基于选择剂的识别和量化系统及用于在单次分析中识别和量化多种分析物的方法

基于选择剂的识别和量化系统及用于在单次分析中识别和量化多种分析物的方法
【专利摘要】本申请提供了一种用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法，所述方法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；在第一维分离中采用选择性吸附技术将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；使所分离的免疫复合物解离；在第二维分离中采用选择性吸附技术使解离的免疫复合物中的所述分析物与所述亲和选择剂彼此分离；并根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。
【专利说明】基于选择剂的识别和量化系统及用于在单次分析中识别和 量化多种分析物的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年2月2日提交的美国临时专利申请序列号 No. 61/594, 193(代理人案号NO.PERF-P0006-US)的优先权，并且是于2010年3月10日提交 的美国专利申请序列号No. 12/721，173 (代理人案号No. PERF-P0004-US)以及同样于2010 年3月10日提交的国际专利申请No. PCT/US2010/026819 (代理人案号No. PERF-P0001-W0) 的部分继续申请，其公开内容明确地通过引用以其整体并入本文。

【技术领域】
[0003] 本公开内容总体上涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统，并且特别地涉及用 于在单次分析中分析多种分析物的基于亲和选择剂（affinity selector)的识别和定量系 统以及方法。

【背景技术】
[0004] 在与约100, 000种其他组分的混合物中测定单一分析物是一项艰巨的任务。在 六十多年前，分析人员开始认识到抗体的结构选择性可用于基于抗原和半抗原的化学结 构从生物提取物或血液中结合和纯化所述抗原和半抗原。该技术变得如此重要以至于 Rosalyn Yalow 因放射免疫测定（radio-immunological assays，RIA)而获得 1960 年的诺 贝尔奖。连同酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，这两项 技术为世界提供了测量低至pg/mL水平的抗原的简单方法。
[0005] RIA和ELISA二者的基本组成都是在测定的第一步中使用固定化抗体以实现从样 品中选择抗原。自从这些方法出现以来，分析免疫学家已理解，在表面结合抗体引入了显著 的动力学限制。例如，抗原必须依照分子大小而经过相当的距离以到达表面，从而增加了在 试管或微量滴定孔中发生抗原结合所需的时间量。此外，测定中使用的所有抗体在测定孔 表面或在颗粒上聚集在一起，而抗原则均匀地分布于整个溶液中。当在微量滴定孔中进行 ELISA时，通常使用一天或更长的孵育时间，以允许抗原有时间扩散至结合有抗体的孔壁 上。在RIA的情况下，使扩散问题最小化的努力涉及使用大量的非常小的固定有抗体的无 机颗粒。在过去的几年期间，已经使用了许多类型的混合、流动、加热以及甚至超声的过程 以使上述的扩散问题最小化。虽然做出了这些努力，但是扩散问题仍然存在。
[0006] 随着分析化学的发展，已认识到可获得涉及要同时测定多种分析物之样品的多种 问题的更好更完整的答案。这进而导致了对"分析复用（analytical multiplexing)"兴趣 的增加，其中在单次分析期间对样品中的大量分析物进行分析。这常常通过免疫阵列而进 行。
[0007] 对免疫阵列的兴趣源自微电子机械系统（micro-electro-mechanical-system， MEMS)的普及和成功。当已将几种类型的抗体阵列用于大规模复用（包括高通量和并行处 理技术）时，另一些方法集中于较少数目样品的大规模复用，这是例如关注使每次测定的 总分析时间和成本最小化的临床实验室所需要的。无论使用哪种方法，免疫阵列系统都仍 然面临抗体固定化和动力学的挑战。还存在抗体在固定化（尤其是如果它们被错误的定位 于表面）之后是否仍将保留全部活性的问题。还必须考虑空间问题，尤其是抗体在表面的 定位及其堆积密度方面。最后，再现性也是一个因素，尤其是由于很难使来自在表面上沉积 的皮升（Picoliter)体积溶液的固定化抗体再生。蒸发以及很多其他现象也使滴定板水平 的固定化所经历的再现性降低。
[0008] 虽然抗原在免疫阵列中必须扩散以到达表面的距离比在微量滴定孔中的要小，但 是动力学问题仍然是免疫阵列的一个严重限制。在低的抗原浓度下尤其如此。抗原从溶液 中的所有点扩散至阵列元件之一需要大量的时间。因为在抗原：抗体复合物形成中的分子 对接需要精确的空间定位，所以抗原通常在建立正确的捕获定位之前多次撞击表面。例如， 如果抗原在128兀件阵列上与表面碰撞之后未被捕获，那么它在第二次撞击表面之前有大 量空间要行进。
[0009] 如上所述，基于颗粒的测定始于RIA和Yalow方法。目前Yalow法已发展成为两 类测定系统：1)用于流式细胞术测定的颗粒方法（例如，Luminex系统），其中检测单个颗 粒的荧光；以及2)其中将抗体放置在磁性颗粒上的方法，免疫复合物在所述磁性颗粒上形 成，然后将所述颗粒从溶液中取出，并释放抗原用于进一步测量（例如，Leigh Anderson的 SISCAPA系统）。复用需要制备用于每种被测定抗原的不同组的免疫吸附珠。这意味着，需 要将20至50组不同的携带珠的抗体添加到样品溶液中，从而导致在寻找合适的抗体颗粒 方面甚至更大的抗原动力学限制。此外，所述溶液因具有如此大量的颗粒而变得拥挤，使得 抗原必须在未携带其抗体的颗粒周围扩散。用于处理这些限制的一种推荐解决方案是将多 个抗体固定在单个颗粒上。然而，该解决方案未完全解决扩散和化学计量控制的问题。而 且，颗粒表面上抗体浓度的稀释意味着抗原可撞击颗粒表面而不接触到其抗体。此外，总表 面积以及由此所需的颗粒总数仍然保持很高。
[0010] 至于流式细胞术策略（例如Luminex系统），在可通过流式细胞术分析免疫复合物 之前，必须在颗粒表面上形成免疫复合物。而该系统与上述系统非常类似，每个珠携带靶向 单一抗原的单一抗体。此外，在抗原捕获中还存在扩散问题。
[0011] 有趣的是，哺乳动物免疫系统的功能是处理数以千计的抗原，尽管它们并不都是 同时进行。随着在单个哺乳动物中产生对外来物质的免疫，产生了针对数以千计免疫原的 抗体。这些抗体包含在血液中循环的免疫球蛋白中，在任何时候，随着抗原：抗体复合物的 形成，数百种抗原被隔离。基于对哺乳动物免疫系统的分析，可得出这样的结论：因为抗体 形成免疫复合物，所以它们已发展为在溶液中起作用。除了在溶液中起作用之外，它们还同 时隔离大量抗原，并且几乎没有固定化抗体测定系统中所见到的限制。
[0012] 哺乳动物免疫系统的上述发现极其重要，特别是因为它们清楚地表明，溶液中免 疫复合物的形成是天然有效的，而在固定化表面上之复合物的形成则并非如此。此外，清楚 的是，可以在溶液（例如，血液）中同时形成几种免疫复合物，这是在进行分析复用过程时 要实现的一个必需因素。最后，通常影响免疫测定的大多数问题（例如，固定化期间的活性 丧失、抗体的适当定位、扩散动力学以及具有足够的表面积）在这些基于天然溶液的系统 内并不普遍。
[0013] 虽然天然形成的免疫复合物具有上述优点，但是这样的免疫测定仍需要向样品中 添加抗体，这可产生问题。例如，向血浆样品中添加大量抗体可导致蛋白质浓度升高至阻碍 分析物扩散的水平。虽然这个问题在表面上看起来可能似乎有关系，但是进一步观察之后 可推断出这个问题很可能并不合逻辑。更特别地，在血浆中存在的血清白蛋白的平均浓度 为约50mg/mL至约100mg/mL，而存在的免疫球蛋白的量为约4mg/mL,并且任意特定抗体的 量很可能在约1 μ g/mL至约100 μ g/mL的范围内。如果假定进行分析测量所需的抗体浓度 为10 μ g/mL,并且当将100种抗体添加至血楽样品中时，蛋白质浓度将总计升高约lmg/mL。 类似地，如果血浆样品中的蛋白质浓度为75mg/mL，则蛋白质浓度将升高约1. 3%。因此，可 推断出向血浆中添加100种抗体以进行100倍的复用分析将对蛋白质浓度、溶液粘度以及 最终分析物的扩散几乎没有影响。而且，添加1〇〇〇种抗体只使质量提高10mg/mL，或者使蛋 白质浓度改变14% ;这很可能也不足以对分析造成影响。
[0014] 在1960年以前，免疫测定一般靶向单个抗原，并且通过所谓的"沉淀素反应 (precipitin reaction)"的方法在溶液中进行。形成免疫复合物之后，用于测定的多克隆 抗体混合物或者形成沉淀，或者通过添加碳水化合物或乙二醇聚合物而被诱导形成沉淀。 抗原浓度通过光散射进行测定；然而，这种方法缺乏灵敏度和线性，并且沉淀素测定一次只 允许测定一种抗原的事实导致了该方法告终，并最终转变为灵敏得多的RIA和ELISA方法。 虽然沉淀素反应方法失败了，但是仍然可以推理出，如果选择性和检测灵敏度得以大幅改 进，则基于溶液的免疫复合物形成方法可用于免疫测定。
[0015] 虽然最初的沉淀素和RIA方法在进行抗原测量中取决于单一选择方法（即，一种 抗原），但是现今可接受的是，单一抗体的选择性不足以将样品中的抗原与所有其他化学实 体区分开。当前的免疫测定建立在多维的选择和/或区分上，并且如果这些维度中的每一 个都是正交选择时尤其理想。


【发明内容】

[0016] 本公开内容通过提供用于分析抗原的新的多维分析策略和系统从而克服或改善 了上述现有技术缺点中的至少一个，或者提供了有用的替代方案。
[0017] 在其一种形式中，提供了用于抗原分析的多维分析策略。根据本公开内容的这个 方面，在第一维分析期间，用可溶性免疫复合物中的抗体隔离样品溶液中的抗原。在分析 过程开始时向溶液中添加抗体的具体目的是结合抗原以在所述多维方法的后续步骤中进 行定性和定量分析。交叉反应的抗原、非特异性结合物质以及与抗原发生次级结合的物质 也可在第一维中吸附至免疫复合物，并在之后维的分析中被清除。在第一维中形成的免 疫复合物的独特性质之后在第二维分析中被利用，其使用分子大小分级系统（molecular sizing system)或祀向隔离抗体之具体性质的吸附介质，基于其流体力学体积将其与样 品中的其他组分分离（resolve)。基于这两种性质之一的分级对于表位：互补位识别是正 交的，并且第三维和第四维中的区分通过下述方式的组合来实现：分析物特异性化学修饰 (例如，衍生化或蛋白水解）和大小区分以及从表面（例如，在反相基质或离子交换介质 上）吸附和差异洗脱，或者通过以尺寸排阻和疏水吸附（正如使用限进介质一样）的组合。 所选择的具体区分机制以及其中它们联用的顺序取决于所靶向分析物的化学性质以及在 前两维中使用的分级机制。在第五维及更高维的分析发生在从质谱到荧光和电化学检测器 的检测系统内。根据采用质谱检测系统的某些实施方案，可根据分析物在第五维中的质量、 在第六维中碰撞诱导的分析物解离以及在第七维中所得碎片离子的质量分析来解析所述 分析物。
[0018] 根据本公开内容的另一形式，提供了同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方 法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向所述样品溶液添加亲和选择剂以形成所 述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物；提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所 形成的免疫复合物与其它非分析物物质部分或完全分离；提供第二分离方式，以使所述样 品溶液中所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。
[0019] 根据本公开内容的另一些方面，提供了用于同时分析样品溶液中的多种分析物的 多维方法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中 添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有 亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；将所形成的免疫复合物与所 述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；使所分离的免疫复合物解离；通过表面吸 附过程捕获所述分析物从而使解离的免疫复合物中的分析物与亲和选择剂彼此分离；将捕 获的分析物转移至检测装置；以及用所述检测装置根据其质荷比来解析所述分析物。
[0020] 在本公开内容的某些方面中，通过以下将所形成的免疫复合物完全或部分分离： 根据其流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，靶向亲和选择剂或分析物之独特 的结构特征以捕获分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交或者利用固定 化亲和素来吸附和捕获生物素化的亲和选择剂。
[0021] 在本公开内容的另一些方面中，通过以下将样品溶液中的分析物与亲和选择剂彼 此分离：根据其流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面吸附和差异 洗脱分析物，靶向亲和选择剂或分析物之独特的结构特征以捕获分析物或所形成的免疫复 合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择剂，从带电表 面吸附和差异洗脱分析物，从固定化的金属亲和螯合剂吸附和差异化洗脱分析物，或者从 富含硼酸的表面吸附和差异洗脱分析物。
[0022] 根据本发明教导的分析的分析物可包括但不限于分析物片段、分析物衍生物和分 析物同素异构体（isotopomer)中的至少一种。而且，本发明教导的亲和选择剂可包括但 不限于抗体、抗体片段、适配体（aptamer)、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡 核苷酸中的至少一种。根据某些实施方案，所述细菌蛋白质可包括G蛋白、A蛋白以及由生 物体产生的靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质中的至少一种，而所述寡核苷酸可包括 RNA、DNA和PNA中的至少一种。
[0023] 根据本公开内容的某些实施方案，用固定化抗体靶向亲和选择剂之独特的结构特 征使分析物与亲和选择剂彼此分离。根据这些具体实施方案，被祀向的独特的结构特征可 包括但不限于亲和选择剂特有的天然结构特征、已与亲和选择剂缀合的半抗原以及与亲和 选择剂缀合的免疫原中的至少一种。
[0024] 根据本公开内容的一些方面，进行分析的分析物包括使用质谱分析可检测的离子 化分析物，所述质谱分析特别检测根据其质荷比已经分离的分析物的母体离子。
[0025] 在本公开内容的某些方面中，通过使用检测装置对分析物进行解析，所述检测装 置被配置成进行以下的整合步骤：（a)将已根据其质荷比分离的分析物离子化；(b)利用气 相碎裂过程（gas phase fragmentation process)产生来自步骤（a)之母体离子的碎片离 子；（C)根据其质荷比分离步骤（b)中产生的碎片离子；以及（d)记录当步骤（C)所产生的 碎片离子与检测器表面碰撞时所产生的相对离子流。在用于解析分析物的检测装置方面， 根据某些实施方案，通过以下技术中的一种或更多种对分析物进行检测：质谱、吸光度、荧 光和电化学分析。
[0026] 根据本公开内容的另一些实施方案，可使用同位素标记的内标物（isotopically coded internal standard)来实现进行分析之分析物的相对或绝对量化。此外，连续添加、 竞争性结合测定也可用来实现分析物的相对或绝对量化。
[0027] 在本公开内容的另一些方面中，还可考虑利用抗体浓缩来从样品溶液中收集分析 物的等量份。根据本公开内容的这些方面，将收集的等量份配置成与用于解析分析物之装 置的最佳检测范围相适应。
[0028] 根据本公开内容的另一形式，提供了利用多个正交分离维数来分析样品溶液中的 多种分析物的方法。根据本公开内容的这个方面，所述方法包括：向所述样品溶液中添加亲 和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物，并独立地隔离所述样品溶液 中的一种或更多种抗原和干扰物质；利用选择性吸附技术在第一或第二正交分离维数中除 去所隔离的一种或更多种抗原和干扰物质，而不论其顺序如何；提供第一分离方式，以使所 述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其他非分析物物质部分或完全分离；提供第二分离 方式，以使所述样品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析 所述分析物。
[0029] 根据本公开内容的另一个方面，提供了用于同时分析样品溶液中的分析物的方 法，所述方法包括：向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析 物的免疫复合物；通过提供第一色谱柱来将所形成的复合物与所述样品溶液中的其他未复 合物质分离；使所形成的复合物解离；通过第二色谱柱的表面吸附捕获所述分析物，以将 所述分析物与所述亲和选择剂分离；将所捕获的分析物转移至与所述第二色谱柱相联的第 三色谱柱；以及随着所捕获的抗原或其片段从所述第三色谱柱洗脱，对所述捕获的抗原或 其片段进行分析。
[0030] 根据本公开内容的某些方面，所述非复合物质包括不具有被所添加亲和选择剂靶 向的表位的物质。
[0031] 在本公开内容的另一些方面中，用于将样品溶液中形成的复合物与其他非复合物 质分离的色谱柱选自以下的至少一种：尺寸排阻色谱柱、填充有吸附剂的限进介质柱、配置 成靶向一般类别的所添加亲和选择剂的抗体柱、配置成靶向所有的所添加的亲和选择剂的 蛋白质A柱或G柱、具有与附着于一种或更多种所添加亲和选择剂上寡核苷酸互补之固定 DNA的DNA寡核苷酸柱、配置成靶向附着于一种或更多种所添加亲和选择剂上的生物素的 亲和素柱、以及配置成选择所添加亲和选择剂的天然存在或合成产生之特征的色谱柱。
[0032] 根据本公开内容的另一些方面，通过表面吸附捕获分析物的用于将分析物与亲和 选择剂分离的色谱柱选自以下的至少一种：反相色谱柱、限进介质柱、免疫吸附、固定化的 金属离子亲和色谱柱、离子交换柱以及色谱保留装置。
[0033] 根据本公开内容的某些方面，亲和选择剂包括但不限于：适配体、蛋白A、蛋白G、 噬菌体展示蛋白、天然受体、凝集素、DNA、RNA、合成亲和试剂或对分析物表现出亲和力以在 亲和捕获剂与分析物之间形成多种分子间复合物的一些其他物质。
[0034] 根据本公开内容的另一个方面，用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方 法包括：向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品 溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物之 间形成免疫复合物；在第一维分离中采用选择性吸附技术使所述样品溶液中的所形成的免 疫复合物与其他非分析物物质部分或完全分离；使所分离的免疫复合物解离；在第二维分 离中采用选择性吸附技术使解离的免疫复合物中的分析物与亲和选择剂彼此分离；以及根 据其质荷比来解析所述分析物。

【专利附图】

【附图说明】
[0035] 通过结合附图参照下文对本公开内容之一些实施方案的描述，本公开内容的上述 优点和其他优点以及得到这些优点的方式将变得显而易见，并且将更好地理解本公开内容 本身，其中：
[0036] 图1是示出根据本公开内容教导基于亲和选择剂与分析物复合而形成复合物从 而同时分析多种分析物的多维方案；
[0037] 图2是根据本公开内容教导的限进介质（restricted access media, RAM)颗粒；
[0038] 图3是根据本公开内容教导的半渗透表面（semipermeable surface, SPS)支持物 的图解；
[0039] 图4是根据本公开内容教导用于对由亲和选择剂从复合物样品基质中捕获的蛋 白质直接进行质谱（MS)分析的分析方案。
[0040] 图5是根据本公开内容教导的限进柱的图解，其中柱内部是亲水凝胶并且外部用 固定化胰蛋白酶包被；
[0041] 图6描述了据本公开内容教导的胰蛋白酶-RAM柱中涂层的合成；
[0042] 图7是根据本公开内容教导用于蛋白质质谱分析的分析方案，所述蛋白质通过亲 和选择剂从复合物样品基质中捕获，并且随后在进一步分析之前进行蛋白水解消化。
[0043] 图8是根据本公开内容教导的一种示例性阀系统，其允许向截流模式分析中的固 定化酶柱施加高压；
[0044] 图9是根据本公开内容教导用于对由多克隆抗体亲和选择剂捕获的半抗原和肽 进行分析之方案的图解；
[0045] 图10是根据本公开内容教导用于对由生物素化亲和选择剂捕获的半抗原和肽进 行分析之方案的图解；
[0046] 图11是根据本公开内容教导用于对由DNA、RNA或PNA亲和选择剂捕获的半抗原 和肽进行分析之方案的图解；
[0047] 图12是根据本公开内容教导基于分子大小用于对免疫复合物进行分级之方案的 图解；以及
[0048] 图13是根据本公开内容教导的仪器平台的液相色谱组件，其能够进行基于亲和 选择剂方法的高分辨率分析，用于同时分析多种分析物。
[0049] 发明详述
[0050] 下文描述的本公开内容的实施方案并不旨在穷举或将本公开内容限制在下文详 细描述所公开的精确形式。相反，对实施方案进行选择和描述使得本领域其他技术人员可 领会和理解本公开内容的原理和实践。
[0051] 如上所述，本公开内容总体上涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统。如将在 下文更详细解释的，本发明教导的一个区别特征是在第一维中与样品溶液中的分析物形成 大量分子间复合物，之后在第二维中进行某一类型分子间复合物的分离，这将产生用于在 第三维中进一步分级或化学反应的级分，之后在第三维中进行非常特异类型的分离或化学 反应的能力。在本发明教导的某些方面中，在第三维后可使用更高维的分析，并且尤其使得 在多维分析过程结束时，将有这样的情况：1)可将被检测的每种物质（分析物）单独地鉴 定和量化，或者2)可一起测定密切相关家族的分析物。
[0052] 现在转到图1，其示出了一种根据本公开内容的用于同时分析多种分析物的方案， 该方案基于亲和选择剂（S * )(例如抗体、适配体、凝集素、蛋白G、蛋白A、噬菌体展示蛋 白或结合蛋白）与分析物（A)在第一维分析中复合，形成复合物（S * :A)。虽然根据本公 开内容的某些方面，一般将特异性亲和选择剂用于每种分析物，但是在另一些方面中，也可 以有与多种分析物形成复合物的亲和选择剂，例如，可见靶向与许多糖蛋白偶联的LewisX 抗原的抗体。
[0053] 关于第一维（或"亲和选择维"），该维中的过程基于亲和选择剂（S * )与分析物 的复合作用。S上的符号（* )指明亲和选择剂或复合物之独特的结构特征，所述独特的结 构特征可在稍后较高维中用于对其进行选择。
[0054] 在该第一维中的分析物分析始于溶液中单一复合物的形成，如在下面的式1中所 述：
[0055]

【权利要求】
1. 一种用于同时分析样品溶液中之多种分析物的多维方法，所述方法包括： 向包含待测量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对所述样品溶液 中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力； 允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物； 在第一维分离中采用选择性吸附技术将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非 分析物物质部分或全部分离； 使所分离的免疫复合物解离； 在第二维分离中采用选择性吸附技术使所解离的免疫复合物中的所述分析物与所述 亲和选择剂彼此分离；以及 根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在柱、筒、移液器吸头、板或珠形式中进行所述第 一维分离。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中在变性的物质上进行所述第一维分离。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中通过还原和烷基化形成所述变性的物质。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中酶促修饰在所述第一维分离之前进行。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一维分离之后所述第二维分离之前进行 酶促消化。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、链霉蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多种其他酶进行所述酶促消化。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中在所述第二维分离之后第三维分离之前进行酶促 消化。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中使用胰蛋白酶、lys c、glu c、胃蛋白酶、木瓜蛋白 酶、链霉蛋白酶、PNG酶F、葡糖醛酸酶或多种其他酶进行所述酶促消化。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中串联使用两步酶促修饰，并在它们之间有分离步 骤。
11. 根据权利要求1所述的方法，其还包括基于离子化分子在载气中的迁移率使用离 子迁移分离器来分离在气相中的离子化分子。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二维分离包括以下的至少一种：根 据流体力学体积分离，用捕获抗体靶向独特的结构特征，用固定化的亲和素靶向生物素化 的特征，从疏水表面上吸附和差异洗脱，从带电表面上吸附和差异洗脱，从固定化的金属亲 和螯合剂上吸附和差异洗脱，以及从富含硼酸的表面上吸附和差异洗脱。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述独特的结构特征包括以下的至少一种：所 述亲和选择剂特有的天然结构特征、已与所述亲和选择剂缀合的半抗原和与所述亲和选择 剂缀合的免疫原。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括以下的至少一种：分析物片段、 分析物衍生物和分析物同素异构体。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括离子化的分析物。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和选择剂包括抗体和抗体片段中的至少 一种。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和选择剂包括以下的至少一种：适配体、 凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述细菌蛋白质包括以下的至少一种：G蛋白、 A蛋白以及由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一 种。
【文档编号】G01N33/68GK104160278SQ201380013470
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2012年2月2日
【发明者】弗雷德·E·雷尼尔, 尼古拉斯·B·赫罗尔德, 凯文·W·迈尔 申请人:珀菲尼迪生物科学股份有限公司