病“
[0086]小尺寸复合物的形成可以具有，，无“深入影响。
[0087]-复合物电荷
[0088]阳离子免疫复合物可以与细胞/组织膜(阴离子细胞表面)沉积/与细胞/组织膜(阴离子细胞表面)相关。
[0089]-复合物极性
[0090]-Clq -结合的或结合Clq的能力
[0091]因此，全面的免疫复合物表征是用于与体内作用(药物动力学改变和/或毒理学作用)相关联的先决条件。
[0092]然而，例如抗药物抗体(ADA)发生率的单独信息，不能与临床调查结果和改变的药物动力学深入相关。
[0093]形成的免疫复合物(比如抗药物抗体-药物复合物(ADA-D复合物))的量和尺寸，依赖于数个参数，例如浓度/比例以及表位和效价。
[0094]复合物尺寸是复合物清除或不良事件的诱导的重要决定因素。典型地，较大的复合物被网状内皮系统清除，小复合物通常不引发炎症，然而中尺寸复合物可以抓住补体并可以引起组织损伤。
[0095]为了深入评价免疫应答，应该就尺寸表征可能形成的免疫复合物。此外，如果药物的内源对应物存在，则例如形成的ADA是否与这些分子交叉反应和内源对应物是否也是免疫复合物的一部分的信息是有价值的信息。
[0096]可以将信息与调查结果(比如由于免疫形成导致的改变的药物动力学或不良事件)相关联并且可以提供额外的信息以解释以下差异，所述差异是例如无任何影响的免疫复合物阳性受试者和具有改变的药物动力学或仅在一些免疫复合物阳性受试者中的临床后遗症或血清病样综合征的免疫复合物阳性受试者之间的差异。
[0097]为了确定已经施用了药物的哺乳动物中免疫复合物的形成和为了表征形成的免疫复合物，需要两步骤方法。
[0098]如本文报道的方法可以用于表征任何免疫复合物，例如ADA-D复合物以及自身免疫复合物(自身免疫疾病，比如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis),狼疮(lupus)
坐^
寸/ ο
[0099]尺寸排阻层析
[0100]第一步中，将形成的免疫复合物以其尺寸分离以确定复合物中组分的表观数量。这可以通过洗脱物的尺寸排阻层析(SEC)和分级(在一个实施方案中等分)完成。
[0101]如果抗药物抗体是IgG类的，其具有约150 kDa的分子量并且治疗性多肽的分子量范围介于约2.5 kDa (多肽药物；由20个氨基酸残基组成的多肽)和约250 kDa (药物抗体；包括另外融合的效应多肽或多特异性抗体的IgG类全长治疗性抗体)，那么抗药物抗体和药物的1:1化学计量的复合物在小多肽药物的情况下具有至少约150 kDa的分子量，并且在复合物药物抗体的情况下具有高达约400 kDa的分子量。
[0102]分级时间的选择限定尺寸信息的分辨率。
[0103]将可以是血清血浆(例如用于抗药物抗体检测)或滑液(比如类风湿疾病中)的样品(生物基质)用尺寸排阻层析分级。尺寸排阻层析提供第一信息:分析物(复合物)尺寸。
[0104]可以使用第二维度的层析，比如IEC分离来分析尺寸排阻层析的单个级分以确定复合物的电荷，或反相(RP)层析或HILIC分离以确定复合物的极性。
[0105]还可以分析尺寸排阻层析的各个级分的补体结合活性。
[0106]还可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析尺寸排阻层析的各个级分。
[0107]酶联免疫吸附测定
[0108]尺寸排阻层析洗脱物的分级使SEC分析能够多重化，因为可以进行不同的免疫测定以确定不同复合物，比如
[0109]-桥接型(bridging-type)-ELISA( “经典的ADA筛选测定):检测较高分子量级分中的ADA，表明ADA是较高分子级分的一部分。
[0110]-复合型-测定:利用药物特异的捕获和抗物种的检测对ADA-D复合物的检测是临床前研究中用于mAbs的通用方法(参见例如W02006/066912，W0 2008/031532，二者都通过引用并入本文)
[0111]-直接型-测定:通过使用固定化的药物和抗物种的特异检测，进行结合于药物和/或结合于内源对应物的ADA的检测
[0112]在用于各个测定的一个实施方案中，通过分析空白或理想地剂量给药前(pre-dose)的样品来评估特定截点。
[0113]对于截点的定义和对于不同板间的半定量结果比较，应该在限定的时间之后读出ELISA信号(在一个实施方案中通过在MTP上使用阳性对照监测)。
[0114]对于熟练技术人员而言，免疫测定是公知的。在相关教科书中概述了用于进行此种测定的方法以及实际应用和程序。相关教科书的实例是Tijssen, P.，Preparat1nof enzyme-antiboy or other enzyme-macromolecule conjugates (于:"Practiceand theory of enzyme immunoassys", Burdon, R.H.和 v.Knippenberg, P.H.(编辑)，Elsevier，阿姆斯特丹(1990) pp.221-278中)和涉及免疫学检测方法的"Methods inEnzymology^, Colowick, S.P.和 Caplan, N.0.(编辑)，Academic Press 的各卷，尤其是卷70，73，74，84，92，和 121)。
[0115]例如，由Hage, D.S.，在 Anal.Chem.71 (1999) 294R-304R 中描述了不同免疫测定的原理。Lu，B.，等，在Analyst.121 (1996) 29R-32R中，报道了定向固定化抗体用在免疫测定中。例如，由 Wilchek, M.Bayer, E.A., Methods Enzymol.184(1990)467-469 报道了亲和素-生物素-介导的免疫测定。
[0116]在第二步中，基于其组成表征分离的复合物的尺寸，例如确认抗药物抗体的存在和确定抗药物抗体的特异性。在一个实施方案中，所述第二步包括至少一种酶联免疫吸附测定(ELISA)。
[0117]通常，ELISA包括捕获分子和示踪分子。通常将所述捕获分子固定化/结合于固相。通常将示踪分子缀合于可检测标记，其中所述可检测标记可以是直接可检测标记或间接可检测标记。
[0118]为了确定抗药物抗体的存在，可以使用不同ELISA形式:
[0119]-夹心-ELISA
[0120]在一个实施方案中，使用缀合于固相的药物作为捕获分子并使用缀合于可检测标记的药物作为示踪分子。
[0121]在夹心-ELISA中，抗药物抗体由于其双价结构在捕获分子和示踪分子之间形成桥。这种测定形式可以还可以称为桥接-ELISA。
[0122]通过使用夹心_/桥接-ELISA，可以检测抗药物抗体。对覆盖不同于其分子量的重量范围(例如对于IgG-1gG复合物，不同于约300 kDa)的SEC级分中的ADA的检测表明ADA是较高分子量复合物的一部分。
[0123]-复合型-ELISA
[0124]在一个实施方案中，药物特异性抗体用作捕获分子并且缀合于可检测标记的抗物种特异性抗体抗体用作示踪分子。
[0125]在一个实施方案中，缀合于固相的药物用作捕获分子并且缀合于可检测标记的抗物种特异性抗体抗体用作示踪分子。
[0126]在一个实施方案中，缀合于固相的抗物种特异性抗体抗体用作捕获分子并且缀合于可检测标记的药物用作示踪分子。
[0127]在一个实施方案中，缀合于固相的抗物种特异性抗体抗体用作捕获分子并且缀合于可检测标记的药物特异性抗体用作示踪分子。
[0128]在复合型-ELISA中，可以检测抗药物抗体-药物复合物。
[0129]在临床前样品分析中，可以使用药物特异的捕获抗体和抗物种的特异检测抗体。
[0130]在临床样品分析中，可以使用药物特异的捕获分子，比如抗独特型抗体，和抗物种的特异检测抗体。
[0131]该测定提供ADA是否结合于药物或不结合于药物的信息。这通过使用ADA-D复合物的不同组分用于捕获复合物(通过与药物或抗药物抗体的相互作用)和用于检测捕获的复合物(假使与药物的相互作用已被用于捕获复合物，则通过与抗药物抗体的特异相互作用或假使抗药物抗体已被用于捕获复合物，则通过与药物的特异相互作用)实现。
[0132]因为抗药物抗体通常是由已经被施用药物的哺乳动物产生的全长抗体，因此，抗药物抗体包括特异于哺乳动物的恒定区。因此，利用物种特异恒定区的存在，物种特异的抗体可以用于特异结合(捕获或检测)抗药物抗体，而不考虑抗药物抗体的结合特异性。
[0133]-直接型-ELISA
[0134]在一个实施方案中，缀合于固相的药物用作捕获分子并且缀合于可检测标记的抗物种特异性抗体抗体用作示踪分子。
[0135]在一个实施方案中，缀合于固相的药物的内源对应物用作捕获分子并且缀合于可检测标记的抗物种特异性抗体抗体用作示踪分子。
[0136]通过使用包括固定化的药物内源对应物和用于检测的抗物种抗体的直接型-ELISA，可以检测抗药物抗体并具体说明ADA是否结合于药物或内源对应物。此外，可能通过使用物种和亚型特异的抗体确定抗药物抗体的抗体同种型。
[0137]通过信号相对尺寸矩阵进行结果的评价。
[0138]在一个实施方案中，将所述样品与捕获分子和/或示踪分子孵育达16小时至32小时的时间段。
[0139]桥接型-ELISA是使用双抗原桥接免疫测定，用于对哺乳动物样品中药物⑶和针对药物的抗体(抗药物抗体，ADA)的免疫复合物进行免疫学确定的方法。
[0140]所述免疫复合物进一步缩写为ADA-D复合物。
[0141]在一个实施方案中，样品中ADA-D复合物的免疫学确定使用包括捕获抗体和示踪抗体的双抗原桥接免疫测定，其特征在于一个抗体是特异结合哺乳动物的Ig的抗体，并且另一个抗体是特异结合药物的抗体。
[0142]在确定过程中，抗-哺乳动物Ig抗体，ADA-D复合物，和抗药物抗体之间形成复合物并且形成的复合物的量与ADA-D复合物，药物和/或ADA的浓度相关。
[0143]在一个实施方案中，可以进行用于检测形成的ADA-D复合物的直接样品分析。在此种测定中，仅在如果样品既包含药物也包含抗药物抗体时发现阳性信号。
[0144]在一个实施方案中，将样品与预定量的药物抗体预孵育之后进行所述样品分析。在此种测定中，不依赖于样品中药物的存在/缺乏，如果样品包含抗药物抗体，则发现阳性信号。
[0145]在一个实施方案中，通过经由药物的氨基酸骨架的N-末端和/或ε-氨基基团(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基基团，羧基-，巯基-，羟基-和/或酚官能团和/或药物的糖结构的糖醇基团的化学结合，进行药物与其缀合伴侣的缀合。
[0146]在一个实施方案中，将捕获抗体或药物通过被动吸附缀合于固相并且因此在至少两个不同抗体位点缀合于固相。例如由Butler, J.Ε.，在“Solid Phases in Immunoassay”，第 205-225 页；Diamandis, Ε.P.和 Christopoulos, Τ.K.(编辑):1mmunoassays (1996)Academic Press San Diego 中描述了被动吸附。
[0147]在一个实施方案中，将捕获抗体或药物通过特异结合对固定化。此种结合对(第一组分/第二组分)为，例如，链霉亲和素或亲和素/生物素，抗体/抗原(参见，例如，Hermanson, G.T.,等，B1conjugate Techniques, Academic Press, 1996),凝集素 / 多糖，类固醇/类固醇结合蛋白，激素/激素受体，酶/底物，IgG/蛋白A和/或G，等。在一个实施方案中，将捕获抗体或药物缀合于生物素并且通过固定化的亲和素或链霉亲和素进行固定。
[0148]在一个实施方案中，将示踪抗体缀合于可检测标记。在一个实施方案中，将示踪抗体通过特异性结合对缀合。此种结合对(第一组分/第二组分)是，例如，链霉亲和素或亲和素/生物素，抗体/抗原(参见，例如，Hermanson, G.T.，等，B1conjugateTechniques, Academic Press, 1996)，凝集素/多糖，类固醇/类固醇结合蛋白，激素/激素受体，酶/底物，IgG/蛋白A和/或G，等。在一个实施方案中，将示踪抗体通过洋地黄毒苷和针对洋地黄毒苷的抗体缀合于可检测标记。备选地，将示踪抗体缀合于电化学发光标记，如钌二吡啶复合物。
[0149]在一个实施方案中，所述方法使用双抗原桥接免疫测定，用于对猴物种样品中的针对药物的抗体(抗药物抗体，ADA)进行免疫学确定。
[0150]在一个实施方案中，所述方法使用包括捕获分子和示踪分子的双抗原桥接免疫测定，进行哺乳动物样品中ADA的免疫学确定，其特征在于捕获分子或示踪分子之一是特异结合哺乳动物IgG的抗体并且各自另一个分子是药物。
[0151]在一个免疫学确定ADA的实施方案中，捕获分子是药物并且示踪分子是特异结合哺乳动物的IgG的抗-哺乳动物IgG抗体，样品源自/获自所述哺乳动物。在一个免疫学确定ADA的实施方案中，捕获分子是特异结合哺乳动物的IgG的抗-哺乳动物IgG抗体，样品源自/获自所述哺乳动物，并且示踪分子是药物。在确定的过程中，在药物，ADA，和抗-哺乳动物IgG抗体之间形成复合物并且形成的复合物的量与ADA浓度相关。在一个免疫学确定ADA的实施方案中，所述抗-哺乳动物IgG抗体是单克隆抗体(抗-哺乳动物IgG mAb)ο
[0152]多肽(比如药物多肽或药物抗体)包含一些反应部分，比如，例如，氨基基团(赖氨酸，α-氨基基团)，硫醇基团(胱氨酸，半胱氨酸，和甲硫氨酸)，羧酸基团(天冬氨酸，谷氨酸)和糖醇基团。可以将这些用于偶联结合伴侣，如表面，蛋白，聚合物(比如例如PEG,纤维素或聚苯乙烯)，酶，或结合对的成员(参见例如Aslam M.，和Dent, A., B1conjuat1n MacMillan Ref.Ltd.(1999)50-100)。
[0153]多肽的最常见反应基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε -胺。通常，几乎所有多肽包含丰富的赖氨酸。赖氨酸胺在PH 8.0 (pKa = 9.18)以上是相当良好的亲核物质，并且因此容易和有规则地与多种试剂反应以形成稳定的键。多肽另一种常见反应基团是来自包含硫的氨基酸胱氨酸和其还原产物半胱氨酸(cysteine)(或半胱氨酸(half cystine))的硫醇残基。半胱氨酸包含游离的硫醇基团，其比胺更亲核并且通常是蛋白质中最具有反应性的官能团。硫醇通常在中性PH下具有反应性，并且因此可以在胺存在的条件下选择性地偶联于其它分子。因为巯基基团相对具有反应性，所以具有这些基团的多肽它们常以具有如二硫基团或二硫键的其氧化形式存在。此外，对于胱氨酸和半胱氨酸，一些多肽还具有氨基酸甲硫氨酸，其在硫醚键中包含硫。文献报道了使用一些硫醇化交联试剂(比如Traut’s试剂(2-亚氨基硫醇烷)，琥珀酰亚胺基(乙酰基硫)乙酸酯(SATA)，或硫代琥珀酰亚胺基6-[3-(2_吡啶基二硫)丙酰氨基]己酸酯(硫代(sulfo)-LC-STOP))以提供通过反应性氨基基团引入多个巯基基团的有效途径。活性酯，尤其N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常使用的用于修饰胺基团的试剂。在含水环境中反应的最适PH为pH 8.0至9.0。异硫氰酸酯是胺-修饰试剂并且与蛋白质形成硫脲键。它们在含水溶液(最佳为PH 9.0至9.5)中与多肽胺反应。醛与脂肪族和芳香族胺，肼，和酰肼在温和含水条件下反应，形成亚胺中间体(席夫碱)。可以将席夫碱用温和或强烈的还原剂(比如硼氢化钠或氰基硼氢化钠)选择性还原以得到稳定的烷基胺键。其它用于修饰胺的试剂是酸酐。例如，二乙三胺五乙酸酐(DTPA)是双功能螯合剂，其包含两个胺-反应性酸酐基团。其可以与蛋白质的N-末端和ε-胺基团反应以形成酰胺键。酸酐环打开以产生多价的，能够在配位络合物中紧密结合金属的金属螯合臂。
[0154]多肽中另一种常见反应基团是羧酸(天冬氨酸，谷氨酸)。多肽在天冬氨酸和谷氨酸的C-末端位置和侧链内包含羧酸基团。对于缀合，通常通过使用水溶性的碳二亚胺将羧酸基团转变为反应性酯并与亲核试剂(比如胺，酰肼，或肼)反应。含胺试剂应该是弱碱性的以在多肽上其它胺存在的情况下选择性地与活化的羧酸反应。多肽交联可以在将PH提闻到8.0以上时发生。
[0155]可以将过碘酸钠用于将碳水化合物部分的糖的醇部分氧化为醛。可以将各个醛基团与如对羧酸描述的胺，酰肼，或肼反应。
[0156]硫醇-反应性试剂是将偶联于多肽上的硫醇基团、形成硫醚-偶联的产物的那些。这些试剂在弱酸性到中性PH下快速反应，并且因此可以在胺基团存在的条件下被选择性反应。卤乙酰基衍生物，例如碘乙酰胺，形成硫醚键并且是用于硫醇修饰的试剂。反应在本身存在或由还原多肽的不同位置处的胱氨酸的二硫键产生的半胱氨酸基团处发生。进一步有用的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与硫醇-反应性试剂的反应基本上与碘乙酰胺相同。马来酰亚胺在弱酸性到中性pH下快速反应。
[0157]胺，酰肼，和肼是醛和羧酸-反应性试剂(形成酰胺，腙，或烷基胺键)。可以在通过水溶性碳二亚胺激活羧基基团后将胺，酰肼，和肼偶联于多肽的羧酸。含胺试剂必须是弱碱性的，以便其在更高碱性的赖氨酸ε-胺的存在下选择性地与碳二亚胺激活的多肽反应以形成稳定的酰胺键。在与醛基团的反应中，所述反应可以通过高碘酸盐氧化多肽上的碳水化合物残基在多肽上产生，形成席夫碱中间体，其可以通过用氰基硼氢化钠(温和和选择性的)或硼氢化钠(强的)水溶性还原剂还原中间体而被还原为烷基胺。
[0158]图1中，显示药物ADA-D复合物形成的动力学(Img药物和Img ADA)。可以看出，随时间增加，形成更高级的复合物，例如从1:1药物:ADA-复合物开始，通过1:2药物:ADA复合物，到1:3药物:ADA复合物(时间点O分钟，50分钟，100分钟，160分钟，200分钟)。通过加入进一步的ADA，样品的组成可以进一步被转变为降低了单体药物峰的较高分子量复合物(图2)。
[0159]图3中显示典型的重构的SEC示意图(y-轴是ELISA的0D)和以如本文报道的方法获得的ELISA结果。图4显示样品201的重构的SEC的放大，其中将Y-轴保持不变。从而可以看到样品组成中的差异。
[0160]本文中使用以下缩写:
[0161]ABTS 2，2’-连氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯(6)] 二-铵
[0162]Ab 抗体
[0163]ADA 抗药物抗体
[0164]Bi生物素
[0165]CoA 分析证书
[0166]Conc.浓度
[0167]CPP 猕猴合并的空白血浆
[0168]Dil.稀释度
[0169]ELISA 酶联免疫吸附测定
[0170]HRP 辣根过氧化物酶
[0171]mAb 单克隆抗体
[0172]MTP 微量滴定板
[0173]OD 光密度
[0174]PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0175]rpm 每分钟转数
[0176]RT 室温(+15 至+25°C )
[0177]RTU 即用的
[0178]SA 链霉未和素
[0179]SEC 尺寸排阻层析
[0180]提供以下实施例以帮助理解本发明，其真实范围列于后附的权利要求中。应当理解可以在陈述的方法中在不脱离本发明的实质下进行改动。
[0181]附图简沭
[0182]图1药物ADA-D复合物形成的动力学(Img药物和Img ADA)。
[0183]图2进一步加入ADA的如在图1中显示的动力学。
[0184]图3典型的重构SEC示意图和以如本文报道的方法获得的ELISA结果。
[0185]图4如在图3中显示的重构的SEC的放大。
[0186]图5五只猴的血浆中施用的药物的浓度进程(剂量=100mg/kg,重复施用，在研究的第17天施用)。
[0187]图6IgG沉积阳性动物(半定量评价)。
[0188]实施例1
[0189]称猴(cynomolgus monkey)研究的样品分析
[0190]为了检测包含针对施用的药物的抗药物抗体(ADA)的复合物，分析获自猕猴研究的二十七个血浆样品。此外，进行复合物尺寸的评估。
[0191]使用包括尺寸排阻层析(SEC)和酶联免疫吸附测定(ELISA)的两步骤方法进行分析。
[0192]通过SEC，接着将SEC流出物分级(I分钟级分)，实现可能的复合物的尺寸_依赖性分离，其使得SEC分析多重化成为可能，因为可以通过不同的ELISA分析各个级分。通过两种不同的ELISA，实现针对施用的药物的ADA的检测和收集的级分中ADA-D复合物的存在的检测。一种被设计为使用用于捕获的生物素化的药物和抗-猕猴IgG特异检测抗体来检测ADA (ADA测定)，第二种测定被设计为通过使用药物特异的捕获分子和抗-猕猴IgG特异性检测抗体来检测ADA-D复合物。
[0193]从主要组和康复组(recovery group)动物收集称猴血衆样品。组1:安慰剂组(样品01，02，03，04，05，06)，组2:基本剂量(样品07，08，09，10，11，12)，组3:两倍基本剂量(样品 13，14，15，16，17，18)，组 4:四倍基本剂量(样品 19，20，21，22，23，24，25，26，27)。
[0194]分级时间的选择限定尺寸信息的分辨率。分级大小为I分钟。将一些级分的ELISA结果组合以将信息精简为“高，中和低分子量级分”。
[0195]SEC:
[0196]在B1Suite 450 (具有从约20.000至约7.000.000 Da的分子量范围的13 μ mSEC柱)上分离猕猴血浆样品。为了避免蛋白质在柱顶上不需要的沉淀，将猕猴血浆与乙醇混合(与流动相的乙醇组成相当)，然后离心I分钟(猕猴血浆:乙醇(95wt-% )的比例为约16:1 ;20，800rcf.离心I分钟)。将20 μ I样品注入HPLC系统(Agilent 1100)。在280nm波长监控UV踪迹。使用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的5 %乙醇作为流动相，进行等度(isocratic)分离(0.5ml/min流速,达25分钟,此后0.75ml/分钟达13分钟,和0.5ml/分钟最后2分钟)ο
[0197]将SEC分离的流出物分级以使能够通过ELISA检测。在一个实施方案中，收集分级-时间为I分钟的十二个连续的级分，覆盖从9分钟(外水体积)至21分钟的洗脱时间。
[0198]在下表中给出各个级分相应的计算的分子量。
[0199]表
[0200]级分J保留时M—J分子M.......................................................[分钟] PcDa]
19-10>7000-3515
2〗0-113515-2285
311-122285-1486
412-13__1486-966
513-14966-628
614-15628-408
715-16408-265
816-17265-173
917-.18173-112
1018-19__H 2-73_
1119-2073-47
12120-2147-31
[0201]ADA-测定:
[0202]在较高分子量SEC级分(大于150kDa (其相当于IgG/ADA单体的重量))中ADA的检测表明，ADA是较高分子量复合物的一部分。通过使用ADA测定分析收集的级分，进行ADA检测。复合物尺寸表征是基于SEC保留时间。通过分析各个级分中ADA-D复合物(ADA-药物复合物)的存在，实现复合物组成的表征。
[0203]为了检测ADA和ADA-D复合物，建立了两种顺序的ELISA方法。
[0204]为了 ADA检测，将SA-MTP的孔用生物素化的药物(D_Bi ；c = I μ g/ml)包被I小时。将包被溶液移除后，将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次，将SEC-级分的等分部分加入并在MTP中震荡孵育过夜。将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次后，加入洋地黄毒苷化的(digoxigenylated)抗-称猴 Fe 抗体 ?Cyno Fc>_Dig, c = 0.1 μ g/ml)并震荡孵育一小时。用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤孔三次后，加入缀合于HRP(多)Fab片段的抗-洋地黄毒苷抗体(5mU)并震荡孵育一小时。将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次后，加入ABTS溶液并且监控显色(测量波长405nm ;参考波长490nm)。
[0205]为了 ADA-D复合物检测，将SA-MTP孔用生物素化的抗药物抗体(〈药物>_Bi ；c =
2μ g/ml)震荡包被I小时。移除包被溶液后，将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次，加入SEC-级分的等分部分并且在MTP中震荡孵育一小时以用于复合物检测。移除溶液后，将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次，加入洋地黄毒苷化的抗-猕猴Fe抗体(<Cyno-Fc>-Dig)溶液(c = 0.1 μ g/ml)并震荡孵育I小时。将溶液移除后，将孔用具有
0.05 %吐温20的IxPBS洗涤三次，加入抗-洋地黄毒苷抗体-HRP缀合物(多)Fab片段溶液(5mU)并震荡孵育。将孔用具有0.05%吐温20的IxPBS洗涤三次后，加入ABTS溶液并且监控显色(测量波长405nm ;参考波长490nm)。
[0206]基于OD信号的截止值是基于研究安慰剂样品的分析定义的，在所述截止值以上的SEC级分结果被定义为对于ADA (ADA测定)或ADA-D复合物(ADA-D测定)的存在为阳性。
[0207]ADA测定和ADA-D测定的结果显示于下表中(ELISA结果列为安慰剂样品的级分的分析的OD值(上部:ADA测定；下部:ADA-D测定))。
[0208]^.
[0209]ADA 测定
[0210]级分/保留时间[分钟]
[0211]
~|9-10~IlO-1l 111-12112-13 |l3-14~|l4-15 |l5-16|l6-17
? 0.07~ 0.08~ 0.09 0.10~07ΤΙ 0.09~ 0.10 07ΤΙ
20.08~ 0.13~ 0.14 0.13~0ΤΤ3 0.13~0ΤΤ2 0.14
30.10~07?2~0ΓΤ2 0ΤΤ2~0ΤΤ2 --2~0ΤΤ2 0.13
40.08~ 0.08~ 0.08 0.10~ 0.10 0.10~ 0.10 0ΤΤ2
50.08~ 0.07~ 0.09 0.09~ 0.10 0.10~ 0.10 0ΤΤ2
60.07~ 0.07~ 0.08 0ΤΤ2~ 0.09 0.10~ 0.09 0ΓΤΙ
[0212]ADA-D 测定
[0213]级分/保留时间[分钟]
[0214]
~|9-10~IlO-1l 111-12112-13 |l3-14~|l4-15 |l5-16|l6-17
?0.04~0.03~0.030.04~0030.03~0.040.04
20.04~ 0.04~ 0.050.08~07050.04~ 0.050706
30.03~ 0.04~ 0.040.04~ 0.040.04~ 0.040.04
40.03~ 0.03~ 0.030.03~ 0.030.03~ 0.030.04
50.03~ 0.03~ 0.030.03~ 0.030.03~ 0.040.04
60.04~ 0.03~ 0.030.04~ 0.040.04~ 0.040.04
[0215]基于这些数据，对于ADA测定，定义截止值为OD彡0.20，并且对于ADA-D测定，定义截止值为OD ^ 0.10，其代表分析的级分中约两倍的平均空白信号。
[0216]为了进一步半定量评价，定义在下表中给出的值(对于ADA-测定(左)和ADA-D测定(右)的截止值(OD))。
[0217]表.
[0218]
信号结果__信号丨ο。丨I
低T 0.20 IIJf1-;低T.0.10 IlJtt
0,20^ 1,00 Wl性0.10-0.75
_(iIiIri1V)_(tfriv)
,WrJ- 1.00 ,丨性Π
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[0219]分析了二十七种获自研究的猕猴血浆样品，以检测包含针对施用的药物的抗药物抗体(ADA)的复合物。此外，进行复合物尺寸的评估。
[0220]组合级分1-3的结果并作为高分子量复合物级分给出，级分4-6为中分子量复合物级分，并且级分7-8为低分子量复合物级分。在下表中提供研究样品的级分分析的ELISA结果的概览(左:ADA测定；右:ADA-D测定；组I为安慰剂组；组2为基本剂量；组3为两倍基本剂量；组4为四倍基本剂量)。
[0221]表.
[0222]
【权利要求】
1.一种用于确定体内形成的循环复合的抗药物抗体的方法，所述循环复合的抗药物抗体包含(外源的)治疗性多肽和内源的抗药物抗体，所述方法包括: a)样品的尺寸排阻层析，其用于确定免疫复合物的重量/尺寸，所述样品来自已经被施用药物至少一次的哺乳动物， b)任选地第二种非-SEC层析， c)用于检测所述抗药物抗体的至少一种多相免疫测定，和 d)任选地基于质谱法的分析， 其中通过将免疫复合物尺寸和免疫测定或质谱法测定示值读数/结果相关联来表征所述免疫复合物， 其中所述治疗性多肽是合成的或非天然存在的治疗性多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品是血清或脑脊液。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于所述尺寸排阻层析是以级分收集洗脱物的尺寸排阻层析。
4.根据在前权利要求任一项所述的方法，其特征在于将所述尺寸排阻层析的级分中的至少一个进一步通过以级分收集洗脱物的第二种非-SEC层析分离。
5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其特征在于在免疫测定中分析各个级分。
6.根据在前权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述免疫测定是抗药物抗体免疫测定。
7.根据在前权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述免疫测定中至少一种是桥接酶联免疫吸附测定。
8.根据在前权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述免疫测定中至少一种是用于检测ADA-D复合物的复合物测定。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述复合物测定包括药物特异的捕获抗体和作为检测抗体的抗物种特异性抗体。
10.根据在前权利要求任一项所述的方法，其特征在于所述免疫测定中至少一种是用于检测抗药物抗体的直接测定，所述抗药物抗体结合于所述药物和/或结合于所述药物的内源对应物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述直接测定包括作为捕获分子的固定化药物或所述药物的内源对应物和作为检测抗体的抗物种特异性抗体。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法用于将免疫复合物特性与改变的药物动力学相关联的用途。
13.根据权利要求1至11任一项所述的方法用于确定药物功效降低的用途。
14.根据权利要求1至11任一项所述的方法用于确定药物的天然对应物的中和作用的用途。
15.根据权利要求1至11任一项所述的方法用于确定针对药物的免疫和超敏反应的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于所述免疫和超敏反应是血清病/III型超敏反应/免疫复合物-介导的疾病。
【文档编号】G01N33/564GK104136923SQ201380011056
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年3月7日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】乌韦·达尔, 格雷戈尔·约尔丹, 罗兰·施塔克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司