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有关联邦政府资助研究的声明
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发明领域
本公开内容涉及用于癌症检测和预后的方法。而且，本公开内容提供用于俘获和分离循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法包括可用于与受试者的癌症的预后、诊断或治疗有关的方法的CTC的鉴定、检测和任选计数。
发明背景
可根据形态学、行为和分子特征，将大多数后生动物细胞分为上皮的或间充质的。通过表型转换(一种称为上皮可塑性的过程)，上皮肿瘤细胞可变成间充质细胞，反之亦然。上皮细胞在顶端-基底方向通常是极性的，与在与极性垂直的平面上的相邻细胞附着在一起，并且在极性方向上是不动的。相比之下，间充质细胞没有极性，不与邻接细胞形成紧密的相互作用，并且是能动的。在成年动物中，上皮细胞和间充质细胞在一种状态或另一种状态下保持稳定；也就是说，上皮细胞不改变其性质和变成间充质细胞。然而，在发育期间，早期胚胎的上皮细胞产生所有3种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)，其包括间充质细胞(Hay, E.D.等, Am. J. Kidney Dis. 1995, 26, 678-690)。因此，这些早期胚细胞具有在上皮和间充质状态间转化的能力。胚胎显示进行上皮-间充质转化(EMT)以及间充质-上皮转化(MET) (Acloque, H.等, J. Clin. Invest.2009, 119, 1438-1449)。
上皮可塑性(EP)是指上皮细胞表型的可逆丧失，一种已知在癌转移期间发生的过程。在多项研究中该EP生物学与癌症转移风险和在EMT过程中间充质和/或干细胞性(stemness)性质的获得有关。EMT在癌症的多个临床前模型中与化学抗性、侵袭、内渗和扩散有关。导致上皮表型重新表达的MET过程，在发育和转移中也可能具有重大意义，并且在转移生态位中与肿瘤细胞的转移定居和存活有关。例如，在前列腺癌中，间充质生物标志物在前列腺癌细胞系、动物模型和患者肿瘤样本中在雄激素剥夺期间可上调。而且，这些生物标志物在睾酮替代时是可塑性恢复的，并且与转移倾向和化学抗性提高有关。间充质样肿瘤细胞可更好地促进局部肿瘤侵袭和内渗/外渗，但是上皮肿瘤细胞在转移生态位中对于最终的存活和增殖可能是必需的，说明了EP的双重性质在介导整个转移过程中的潜在关联性。
循环肿瘤细胞(CTC)，其是从原发性肿瘤中剥离并在血流中循环的细胞，在肿瘤学中具有潜在的预后、预测和替代意义。CTC可能构成其它肿瘤(转移)在不同组织中的后续生长的种子。因此，CTC的检测可对患有癌症(例如转移性前列腺癌和乳腺癌)的受试者的总体生存和治疗意义提供诊断和/或预后。任何患者样品(例如血样)中CTC的数目可能非常少，这会使得检测困难。目前用于检测CTC的方法基于上皮细胞粘附分子(EpCAM)表达的检测，所述上皮细胞粘附分子是与上皮细胞有关的生物标志物。然而，在转移过程中，循环肿瘤细胞(CTC)可能失去其上皮表型，并获得不足以被现有的基于上皮的CTC技术俘获的间充质表型。在转移期间，肿瘤细胞可作为一系列上皮至间充质表型存在。CTC可失去其上皮表型，并获得间充质表型，这可能不被现有的基于上皮的CTC技术俘获，因此在其中细胞的EpCAM表达降低或丧失的情况下(例如在包括EMT的生物过程中)，导致CTC的不足以检测。由于CTC可在患有癌症的患者的疾病诊断、监测和预后中起作用，因此本领域需要克服检测技术中的任何缺点。
最新证据表明，CELLSEARCH®和其它基于上皮的技术发现不了具有间充质表型的CTC。因此，需要不依赖现有俘获技术的俘获CTC的方法和系统，以及使CTC检测与癌症患者的疾病诊断、监测和预后关联的方法。
发明概述
一方面，本公开内容提供用于检测生物样品的循环肿瘤细胞(CTC)的方法，所述方法包括检测生物样品中的至少一种上皮间充质转化(EMT)生物标志物。
一方面，本公开内容提供用于检测生物样品中的循环肿瘤细胞(CTC)的试剂盒，该试剂盒包含至少一种EMT生物标志物的抗体和使用说明书。
一方面，本公开内容提供预测患有癌症的受试者对癌症疗程的响应性的方法，所述方法包括：测定至少一种EMT生物标志物表达的水平或存在以获得CTC的EMT生物标志物概况和/或任选基因表达模式；并根据EMT生物标志物概况和/或任选的基因表达模式预测受试者对癌症药物的响应性。在一些实施方案中，所述方法包括：测定受试者样品中至少一种EMT生物标志物表达的水平或存在以获得受试者的CTC中的生物标志物概况和任选基因表达模式；根据生物标志物概况和/或任选的基因表达模式鉴定癌症的类型，任选表征癌症的分期；并根据生物标志物模式、任选的基因表达模式、癌症类型或癌症分期的任一种预测受试者对癌症药物的响应性。这个方面的实施方案可包括使用应用于受试者样品中的至少一种EMT生物标志物，检测从血样俘获和计数的细胞数。表达EMT生物标志物的这些细胞从而使用EMT生物标志物俘获，然后可用于获得受试者的CTC中的基因表达模式；根据所获得的基因表达模式预测受试者对癌症药物的响应性，并检测这些CTC中其它生物标志物以助于指导该受试者的疗法。这些细胞还可用来测量特定EMT生物标志物或其它EMT生物标志物的水平。
一方面，本公开内容提供采用传统的基于EpCAM的俘获方法和基于EMT标志物的俘获方法两者评价CTC的数目的方法。这种基于EMT的俘获可代替或补充现有的CTC俘获技术。使用EMT抗原俘获的这些CTC的进一步俘获、计数和表征可进一步在患有癌症的受试者中靶向递送癌症药物，其包括根据这种EMT生物标志物的基因表达概况或存在将与对至少一种EMT生物标志物有特异性的抗体连接的癌症药物或特效药给予受试者。
一方面，本公开内容提供评估癌症受试者的预后以及允许可预测治疗响应性的CTC的进一步表征的方法，所述方法包括：测定受试者样品中的至少一种EMT生物标志物的表达的水平或存在以测定受试者中的CTC的数目并获得受试者的基因表达模式；根据所获得的基因表达或生物标志物概况模式提供受试者的预后。
一方面，本公开内容提供用于监测进行治疗性治疗的受试者的癌症进展的方法，所述方法包括检测至少一种EMT生物标志物的表达的水平或表达的存在，在第一时间和第二时间取自受试者的血样中使用该方法量化所俘获的CTC；比较第一表达水平和第二表达水平；其中在第一样品和第二样品中至少一种EMT生物标志物的表达水平随时间推移的检出差异表明癌症进展状态的变化。
一方面，本公开内容提供用于检测受试者的癌症的方法，所述方法包括测定与正常样品或对照样品相比受试者样品中表达至少一种EMT生物标志物的CTC的存在，其中至少一种EMT生物标志物的水平提高表明受试者中存在癌症进展或转移扩散。
一方面，本公开内容提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将与特异性结合至少一种EMT生物标志物的抗体连接的癌症药物给予受试者。
本公开内容涉及用于从患者中分离、俘获或富集循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；并通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离、俘获或富集循环肿瘤细胞。所述方法可进一步包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞可具有间充质表型。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及用于测定或鉴定患者的循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而测定或鉴定循环肿瘤细胞。所述方法可进一步包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞可具有间充质表型。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。本公开内容涉及用于从患者中分离或俘获完整细胞的方法，其中细胞为β-联蛋白阳性、DAPI阳性和CD45阴性，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合完整细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-完整细胞复合体的一段时间；并且通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-完整细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞。完整细胞可具有间充质表型。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及测定和治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较，检测受试者的癌症，如果循环肿瘤细胞的水平高于循环肿瘤细胞的参比水平，则在受试者中检出癌症，并将抗癌疗法给予鉴定为患有癌症的受试者。测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及监测进行治疗性治疗的受试者的癌症进展的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；使循环肿瘤细胞的水平与受试者的癌症进展关联，其中如果与来自受试者的较早生物样品中的循环肿瘤细胞的水平相比循环肿瘤细胞的水平较高，则受试者鉴定为显示癌症进展；将抗癌疗法给予鉴定为显示癌症进展的受试者。测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及测定受试者的癌症预后的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；并通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较，测定受试者的癌症预后，其中如果循环肿瘤细胞的水平高于循环肿瘤细胞的参比水平，则受试者鉴定为患有癌症，将抗癌疗法给予鉴定为患有癌症的受试者。测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及预测患有癌症的受试者对疗程的响应性的方法，所述方法包括：从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；并通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较。测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平包括证实循环肿瘤细胞。证实循环肿瘤细胞包括DAPI染色、β-联蛋白检测、CD45检测和CD31检测的至少一种。如果DAPI染色为阳性、β-联蛋白表达为阳性、CD45表达为阴性、CD31表达为阴性，则可证实循环肿瘤细胞。EMT生物标志物可以是OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。患者可患有癌症。所述癌症可包括以下至少一种：乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。所述方法可进一步包括测定至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可选自雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。测定步骤可通过荧光原位杂交(FISH)进行。生物样品可包括来自生物体的组织样品或流体样品。生物样品可包括血液。俘获结合蛋白可以是抗体。固相可以是微粒。微粒可为磁性的或顺磁性的。
本公开内容涉及用于分离或俘获生物样品中的循环肿瘤细胞的试剂盒，试剂盒包含与磁性颗粒连接的抗体，其中抗体与至少一种EMT生物标志物和至少一种染色试剂特异性结合。至少一种EMT生物标志物可包括OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133的至少一种。至少一种染色试剂可包括藻红蛋白标记的抗β-联蛋白抗体和别藻蓝蛋白标记的抗CD45抗体的至少一种。
考虑详细描述和附图，本公开内容的其它方面和实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1. (A)表示FGFR2的IIIb和IIIc可变剪接同种型的图示。(B)是pRIIIcl2小基因和荧光读出的示图。(C)是报道基因(上部分)和内源FGFR2 (下部分)的RT-PCR分析。(D)是克隆AT3-M和AT3-T的落射荧光和相衬照片。
图2. (A)表示在用来自克隆AT3-T的条件培养基处理时由AT3-M细胞形成的DsRED阳性细胞簇的实例。(B)表示相同实验的流式细胞术分析。
图3. (A)表示克隆AT3-T和AT3-M的生长曲线。(B)是AT3-M、AT3-T和DT细胞在软琼脂中生长的示图。(C)表示注射AT3-M或AT3-T细胞的大鼠的处死曲线(sacrifice curve)。(D)表示由AT3-T和AT3-M注射引起的肿瘤体积的比较。
图4. (A)表示在用Gint和pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3-M肿瘤的周边表达RFP和GFP两者的细胞的代表性实例。(B)来自用GFP和pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3-T肿瘤的切片的代表性实例。
图5表示在用Gint和pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3-M肿瘤周边表达RFP和GFP两者的细胞的代表性实例。
图6. (A)表示刮伤测定法(scratch-wound assay)的细胞的代表性照片。(B)迁移的量化。(C)使用基质胶包覆膜的侵袭测定法。(D)侵袭测定法结果的量化。
图7是带有来自AT3-T或AT3-M克隆(用GFP和pRIIIcI2报道基因稳定转染)的肿瘤的动物肺中的转移灶。(A) (上部分)是显示转移灶中克隆AT3-T的模式(即GFP+，DsRED+)的切片的实例，(下部分)是显示转移灶中克隆AT3-T的可塑模式(即GFP+，DsRED-)的切片的实例。(B) (上部分)是显示转移灶中克隆AT3-M的模式(即GFP+，DsRED-)的切片的实例，(下部分)是显示转移灶中克隆AT3-M的可塑模式(即GFP+，DsRED+)的切片的实例。
图8A表示切成两半并针对CD133 (上部分)或β-肌动蛋白(下部分)进行免疫印迹法的含连续两倍稀释的全细胞裂解物的膜。(B)切成两半并针对CD44 (上部分)或β-肌动蛋白(下部分)进行免疫印迹法的含连续两倍稀释的全细胞裂解物的膜。
图9表示比较干细胞样特征和上皮间充质表型的模型。
图10表示来自前列腺腺癌患者的CTC。(A)说明来自人外周血单核细胞(PMBC)样品中的白细胞的实例：CD45 (+)、CK (-)和波形蛋白(+)。(B)说明来自转移性乳腺癌患者的CD45 (-)、CK (+)和波形蛋白(-)细胞的实例。(C)说明来自转移性乳腺癌患者(mBC)的CD45 (-)、CK (+)、波形蛋白(+)的实例。(D)说明来自转移性进行性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者的CD45 (-)、CK (+)、波形蛋白(+)的实例。
图11表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图12表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图13表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图14表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图15表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图16表示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像。
图17表示在使用抗N-钙黏着蛋白或抗OB-钙黏着蛋白铁磁流体富集后，通过存在β-联蛋白表达和缺乏CD45表达将间充质CTC与白细胞区分开来。
图18表示A行和D行中的对照细胞(与外周血单核细胞混合的PC-3细胞)和B行、C行和E行中患者来源的EpCAM-俘获细胞的免疫荧光图像。针对CD45和细胞角蛋白将细胞染色，并通过β-联蛋白或OB-钙黏着蛋白表达进一步表征。各栏表示相差显微术与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、CD45与DAPI、细胞角蛋白(CK)与DAPI和β-联蛋白(beta-cat)或OB-钙黏着蛋白(OB-CAD)与DAPI。A行显示缺乏β-联蛋白的CD45阳性对照细胞和表达β-联蛋白的CK阳性对照细胞。B行显示来自患有具有CK和β-联蛋白表达两者的前列腺癌的男性的CTC，而C行显示具有β-联蛋白表达的CD45阴性、CK阴性患者细胞。D行说明缺乏OB-钙黏着蛋白的CD45阳性对照细胞和表达OB-钙黏着蛋白的CK阳性对照细胞，E行显示具有CK和OB-钙黏着蛋白表达两者的CTC。
图19表示来自患有去势抵抗性前列腺癌的男性的EpCAM-俘获CTC中β-联蛋白表达的实例。
图20表示(A)根据CD31状态来自健康志愿者的OB-钙黏着蛋白俘获的β-联蛋白阳性事件的分布。其中评价CD31的所有样品为CD31阳性；和(B)在健康志愿者中检出的CD31+细胞事件的实例。
图21表示使用N-钙黏着蛋白、OB-钙黏着蛋白或EpCAM铁磁流体自健康志愿者和CRPC患者中俘获的事件。
图22表示来自患有转移性去势抵抗性前列腺癌的男性的OB-钙黏着蛋白俘获的β-联蛋白阳性细胞事件的实例。顶行显示大部分为CD31阳性的单细胞，并可表示内皮细胞，而底行显示可表示间充质肿瘤细胞的CD31阴性细胞块。
图23表示(A)针对OB-钙黏着蛋白(绿色)和DAPI/核(蓝色)染色的PC-3细胞的免疫荧光图像，说明PC-3细胞对于OB-钙黏着蛋白表达是略微异质的；和(B)基于OB-钙黏着蛋白表达的PC-3细胞的荧光激活细胞分选法显示约50%的细胞表达OB-钙黏着蛋白。
图24表示产生于患有转移性去势抵抗性前列腺癌的代表性患者的免疫染色和荧光原位杂交(FISH)。A栏和B栏—用OB-钙黏着蛋白俘获和用β-联蛋白染色的循环细胞显示与用来自同一患者的EpCAM俘获和用细胞角蛋白染色的CTC相同的多基因FISH模式。雄激素受体(AR) FISH显示额外的雄激素受体基因拷贝。对于ERG中断FISH，黄色箭头指示失去5’ Erg信号，这表明TMPRSS2:ERG融合。PTEN FISH显示PTEN基因的纯合子缺失。C栏—来自同一患者的白细胞显示具有1个AR信号、无ERG重排和2拷贝PTEN的正常FISH模式的细胞角蛋白阴性细胞。
发明详述
在详细描述任何实施方案之前，要了解，权利要求书不限于下面的描述中阐明的或所包括的附图中说明的组成的详情和组分的排列。
除非另有定义，否则本文所用所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下面描述了优选的方法和材料，虽然类似或等同于本文所述方法与材料的方法与材料可用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料均通过引用以其整体结合到本文中。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的，无意是限制性的。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“怀有”、“能够”、“含有”及其变体欲为开放式过渡性短语、术语或措词，不排除其它行动或结构的可能性。单数形式“a”、“and”和“the”包括复数对象，除非文中另有明确规定。不论是否明确阐述，本公开内容还考虑 “包括”本文呈现的实施方案或要素、“由”和“基本由”本文呈现的实施方案或要素“组成”的其它实施方案。
按照一般含义，本公开内容提供已鉴定为与循环肿瘤细胞(CTC)有关的生物标志物。如本文所述，上皮间充质转化(EMT)的一种或多种生物标志物在患有常见的上皮性恶性肿瘤的患者的CTC中是可检出的。这些移行细胞常常显示干细胞样特性(干细胞性)和/或可塑性。此外，本公开内容提供转移倾向和上皮表型改变与FGFR2基因的可变剪接有关的描述。本公开内容还提供移行细胞存在于癌症患者中，其中许多CTC共表达的生物标志物与上皮细胞和间充质细胞有关，如在非限制性实例中所述。
因此，如下所述，EMT生物标志物表达可用来检测和定量测定生物样品中的CTC。因此，包括检测EMT生物标志物表达或检测CTC或其组合的方法，可有来评价癌症预后、肿瘤侵袭、转移风险或肿瘤分期。本领域技术人员应认识到，按照本文所述方法，用于评价EMT生物标志物表达的任何合适的方法都可用于评价EMT生物标志物表达，包括但不限于用抗体检测、实时RT-PCR、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析和流式细胞术。
本公开内容还描述了基于上皮可塑性的生物学和基于间充质标志物(例如N-钙黏着蛋白或OB-钙黏着蛋白)细胞表面表达分离细胞的CTC俘获方法的发展。在晚期乳腺癌和前列腺癌患者中，在通过基于EpCAM的铁磁俘获分离和共表达细胞角蛋白(其在上皮细胞中表达)的CTC中，可检出包括OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白和波形蛋白在内的EP生物标志物。同样，表达间充质标志物twist和波形蛋白的CTC很少在早期乳腺癌患者中鉴定出，但在大部分转移性乳腺癌患者中鉴定出，表明了向间充质表型的转化对于转移可能是重要的。此外，最近对具有间充质表型的CTC的连续监测(如通过RNA荧光原位杂交(FISH)所限定的)表明在间充质CTC和患有乳腺癌的女性的疾病进展之间可能有相关性。
如本文所述，在患有转移性去势抵抗性前列腺癌(CRPC)和乳腺癌(BC)的患者中，使用上皮细胞粘附分子(EpCAM)铁磁俘获分离的CTC，表达的间充质标志物(包括N-和OB-钙黏着蛋白)，表明表型可塑性和EMT的存在。本文所述CTC俘获方法包括基于间充质的测定法。该测定法测出的OB-钙黏着蛋白细胞事件存在于患有转移性前列腺癌的男性中，但在健康个体中不太普遍。该方法可补充现有的基于上皮的方法，并且可能用于患有骨转移的患者中。
定义
本文所用“抗体”是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体(完全或部分人源化)、动物抗体(例如但不限于鸟(例如鸭或鹅)、鲨鱼、鲸和哺乳动物，包括非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等)或非人灵长类动物(例如猴、黑猩猩等))、重组抗体、嵌合抗体、单链Fv (“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv (“sdFv”)和抗独特型(“抗Id”)抗体、双重结构域抗体、双重可变结构域(DVD)或三重可变结构域(TVD)抗体(双重可变结构域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu, C.等, Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007)和PCT国际申请WO 2001/058956中，其每一个的内容通过引用结合到本文中)和上述任一种的功能活性表位结合片段。具体地说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有分析物结合部位的分子。免疫球蛋白分子可为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。为简要起见，针对分析物的抗体在本文通常为“抗分析物抗体”或只是“分析物抗体”。
本文所用“抗体片段”是指完整抗体的一部分，其包含抗原结合部位或可变区。该部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3或CH4，这取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体(diabodies)、单链Fv (scFv)分子、只含一个轻链可变结构域的单链多肽、含有轻链可变结构域的3个CDR的单链多肽、只含一个重链可变区的单链多肽和含有重链可变区的3个CDR的单链多肽。本文所用术语“给药”或“给予”是指通过任何合适的途径提供、接触和/或递送癌症治疗以实现所需作用。可以多种方式将癌症治疗给予受试者，包括但不限于口服、眼、鼻、静脉内、局部、作为气雾剂、栓剂等，并且可组合使用。
本文使用“结合蛋白”是指与结合配偶体结合并形成复合体的单体或多聚体蛋白质，例如多肽、抗原、化合物或其它分子或任何种类的底物。结合蛋白特异性地结合结合配偶体。结合蛋白包括抗体及其抗原结合片段和本领域已知和下文描述的其它不同形式及其衍生物，以及包含与抗原分子或抗原分子的特定部位(表位)结合的一个或多个抗原结合结构域的其它分子。因此，结合蛋白包括但不限于抗体、四聚免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、亲和力成熟抗体和保持与抗原结合的能力的任何这类抗体的片段。
本文所用术语“生物标志物”是指任何可定量的对特定的生理病况(例如癌症)是独特的生物组分。生物标志物可以是基因、由所述基因转录的mRNA或由所述mRNA翻译的蛋白质。生物标志物水平相对于对照(例如个体、个体组或人群)或备选相对于癌症受试者的可测量的提高或降低，可提供特定生理病况的诊断。
本文所用“乳腺癌”是指起源于乳腺并在乳腺中发展的癌症类型。
本文所用“癌症”是指机体内异常细胞不受控制和不受调节的生长。癌细胞亦称恶性肿瘤细胞。癌症可侵入机体的附近部位，还可通过淋巴系统或血流扩散到机体更远的部位。癌症包括肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、类癌瘤、未明原因原发性胃肠癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因家族肿瘤(PNET)、颅外生殖细胞瘤、眼内黑素瘤眼癌、胆囊癌、胃癌、性腺外生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性成淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、毛细胞性白血病、唇与口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、霍奇金病淋巴瘤、非霍奇金病淋巴瘤、恶性间皮瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌、伴隐匿性原发的多发性骨髓瘤和其它浆细胞瘤的颈部转移性鳞状细胞癌、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性病症、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、外分泌性胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦与鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、浆细胞瘤、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂与输尿管移行细胞癌、唾腺癌、塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、睾丸癌、恶性胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、不常见儿童癌症、阴道癌、外阴癌和维尔姆斯瘤(Wilms' Tumor)。
在本文可互换使用的“循环肿瘤细胞”、“CTC”和“CTCs”是指从原发性肿瘤脱落到血管系统并在血流中循环的细胞。CTC被视为其它肿瘤(转移)在重要的远端器官中后续生长的种子，触发负责绝大多数癌症相关死亡的机制。
“组分”、“多种组分”或“至少一种组分”一般是指按照本文所述方法和本领域已知的其它方法，可包括在用于试验样品(例如患者尿液、血清或血浆样品)测定的试剂盒中的俘获抗体、检测物或缀合物、校准物、对照、灵敏度板(sensitivity panel)、容器、缓冲剂、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、终止溶液等。一些组分可为溶液或被冻干用于在测定时复溶使用。
本文所用术语“有效剂量”意指在为持续实现所需治疗结果所需的一段时间内有效的药物的剂量。有效剂量可由本领域技术人员确定，并且可随例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素及药物在个体中引起所需反应的能力而变化。
本文所用的“上皮”和“上皮表型”是指由被非常少的胞间物质分隔的一层或多层细胞组成并形成机体及其器官的大多数内和外表面的覆盖层的膜组织。
本文所用“标记”和“可检测标记”是指与抗体或分析物连接以使抗体和分析物之间的反应可检出的部分，如此标记的抗体或分析物称为“可检测标记的”。标记可产生通过视觉或仪器装置可检测的信号。各种标记包括信号产生物质，例如色原、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等。标记的代表性实例包括产生光的部分(例如吖啶化合物)和产生荧光的部分(例如荧光素)。本文描述了其它标记。在这一方面，部分本身可以不是可检测的，但在与另一部分反应时可变成可检测的。术语“可检测标记的”的使用意欲包括这类标记。
可以使用本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，可检测标记可以是放射性标记(例如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(例如吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺(luminol)、异鲁米诺、菲啶酯等)、荧光标记(例如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如硫化锌帽化的硒化镉)、温度标记或免疫-聚合酶链式反应标记。标记的引入、标记程序和标记的检测参见Polak和Van, Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 第2版, Springer Verlag, N.Y. (1997)，以及载于Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)，这是由Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon出版的综合手册和目录。荧光标记可用于FPIA (参见例如美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其通过引用以其整体结合到本文中)。吖啶化合物可在均相化学发光测定法中用作可检测标记(参见例如Adamczyk等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006)；Adamczyk等, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004)；Adamczyk等, Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004)；以及Adamczyk等, Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003))。
本文可互换使用的“间充质”和“间充质表型”是指可发育成淋巴和循环系统的组织和整个机体的结缔组织(例如骨和软骨)的未分化疏松结缔组织的类型。间充质表型在形态上可表征为含有网状原纤维和非特化细胞的疏松聚集体的主要基础物质基质。间充质细胞可容易地迁移，这与上皮细胞不同，其缺乏运动性并组成紧密附着层，形状是多角形的，并且在顶端-基底方向上是极化的。
本文可互换使用的“间充质表型CTC”和“间充质CTC”是指具有间充质表型的CTC。
本文所用术语“正常对照”或“健康对照”意指取自未患癌症或没有发生癌症的风险的受试者或实际受试者的样品或样本。
本文所用术语“正常受试者”意指健康受试者，即没有癌症的临床征象或症状的受试者。针对另外的未检出的癌症征象或症状对正常受试者进行了临床评价，所述评价可包括例行身体检查和/或实验室检验。
本文所用术语“预定截断值”和“预定水平”意指用于通过比较测定结果和预定截断值/水平来评价诊断、预后或治疗功效结果的测定截断值，其中预定截断值/水平已与不同的临床参数(例如疾病的存在、疾病的分期、疾病的严重性、疾病的进展、无进展或改善等)有关或关联。本公开内容提供示例性的预定水平。然而，众所周知，截断值可随免疫测定法的性质(例如所用的抗体、反应条件、样品纯度等)而变化。修改本文的公开内容用于其它免疫测定法以获得免疫测定法特有的截断值用于基于本公开内容提供的描述的其它免疫测定法，也尽在本领域普通技术人员的掌握中。虽然预定截断值/水平的精确值在测定法之间可变化，但是本文所述的相关性一般应是适用的。
用于本文所述诊断测定法的“预处理试剂” (例如溶解、沉淀和/或增溶试剂)是溶解存在于试验样品中的任何细胞和/或增溶存在于试验样品中的任何分析物的试剂。预处理不是所有样品所必需的，如本文的进一步描述。预处理试剂可以是同质的(不需要分离步骤)或异质的(需要分离步骤)。在使用异质预处理试剂时，在进行下一步测定之前，要从试验样品除去任何沉淀的分析物结合蛋白。预处理试剂任选可包含：(a)一种或多种溶剂和盐，(b)一种或多种溶剂、盐和去污剂，(c)去污剂，(d)去污剂和盐，或(e)适于细胞溶解和/或分析物增溶的任何试剂或试剂的组合。
本文所用“前列腺癌”是指发生在前列腺中的癌症类型。前列腺癌可以是慢慢生长的或侵略性的，其中癌细胞从前列腺转移到身体的其它部位，特别是骨和淋巴结。“转移性前列腺癌”是指扩散到前列腺以外到达淋巴结、骨或其它部位的前列腺癌。“去势抵抗性前列腺癌”是指尽管雄激素剥夺疗法但前列腺癌疾病仍发展，其表现为以下之一或其任何组合：前列腺特异性抗原血清水平持续上升、之前存在的疾病进展或新转移的出现。
“质量控制试剂”在本文所述免疫测定法和试剂盒的情况下包括但不限于校准物、对照和灵敏度板。通常使用(例如一种或多种，例如众多) “校准物”或“标准品”以建立校准(标准)曲线用于内推分析物(例如抗体或分析物)的浓度。或者，可使用接近预定的阳性/阴性截断值的单一校准物。可结合使用多个校准物(即一种以上校准物或不同量的校准物)以包括“灵敏度板”。
本文所用术语“参比活性水平”或“参比”意指样品组中用作参比的生物标志物的活性水平，针对所述参比以评价个体或样品组中的活性水平。
本文可互换使用的术语“风险评价”、“风险分类”、“风险鉴定”或“风险分层”意指评价包括生物标志物在内的因素，以预测未来事件包括疾病发作或疾病进展的发生风险，使得可在了解更多情况的基础上做出有关受试者的治疗决定。
本文可互换使用的术语“样品”、“试验样品”、“样本”、“生物样品”、“来自受试者的样品”或“受试者样品”意指血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品或分离物，可按从受试者中获得的直接使用，或可预处理，例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、灭活干扰组分、添加试剂等，以按本文所述的或本领域另外已知的某种方式改进样品的品质。
该术语还意指待测试的含有目标分析物和/或疑似含有目标分析物的任何生物材料。样品可以是取自或来源于受试者的任何组织样品。在一些实施方案中，来自受试者的样品可包含蛋白质。可使用任何细胞类型、组织或体液获得样品。所述细胞类型、组织和体液可包括组织(例如活检和尸检样品)的切片、为组织学目的所取的冷冻切片、血液(例如全血)、血浆、血清、痰、大便、眼泪、粘液、唾液、毛发、皮肤、红细胞、血小板、间质液、眼晶状体液、脑脊液、汗液、鼻液、滑液、月经、羊水、精液等。细胞类型和组织还可包括淋巴液、腹水、妇产科液体、尿液、腹膜液、脑脊液、通过阴道清洗收集的流体或通过阴道冲洗收集的流体。组织或细胞类型可通过从动物中取出细胞样品来提供，但是也可通过使用之前分离的细胞(例如通过另一个人、在另一时间和/或用于另一目的而分离)实现。还可使用归档组织，例如具有治疗史或结局史的归档组织。蛋白质或核苷酸分离和/或纯化不是必需的。
将用于收集、处理和加工尿液、血液、血清和血浆和其它体液的本领域众所周知的方法用于本公开内容的实践中。除目标分析物以外，试验样品可包含其它的部分，例如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白质、肽、多肽、寡核苷酸或多核苷酸。例如，样品可以是获自受试者的全血样品。在本文所述的免疫测定法之前，试验样品，特别是全血例如用预处理试剂处理可能是必需的或是合乎需要的。即使在其中预处理不是必需的情况下(例如大多数尿液样品、预处理的归档样品等)，样品的预处理是仅出于便利而进行的一个选择(例如作为商品化平台上的方案的一部分)。样品可按从受试者获得的直接使用或在预处理后使用以改进样品的性质。预处理可包括提取、浓缩、灭活干扰组分和/或添加试剂。
“固相”是指是不溶解或可通过后续反应使之不溶解的任何材料。可针对其吸引和固定俘获剂的固有能力选择固相。或者，可将固相与具有吸引和固定俘获剂的能力的连接剂连接。例如，连接剂可包括带电荷的物质，其带有相对于俘获剂本身或与俘获剂缀合的带电荷物质是相反的电荷。一般而言，连接剂可以是固定(连接)至固相且具有通过结合反应固定俘获剂的能力的任何结合配偶体(优选特异性的)。连接剂能够在进行测定前或在进行测定期间使俘获剂与固相材料间接结合。例如，固相可以是塑料、衍生塑料、磁性金属、顺磁性金属或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、片层、珠粒、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其它构造。
本文所用“特异性结合”或“特异性地结合”可以是指抗体、蛋白质或肽与第二化学物类的相互作用，其中相互作用取决于化学物类上特殊结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而非普通蛋白质。如果抗体对表位“A”有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A (或游离的、未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。
本文可互换使用的术语“受试者”、“患者”或“方法中的受试者”意指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，例如食蟹猴或猕猴，黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，所述受试者或受试者可以是人或非人。在一些实施方案中，受试者可以是有发生癌症风险或已患有癌症的人类受试者。
“治疗”、“医治”或“医疗”各自在本文可互换使用以描述逆转、缓解或抑制疾病(例如癌症)的进展或该术语适用的所述疾病的一个或多个症状。根据受试者的状况，该术语还是指预防疾病，包括预防疾病的发生或预防与疾病相关的症状。治疗可以急救或长期方式进行。该术语还是指在患有疾病之前减轻疾病或与这类疾病有关的症状的严重性。在患病之前疾病严重性的这类防止或减轻是指不在患有疾病的给药时间将本发明的抗体或药物组合物给予受试者。“预防”还指预防疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状的复发。“治疗”和“治疗上地”是指治疗行动，“治疗”如上定义。
如本文所述，细胞在上皮样和间充质样状态之间容易转化(表型可塑性)的能力是恶性肿瘤比最终状态的性质更适合的相关决定因素。虽然这些上皮转化是表型的，但是基因型可决定癌细胞间的转化倾向(可塑性)。大部分可塑细胞可占据具有上皮和间充质两者的性质的转化中间状态，且这些移行细胞可能是特别恶性的。可以在以下中检出这类细胞：(1)其中癌细胞具有混合组织学的肿瘤，其实际上已被观察到，并且已归类为高度侵略性的(例如上皮源的纯系肉瘤癌，其显示极端的侵略行为，例如肉瘤样肾细胞癌和前列腺癌肉瘤)；和(2)共表达本文所述的上皮和间充质标志物的癌细胞。
本公开内容，如实施例中的非限制实施方案说明的一样，提供用于具有中间表型—表达FGFR2的上皮和间充质同种型、具有上皮样形态和基因表达模式、同时还显示间充质细胞样迁移、肿瘤形成和转移的细胞的鉴定。在实施方案中，在患有晚期癌症、转移性腺癌和转移性乳腺癌和前列腺癌的患者中鉴定出这些细胞。在一些实施方案中，细胞包含CTC。在一些实施方案中，CTC共表达生物标志物，包括例如EpCAM、细胞角蛋白和波形蛋白，其把细胞鉴定为上皮样和间充质样两者。在一些实施方案中，中间表型状态中的这些CTC通过检测EMT生物标志物来鉴定，并提供癌症恶性的状态和/或程度的诊断和/或预后。
一方面，本公开内容提供用于检测生物样品中CTC的方法，所述方法包括检测生物样品中的至少一种EMT生物标志物。在一些实施方案中，例如实施例中所述，EMT的生物标志物存在于患有常见上皮性恶性肿瘤的患者的CTC上。在一些实施方案中，采用包括FGFR2基因可变剪接变体的检测和鉴定的方法将转移倾向与CTC中的上皮表型关联。
因此，可利用EMT生物标志物表达来检测CTC。EMT生物标志物表达或CTC的检测或其组合可用来评价癌症预后、肿瘤侵袭、转移风险或肿瘤分期。如上所述，本文所述方法可包括用于评价EMT生物标志物表达的任何合适的方法，包括但不限于用抗体检测、实时RT-PCR、RNA印迹分析、磁性颗粒(例如微粒或纳米粒)、蛋白质印迹分析和涉及流式细胞术的任何方法或系统。在一些实施方案中，所述方法和EMT生物标志物可用于市购可获得的系统中，例如已被管理机构(例如FDA)批准的系统，包括例如CELLSEARCH®技术(Veridex LLC)。因此，所述方法可并入本领域已知的标准方案中。例如，包括CELLSEARCH®技术的实施方案可包括检测EMT生物标志物的存在，使之关联以量化生物样品(例如从需要转移性乳腺癌的新的治疗方案的女性或需要mCRPC治疗的男性采集的血液)中循环肿瘤细胞(CTC)的数目。典型方案可包括抽取可在任何特定时间(适宜在当患者开始新的疗法时，然后再次以3-4周间隔)可采集的约15 mL的血样大小。CTC的数目可与疾病反应或进展关联，如通过每9-12周进行的标准放射学研究(例如CT扫描)测定。
一方面，本公开内容涉及用于检测生物样品的循环肿瘤细胞(CTC)的方法，其中所述方法包括检测生物样品中的至少一种EMT生物标志物。如上所述，生物样品可来自生物体的任何组织或流体。在一些实施方案中，生物样品来自是生物体的淋巴系统或循环系统的一部分或与之有关的体液或组织。在一些实施方案中，生物样品是血样。
用于本文所述方法的EMT和细胞可塑性生物标志物与循环肿瘤细胞(CTC)有关。因此，在各个实施方案中，所述方法包括检测一种或多种EMT生物标志物的存在，并使该检测与CTC的存在关联，任选定量测定样品中的CTC的数目。如上所述，EMT生物标志物可包括与显示细胞的可塑性特性(例如表型或表面抗原或基因表达概况等)、干细胞样性质、侵袭和/或化学抗性的移行细胞有关的任何可检测生物分子。在一些非限制性的实施方案中，EMT生物标志物包括波形蛋白、N-钙黏着蛋白、O-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型(例如包括或不包括外显子IIIc或外显子IIIb的FGFR2)或CD133的任一种或其两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，EMT生物标志物可包括以下的一种或多种：波形蛋白(由多核苷酸SEQ ID NO: 13编码的多肽SEQ ID NO: 14)、N-钙黏着蛋白(由多核苷酸SEQ ID NO: 1编码的多肽SEQ ID NO: 2；由多核苷酸SEQ ID NO: 15编码的多肽SEQ ID NO: 16)、O-钙黏着蛋白(由多核苷酸SEQ ID NO: 3编码的多肽SEQ ID NO: 4；由多核苷酸SEQ ID NO: 17编码的多肽SEQ ID NO: 18)、E-钙黏着蛋白(由多核苷酸SEQ ID NO: 11编码的多肽SEQ ID NO: 12；由多核苷酸SEQ ID NO: 23编码的多肽SEQ ID NO: 24)、FGFR2 (由多核苷酸SEQ ID NO: 7编码的多肽SEQ ID NO: 8；由多核苷酸SEQ ID NO: 9编码的多肽SEQ ID NO: 10；由多核苷酸SEQ ID NO: 21编码的多肽SEQ ID NO: 22)和CD133 (由多核苷酸SEQ ID NO: 5编码的多肽SEQ ID NO: 6；由多核苷酸SEQ ID NO: 19编码的多肽SEQ ID NO: 20)。在一些实施方案中，EMT生物标志物可包括以下的一种或多种：N-钙黏着蛋白，例如人N-钙黏着蛋白(例如SEQ ID NO: 16，CCDS ID No: CCDS11891.1)；O-钙黏着蛋白，例如人O-钙黏着蛋白(例如SEQ ID NO: 18，CCDS ID No: CCDS10803.0)；E-钙黏着蛋白，例如人E-钙黏着蛋白(例如SEQ ID NO: 24，CCDS ID No: CCDS10869.1)；CD133，例如人CD133 (例如SEQ ID NO: 20，CCDS ID No: CCDS47029.1)；FGFR2，例如人FGFR2 (例如SEQ ID NO: 22，CCDS ID No: CCDS31298.1)；和波形蛋白，例如人波形蛋白(例如SEQ ID NO: 14，登录号BC000163)。本领域技术人员应了解，当在上面的实施方案以及全文的实施方案中提及编码多肽的多核苷酸时，可按RNA (例如mRNA)或DNA (例如cDNA)公开多核苷酸。
EMT生物标志物可与任何生物体(直向同源物(ortholog))有关，在某些实施方案中是与人有关的EMT生物标志物。EMT生物标志物的任何部分或整体可在本文所述方法中用于检测例如结合抗体的EMT生物标志物蛋白质的表位或EMT生物标志物的核酸序列，一种与报道基因核酸探针或引物互补的表达或转录的mRNA分子。在一些实施方案中，所述方法提供检测至少两种EMT生物标志物的表达。在某些实施方案中，检出波形蛋白和E-钙黏着蛋白的表达。在某些实施方案中，检出N-钙黏着蛋白和O-钙黏着蛋白的表达。该测量可单独使用或与检测CTC的另一种方法联用。在某些实施方案中，可作为与CELLSEARCH®循环肿瘤细胞检测(如上所述)联合的补充方法使用本文所述方法。因此，实施方案提供一种方法，作为可用来检测和任选定量测定样品中的CTC的二重或补充检测系统的一部分(例如包括检测EpCAM和至少一种EMT生物标志物)。至少一种EMT生物标志物的表达可用来分离CTC。可采用将生物标志物的检测与细胞(例如CTC)关联的任何已知方法，使用至少一种EMT生物标志物的表达来计数或提供CTC的相对数目或相对量。可在转移时、在转移前或在转移后检测CTC。
癌症可包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌、脑癌、皮肤癌、直肠癌、胃癌、食管癌、肉瘤、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、淋巴癌、宫颈癌、外阴癌、黑素瘤、间皮瘤、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、骨癌、癌、肉瘤和软组织癌。因此，本公开内容一般适于其中发生EMT生物标志物表达的任何癌症类型。在某些实施方案中，癌症是恶性实体瘤。在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、结肠癌或前列腺癌。
至少一种EMT生物标志物的表达可采用本领域已知的任何合适的方法检测，包括但不限于与抗体或其片段结合、与成像剂连接或缔合的抗体、表达报道基因质粒、流式细胞术和任何合适的阵列扫描仪技术。抗体或其片段可适宜地识别特定的胞内蛋白质、蛋白质同种型或蛋白质构型。
本文所用“成像剂”或“报道分子”是提高所递送的细胞的显现或检测的任何实体。任何类型的可检测报道分子/成像剂可用于本文公开的方法以检测一种或多种EMT生物标志物。所述可检测分子是本领域已知的，包括例如磁性珠粒、荧光团、放射性核素、核染剂(例如DAPI)。例如，成像剂可包括包含不稳定同位素(即放射性核素)或荧光部分(例如Cy-5、Alexa 647、Alexa 555、Alexa 488、荧光素、罗丹明等)的化合物。合适的放射性核素包括α发射体和β发射体两者。在一些实施方案中，靶向载体被标记。在其它实施方案中，合适的放射性部分包括可与靶向载体偶联的标记的多核苷酸和多肽。在一些实施方案中，成像剂包含放射性核素，例如发射低能电子的放射性核素(例如发射能量低至20 keV的光子的那些)。所述核素可照射其所递送的细胞，而不照射周围的细胞或组织。可递送至细胞的放射性核素的非限制性实例尤其包括本领域已知的137Cs、103Pd、111In、125I、211At、212Bi和213Bi。按照一些实施方案，适于递送至细胞的其它成像剂包括用于MRI成像的顺磁性物类、用于超声成像的回波产生实体、用于荧光成像的荧光实体(包括量子点)和用于光学成像的光活性实体。用于MRI成像的合适物类是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的钆络合物。对于正电子发射断层扫描(PET)，可递送18F或11C。在本公开内容中阐述了报道分子的其它非限制性实例。
一方面，本公开内容提供用于检测样品中的CTC的试剂盒。在实施方案中，试剂盒包含至少一种EMT生物标志物的抗体。试剂盒中的抗体可与成像剂连接或缔合。在实施方案中，试剂盒可包含至少一种EMT生物标志物的抗体，其中抗体与磁性珠粒缔合。磁性珠粒可用于CTC的铁磁分离和富集。
各方面还涉及预测受试者对癌症药物的响应性的方法。所述方法可包括测定来自受试者样品中的至少一种EMT生物标志物的表达水平。至少一种EMT生物标志物的表达水平可用来获得受试者CTC中的基因表达模式。所述方法还可包括根据所获得的基因表达模式预测受试者对癌症药物的响应性。还可测定来自受试者的CTC的基因组变异。
还提供向受试者提供癌症预后的方法。所述方法可包括测定受试者样品中的至少一种EMT生物标志物的表达水平。至少一种EMT生物标志物的表达水平可用来测定样品中CTC的数目。可使用至少一种EMT生物标志物俘获CTC。至少一种EMT生物标志物的表达水平可用来测定受试者CTC中的基因表达模式。可根据所获得的基因表达模式向受试者提供预后。
还提供用于跟踪受试者的癌症进展的方法。所述方法可包括测定在第一和第二时间来自受试者的样品中至少一种EMT生物标志物的表达水平，并将第一表达水平和与第二表达水平进行比较。可随时间推移，例如在开始新的癌症疗法后，测定样品中至少一种EMT生物标志物的表达水平。样品中至少一种EMT生物标志物的表达水平可用来测定CTC的数目或量。第一水平和第二水平之间的增加可表明癌症进展。第一水平和第二水平之间的降低可表明对于疗法癌症消退或起响应。第一水平和第二水平之间无差异可表明癌症进展的停滞或稳定性。
还提供筛选受试者中的癌症的方法。所述方法可包括测定受试者样品中的至少一种EMT生物标志物的表达水平。至少一种EMT生物标志物的表达水平可用来测定受试者中CTC的量或数目。可将至少一种EMT生物标志物的表达水平与正常样品或对照样品进行比较。至少一种EMT生物标志物的水平提高可表明受试者中癌症的存在。
还提供抑制表达EMT生物标志物的癌细胞的细胞生长或诱导细胞死亡的方法。所述方法包括使癌细胞与能够介导作用剂胞内递送的缀合物(例如本文所述EMT标志物的抗体)接触。作用剂能够在作用剂内化后通过任何机制抑制或减弱细胞生长或诱导细胞死亡。可将癌细胞在体外、体内或离体与缀合物接触。这些方法可用于通过直接靶向表达EMT生物标志物的癌细胞以递送能够降低或抑制细胞生长或诱导细胞死亡的作用剂来治疗癌症。
本公开内容还提供靶向治疗方法和包含与靶向至少一种本文所述EMT的结合剂连接的抗癌剂的分子。在一些实施方案中，抗癌剂和结合剂之间的连接是共价键。在一些实施方案中，连接通过强的静电相互作用(氢键、亲水/疏水相互作用或带相反电荷的部分等)形成。任何抗癌剂可用于所述分子和治疗方法中，本领域技术人员可根据待治疗的癌症类型、癌症的进展/分期、潜在不良的药物相互作用、剂量需要、给药方案等选择抗癌剂。
分离、俘获或富集循环肿瘤细胞的方法
因为EP在转移中的重要性，本公开内容采用基于间充质的俘获方法，在患者(例如晚期前列腺癌患者)中鉴定出失去其上皮表型的CTC。所述方法可补充或替代现有的通过俘获EpCAM表达降低或缺乏的细胞的基于上皮的方法。
本公开内容涉及使用上述任何EMT生物标志物分离、俘获或富集CTC的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离、俘获或富集循环肿瘤细胞。EMT生物标志物可包括OB-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白、波形蛋白、E-钙黏着蛋白、FGFR2剪接变体同种型或CD133。
a) OB-钙黏着蛋白
OB-钙黏着蛋白，亦称钙黏着蛋白-11和O-钙黏着蛋白，由CDH11基因编码，首次在小鼠成骨细胞中鉴定出。OB-钙黏着蛋白是在骨发育期间介导成骨细胞粘附的嗜同性细胞粘附分子。在乳腺癌、胃癌和前列腺癌中已发现异常的OB-钙黏着蛋白表达。OB-钙黏着蛋白可能参与前列腺癌转移。在CTC中显示OB-钙黏着蛋白表达(参见图1)。
在人前列腺癌中，通过免疫组织化学检查显示与原发性肿瘤相比，骨转移中OB-钙黏着蛋白的表达增加。虽然OB-钙黏着蛋白表达如何促进骨转移的确切机制不明，但是已知OB-钙黏着蛋白介导PC细胞和成骨细胞之间的粘附。在临床前，在PC-3细胞中，当OB-钙黏着蛋白通过shRNA沉默并给小鼠注射沉默的细胞时，发生较少骨转移，而在其它器官中的转移不受影响。另外，在其它模型系统中，OB-钙黏着蛋白表达的诱导与EMT/EP生物学有关。此外，雄激素耗尽导致OB-钙黏着蛋白上调，表明了OB-钙黏着蛋白在去势抵抗性疾病进展中的作用。最后，鉴于致死转移性前列腺癌在绝大多数男性中总是扩散到骨，则在有转移性CRPC的男性血液中，OB-钙黏着蛋白阳性CTC可能是可检出的。
在FDA批准的CELLSEARCH®技术中，针对OB-钙黏着蛋白的抗体与铁颗粒连接形成可代替或补充EpCAM铁磁流体的新的铁磁流体。在从全血中免疫磁性地富集表达OB-钙黏着蛋白的细胞后，接着其它表征步骤以确保俘获细胞是目标细胞，例如测量不依赖EMT的特征蛋白质(例如β-联蛋白)的水平。抗体可与OB-钙黏着蛋白的胞外结构域结合。
b) N-钙黏着蛋白
N-钙黏着蛋白，亦称神经钙黏着蛋白(NCAD)和钙黏着蛋白-2 (CDH2)，由CDH2基因编码。N-钙黏着蛋白常存在于癌细胞中，并提供跨内皮迁移的机制。当癌细胞与血管的内皮细胞粘附时，它上调src激酶途径，其使与N-钙黏着蛋白和E-钙黏着蛋白连接的β-联蛋白磷酸化。这引起两个相邻内皮细胞间的胞间无法连接，使得癌细胞从中通过。抗体可与N-钙黏着蛋白的胞外结构域结合。
证实循环肿瘤细胞的方法
鉴于CTC相对于循环细胞极其稀少，CTC的分离包括表达泛-白细胞标志物CD45的细胞的鉴定和排除。循环CD45阴性细胞不一定是肿瘤来源的，然而，取而代之可代表正常血管或基质细胞、循环间充质细胞或干细胞或极少量存在于循环中的其它宿主细胞。循环内皮细胞产生于血管壁更新，而骨髓来源的内皮祖细胞可在缺血组织的新血管形成和肿瘤形成的情况下循环。这些细胞全部为CD45阴性和CD31阳性。同样CD45阴性但CD31阴性间充质基质细胞(MSC)是可为骨髓、外周血或脂肪来源的更多样化的细胞群。MSC是可分化成多种基质细胞类型的多能细胞，在炎性病症中循环，并在用于再生医学和其它情况的积极研究之中。循环MSC在癌症中的意义仍然不明。因此，任何CTC检测方法包括将肿瘤细胞与循环中多种其它稀少的可表达非上皮生物标志物的非肿瘤细胞区分开来。CTC的证实可包括检测β-联蛋白、CD31、CD45、细胞角蛋白和/或PSA，用DAPI染色，和/或检测前列腺癌特异性基因组事件。例如，如果DAPI染色为阳性，β-联蛋白表达为阳性，CD45表达为阴性，CD31表达为阴性，则CTC可被证实。可使用针对β-联蛋白、CD31、CD45、细胞角蛋白和/或PSA的抗体，进行β-联蛋白、CD31、CD45、细胞角蛋白和/或PSA的检测，其中抗体被标记。
a) β-联蛋白
β-联蛋白，由CTNNB1基因编码，在癌细胞中具有多种功能，包括钙黏着蛋白介导的细胞粘附和参与Wnt信号转导途径。当缺乏Wnt配体时，β-联蛋白被磷酸化并降解。当存在Wnt配体时，β-联蛋白向核移动，并激活与多种癌症中的EMT/侵袭、增殖和存活有关的靶基因。特别在前列腺癌中，β-联蛋白可与雄激素受体一起用作辅因子，且在晚期疾病中观察到表达增加和定位改变。不论CTC的上皮或间充质表型性质如何，β-联蛋白表达可为恒定结果。使用β-联蛋白表达鉴定CTC没有与使用细胞角蛋白有关的上皮偏倚。与β-联蛋白结合的抗体可用来检测β-联蛋白。
b) CD31
分化簇31 (Cluster of differentiation 31，CD31)，亦称血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1)，由PECAM1基因编码，在从身体内除去老化的嗜中性粒细胞中起作用。CD31存在于血小板、单核细胞、嗜中性粒细胞和某些类型的T细胞的表面，并构成大部分的内皮细胞胞间连接。CD31正常存在于内皮细胞上，并用于免疫组织化学以证实组织学组织切片中内皮细胞的存在。与CD31结合的抗体可用来检测CD31。
c) CD45
分化簇45 (CD45)，亦称蛋白质酪氨酸磷酸酶受体类型C和白细胞共同抗原，由PTPRC基因编码。CD45用来鉴定白细胞。与CD45结合的抗体可用来检测CD45。
d) 细胞角蛋白
细胞角蛋白是存在于上皮组织的胞质内细胞骨架中的含角蛋白的中间丝。表达细胞角蛋白的癌细胞在进行上皮-间充质转化后失去其细胞角蛋白表达，其中多达20%的细胞没有可检出的细胞角蛋白。细胞角蛋白以外的蛋白质可鉴定纯的间充质CTC。
e) PSA
前列腺特异性抗原(PSA)，亦称γ-精液蛋白或激肽释放酶-3 (KLK3)，是在人中由KLK3基因编码的糖蛋白酶。PSA是激肽释放酶相关肽酶家族的成员，由前列腺的上皮细胞分泌。PSA少量存在于具有健康前列腺的男性的血清中，但是通常在存在前列腺癌或其它前列腺病症时升高。
f) DAPI
DAPI，亦称4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是与DNA中富含A-T的区域强结合的荧光染剂。它广泛用于荧光显微术。DAPI可穿过完整的细胞膜，因此可用来染色活的和固定的细胞。
g) 前列腺癌特异性基因组事件
CTC可通过检测至少一个前列腺癌特异性基因组事件的存在与否来证实。至少一个前列腺癌特异性基因组事件可以是雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合，及其组合。例如，检测雄激素受体扩增、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)丧失、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)基因和ETS相关(ERG)基因的基因融合的存在可表明和/或证实CTC是前列腺癌细胞。前列腺癌特异性基因组事件的检测可采用荧光原位杂交进行。
测定或鉴定循环肿瘤细胞的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物测定或鉴定CTC的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而测定或鉴定循环肿瘤细胞。
从患者中分离或俘获完整细胞的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物从患者中分离或俘获完整细胞的方法，其中完整细胞是β-联蛋白阳性、DAPI阳性和CD45阴性。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞。完整细胞可以是间充质表型细胞，例如间充质CTC。
检测受试者的癌症的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物检测受试者的癌症的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较；检测受试者的癌症，如果循环肿瘤细胞的水平高于循环肿瘤细胞的参比水平，则在受试者中检出癌症。癌症可以是上述至少一种癌症。所述方法还可包括将抗癌疗法给予鉴定为患有癌症的受试者。
监测进行治疗性治疗的受试者的癌症进展的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物监测进行治疗性治疗的受试者的癌症进展的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；使循环肿瘤细胞的水平与受试者的癌症进展关联，其中如果与来自受试者的较早生物样品中的循环肿瘤细胞的水平相比循环肿瘤细胞的水平较高，则受试者鉴定为显示癌症进展。所述方法还可包括将抗癌疗法给予鉴定为患有癌症的受试者。
测定受试者的癌症预后的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物测定受试者的癌症预后的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较；测定受试者的癌症预后，其中如果循环肿瘤细胞的水平高于循环肿瘤细胞的参比水平，则受试者鉴定为患有癌症。所述方法还可包括将抗癌疗法给予鉴定为患有癌症的受试者。
预测患有癌症的受试者对疗程的响应性的方法
本公开内容涉及使用上述EMT生物标志物预测患有癌症的受试者对疗程的响应性的方法。所述方法包括从患者中获得生物样品；获得至少一种俘获结合蛋白，其中俘获结合蛋白与固相连接形成固相-俘获结合蛋白复合体；使生物样品与固相-俘获结合蛋白复合体接触足以允许固相-俘获结合蛋白复合体结合循环肿瘤细胞上的至少一种EMT生物标志物以形成固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体的一段时间；通过对样品施加外部磁场，从样品和未结合的磁性颗粒-俘获结合蛋白复合体中分离固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体，从而分离或俘获完整细胞；测定固相-俘获结合蛋白-循环肿瘤细胞复合体中循环肿瘤细胞的水平；并将循环肿瘤细胞的水平与循环肿瘤细胞的参比水平进行比较。
治疗
在上述方法中被鉴定为循环肿瘤细胞的水平大于或等于参比水平的受试者被鉴定为患有癌症的患者。然后针对癌症治疗受试者。
a) 前列腺癌
在上述方法中鉴定为循环肿瘤细胞水平大于或等于参比水平的受试者被鉴定为患有前列腺癌的患者。然后针对前列腺癌治疗受试者。治疗可包括观察等待或主动监测、手术、冷冻手术、高强度聚焦超声、放射、激素疗法、化学疗法和靶向疗法。手术的实例包括盆腔淋巴结切除术、根治性前列腺切除术(耻骨后前列腺切除术和经会阴前列腺切除术)、经尿道前列腺切除术和腹腔镜前列腺切除术。放射疗法的实例包括高能X射线(外放射疗法和内放射疗法)、质子束放射疗法和强度调控放射疗法。激素疗法的实例包括促黄体激素释放激素激动剂，例如亮丙瑞林(Lupron、Eligard)、戈舍瑞林、曲普瑞林(Trelstar)、组氨瑞林(Vantas)和布舍瑞林；抗雄激素类，例如氟他胺、比卡鲁胺(Casodex)和尼鲁米特(Nilandron)；酮康唑、睾丸切除术、雌激素和氨鲁米特。化学治疗药物的实例包括醋酸阿比特龙(Zytiga)、卡巴他赛(cabazitaxel)、地加瑞克(degarelix)、多西他赛、enzalutamide (Xtandi)、卡巴他赛(Jevtana)、醋酸亮丙瑞林(Lupron、Lupron Depot、Lupron Depot-3 Month、Lupron Depot-4 Month、Lupron Depot-Ped、Viadur)、泼尼松、西普鲁塞T (Provenge)、雌莫司汀(Emcyt)、米托蒽醌(Novantrone)、长春瑞滨(Navelbine)、紫杉醇(Taxol)、环磷酰胺(Cytoxan)、依托泊苷(VP-16)、G-1 (GPR30激动剂/刺激物)和多西他赛(Taxotere)。
b) 乳腺癌
在上述方法中鉴定为循环肿瘤细胞水平大于或等于参比水平的受试者被鉴定为患有乳腺癌的患者。然后针对乳腺癌治疗受试者。治疗可包括手术、放射疗法、骨导向疗法、化学疗法、激素疗法和靶向疗法。手术的实例包括肿块切除术、四分之一切除术、乳房切除术(例如单纯乳房切除术、保留皮肤乳房切除术、改良根治性乳房切除术、预防性乳房切除术和根治性乳房切除术)、预防性卵巢摘除、冷冻疗法和淋巴结手术(例如腋淋巴结解剖和前哨淋巴结活检)。放射疗法的实例包括外射线放射(external beam radiation) (例如加速乳腺照射和3D适形放射疗法)和近程治疗(内放射) (例如间质内近程治疗、腔内近程治疗和术中放射)。骨导向疗法的实例包括二膦酸盐类和地舒单抗。化学疗法的实例包括蒽环类，例如多柔比星(Adriamycin、Doxil)、表柔比星(Ellence)和柔红霉素(Cerubidine、DaunoXome)、卡培他滨(Xeloda)、卡铂(Paraplatin)、顺铂、环磷酰胺(Cytoxan)、eribulin (Halaven)、氟尿嘧啶(亦称5-氟尿嘧啶或5-FU；Adrucil)、吉西他滨(Gemzar)、伊沙匹隆(Ixempra)、甲氨蝶呤(Amethopterin、Mexate、Folex)、米托蒽醌(Novantrone)、自力霉素(Mitomycin)、紫杉烷类例如紫杉醇(Taxol、Abraxane)和多西他赛(Taxotere)、塞替派(Thioplex)、长春新碱(Oncovin，Vincasar PES，Vincrex)和长春瑞滨(Navelbine)。激素疗法的实例包括芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑(Arimidex)，依西美坦(Aromasin)和来曲唑(Femara)；选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如他莫昔芬(Nolvadex)、雷洛昔芬(Evista)和托瑞米芬(Fareston)；及雌激素受体下调剂，例如氟维司群(Faslodex)。靶向疗法的实例包括曲妥珠单抗(Herceptin)、拉帕替尼(Tykerb)、贝伐单抗(Avastin)、培妥珠单抗(Perjeta)和依维莫司(Afinitor)。
试剂盒
本文提供试剂盒，其可用于从样品中分离、俘获或富集CTC。试剂盒包含用于从样品中分离、俘获或富集CTC的至少一种组分和用于从样品中分离、俘获或富集CTC的说明书。试剂盒中所包括的说明书可附在包装材料上或可作为包装说明书包括在内。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开内容考虑了能够存储所述说明书并将其传达给最终用户的任何介质。所述介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、录音带盒、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。本文所用术语“说明书”可包括提供说明书的互联网址。
至少一种组分可包括与至少一种EMT生物标志物特异性结合的至少一种抗体。抗体可以是EMT生物标志物俘获抗体。抗体可包括针对OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的抗体。抗体可与固相载体结合。固相载体可以是磁性珠粒。磁性珠粒可用于CTC的铁磁分离和富集。
试剂盒还可包含至少一种染色试剂。至少一种染色试剂可包含被可检测标记的抗体。抗体可包括针对用来证实CTC的生物标志物的抗体。生物标志物可以是β-联蛋白、CD45或CD31。至少一种染色试剂可包括藻红蛋白标记的抗β-联蛋白抗体和别藻蓝蛋白标记的抗CD45抗体。
试剂盒还可包含校准物或对照和/或用于进行CTC分离、俘获或富集的至少一个容器。试剂盒可包含进行CTC分离、俘获或富集所必需的所有组分，即试剂、标准物、缓冲剂、稀释剂等。
除非本文另有定义，否则结合本公开内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，结合本文所述细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术使用的任何名称和其技术是本领域众所周知和常用的那些。术语的含义和范围应是清楚的；然而在有任何潜在的歧义的情况下，本文提供的定义先于任何词典或外来定义。另外，除非文中另有需要，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
对于数字范围的引述，明确考虑了相同精确度之间的每个间插数字。例如，对于6-9的范围，除6和9以外，还考虑了数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
实施例
实施例1. 材料与方法
质粒和细胞培养。之前描述了所用的小基因(pRIIIcl2) (S. Oltean等, Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 14116，通过引用以其整体结合到本文中)。将所有细胞系培养在含10% FBS和15 μg/mL杀稻瘟素的低葡萄糖DMEM (Invitrogen)中。通过有限稀释从用pRIIIcl2小基因稳定转染的AT3细胞群中分离单细胞子代以产生1个细胞/10孔的浓度，并接种在96孔板中。使用血细胞计数器对细胞计数，得到1 x 105个细胞/mL的初始浓度。通过一系列渐进稀释，得到1个细胞/mL的终浓度，将100 μl移液到3个96孔板的各孔中。通过明视场显微术监测所有孔，排除显现含超过1个细胞的孔，将含有单细胞的孔在25 mL培养瓶中进一步培养。在第一轮采用该方法，获得预期的27个克隆中的16个。
为了测量体外细胞群生长速率，将细胞以50,000个/孔接种6孔培养皿中。在24、48、72和96小时使用锥虫蓝染色对活细胞计数。
动物和肿瘤细胞植入。细胞经胰蛋白消化，洗涤，以3 x 105个细胞/mL的终浓度重新悬浮于PBS中，在植入前保持在冰上少于30分钟。将细胞(3 x 105)注射到哥本哈根2331大鼠(Harlan Labs，Indianapolis，IN；75-90 g，2月龄)两胁皮下组织中。继续监测动物的肿瘤生长。所有动物程序均通过杜克大学机构和动物管理和使用委员会批准，并遵循NIH准则。应用Mantel-Haenszel对数秩检验比较处死曲线。应用不配对t检验比较肿瘤体积。Macintosh的Prism 4.0c (Graphpad，La Jolla，CA)用于统计分析。
组织学切片和分析。将切离的肿瘤和肺在室温下在PBS中洗涤。根据肺的大小，将其一起或单独冷冻。将肿瘤切片和肺置于cryomold中，在最佳切削温度组织切片培养基(Sakura Finetek，Torrance，CA)中包埋，在液氮中速冻，并在-80℃下保存。如下制备用于荧光成像的载玻片：将组织在-20℃下孵育2-3小时以平衡温度，然后用切片机切片。将切片(15 µm)铺于玻璃载玻片上，在室温下在4% (wt/vol)低聚甲醛中固定30分钟，并在室温下在PBS中漂洗。将载玻片用凝胶/封片培养基(Biomeda，Foster City，CA)封片。切片使用Olympus (Melville，NY) IX 71落射荧光显微镜分析，使用Olympus DP70数码相机获得图像。用DP Controller软件(Olympus)进行图像处理。对于荧光成像后的苏木素-伊红染色，将载玻片在温水中温育15-20分钟以脱开盖玻片，将载玻片干燥，并按照标准程序进行染色。
从肿瘤切片中提取RNA。将切片在4% (wt/vol)低聚甲醛中固定5分钟，在PBS中漂洗，并成像。在载玻片上标出切片的DsRED+和DsRED-区域。将载玻片浸入温水中5分钟以脱去盖玻片，并刮下DsRED+和DsRED-区域。如前所述进一步进行RNA分离(N. Masuda, T. Ohnishi, S. Kawamoto, M. Monden, K. Okubo, Nucleic Acids Res 1999, 27, 4436，通过引用以其整体结合到本文中)。简单地说，将样品在含有SDS的消化缓冲液中用蛋白酶K处理，并使用RNeasy试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)进行RNA的进一步分离。
免疫印迹法。通过刮擦从汇合的25 cm2组织培养瓶中收集细胞，在PBS中洗涤，在样品缓冲液中裂解。将全细胞裂解物在样品缓冲液中连续稀释，通过7.5% SDS-PAGE分级，并转移到PVDF。将膜切成两半。下半部用1:1000或1:5000的抗β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology，CA，47778)作为内加载对照进行探测，而上半部用1:200的抗CD 133 (Santa Cruz Biotechnology，CA，30219)或1:200的抗CD44 (Santa Cruz Biotechnology，CA，7946)进行探测。
基因表达分析。使AT3-M和AT3-T细胞的一式三份培养物生长至60%汇合。使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)分离总RNA，并将一式三份样品提交给Duke Microarray Facility。使用R027K大鼠点阵列3.0 (Operon，Huntsville，AL)进行基因表达分析。AT3-M和AT3-T细胞间表达差异的生物信息分析使用GeneSpring GX软件7.3.1版(Agilent Technologies，Durham，NC)进行。利用以下特征使数据文件(代表在所有6个数据点上26,986个基因探针的信号，3个为AT3-M，3个为AT3-T)归一化：每点和每芯片——强度依赖性(Iowess)归一化。利用具有以下性质的“Filtering on Volcano plot”特征，使用所得基因表测定AT3-M和AT3-T之间显著差异性表达的基因：(1)检验类型：参数检验，不假设方差相同；(2)多重检验校正：无；(3)倍数差异：2倍或更多倍，和0.05的P值截断值。
人循环肿瘤细胞的分析。对CTC生物标志物方案合格的患者包括(1)患有进行性CRPC、通过PSA (在被>1周分隔的最低点上两个连续升高)或辐射学标准(RECIST或新骨扫描病变)有转移性进展、PSA ≥5、年龄≥18岁的男性；或(2)患有mBC伴疾病进展或开始新的全身疗法的女性，其>18岁，且自用含蒽环类的方案治疗以来至少7天。从患者中采集血液(15 mL)，在48小时内，采用Cell Search System (Veridex，Raritan，NJ)，在杜克大学CTC实验室进行处理。使用Veridex profile试剂盒，其分离EpCAM阳性细胞而无需额外染色。分离的细胞经立即处理或在4%低聚甲醛中保存过夜并次日处理。在特氟纶包被的载玻片上进行免疫染色。简单地说，将细胞移液到载玻片的孔中，放置以沉淀~30分钟，接着标准免疫染色程序，小心地吸取以使细胞损失降到最低。使用台式磁铁进行初始铁磁洗涤以进一步分离CTC，用磁铁释放100 uL PBS后将细胞沉淀再悬浮。在4% PFA固定和用PBT (含2% Triton的PBS)透化并用10%山羊血清封闭30分钟后，使用用Alexa 647标记的CD45抗体(AbCam #33533-50)、用Alexa 555标记的细胞角蛋白(AbD Serotec #MCA 1907HT)和用Alexa 488标记的波形蛋白(BD Biosciences，San Jose，CA #550513)进行三重免疫染色。然后用4',6-二脒基-2苯基吲哚(DAPI)进行核染色。使用合适的对照，通过镜检确定间充质CTC (事件)为完整细胞，含有完整的核和表达细胞角蛋白但缺乏CD45染色(对于抗体和对照参见表1)。通过来自正常供体的血沉棕黄层的聚蔗糖(Ficoll)纯化获得的人外周血单核细胞(PBMC)由Micah Luftig (杜克大学，Durham NC)友情提供，并用作对照细胞用于CD45表达。进行线性回归分析以针对共表达波形蛋白的CTC比例来比较CTC计数(标准Cellsearch方法)。通过方差分析检验拟合优度。
表1. CTC中待评价的EMT/干细胞性抗原。
将载玻片用凝胶/封片培养基(Biomeda，Foster City，CA)封片。载玻片用Olympus (Melville，NY) IX 71落射荧光显微镜分析，使用Olympus DP70数码相机获取图像。用DP controller软件(Olympus)进行图像处理。分析全部视野，各细胞角蛋白阳性有核细胞(其为CD45阴性)作为CTC计数。各抗体的阳性对照细胞包括用于波形蛋白的PC-3细胞、用于CD45的外周血单核细胞(PBMC)和用于细胞角蛋白的T47D乳腺癌细胞系。不含抗体的类似体积的反应混合物用作阴性对照。
培养基交换实验。将AT3-T或AT3-M克隆的细胞以150,000个细胞/2 mL培养基的浓度接种在6孔板中，并使之孵育24小时。条件培养基然后使用0.22 µm过滤器过滤，然后立即使之与其它克隆的细胞一起孵育(所述细胞以相同浓度接种和吸取其培养基，用2 mL PBS洗涤细胞)。将所有细胞与更换的培养基一起孵育72小时，在处理后24、48和72小时，使用相差显微术和落射荧光显微术监测细胞表型。还使用其中培养基是有条件的对照板，将细胞用PBS洗涤，将培养基加回到相同的细胞中。
刮伤测定法。接种细胞，使之在6孔培养皿中生长到接近100%汇合。通过用无菌200 μl移液管头刮擦细胞模拟伤口。各孔用PBS洗涤两次，加入新鲜培养基。在0、24和48小时，在相同标记点拍摄照片。百分比迁移计算为(在0小时的宽度-在24或48小时的宽度)/在0小时的宽度x 100。通过Macintosh的Prism 4.0c (Graphpad，La Jolla，CA)，采用双因素方差分析，比较相对迁移。
基质胶测定法。基质胶测定法按照生产商的指示进行(BD Biosciences)。简单地说，在再水化后，将2 x 105个细胞置于对照或基质胶包被的插入物中，并孵育22小时。在孵育后，使用棉签拭子除去来自插入物上部的非侵入细胞。来自膜的下部的细胞用苏木素-伊红染色，除去膜，置于载玻片上，并在显微镜下观察。
转移物的免疫组织化学(IHC)分析。在与上述人循环肿瘤细胞分析相同的知情同意方案下，进行CTC收集的男性另外同意将应用辐射学引导的转移性活检样品用于通过IHC进行生物标志物表达的分析。在轻微镇静期间，通过核芯针活检获得样品，立即进行福尔马林固定，石蜡包埋。对于分析，将载玻片脱石蜡，再水化，在含0.3% H2O2 (过氧化氢)的甲醇中灭活内源过氧化物酶30分钟。对各抗原进行特异性抗原修复步骤。通过IHC评价3种标志物：波形蛋白(M7020，Dako，1:150；用胃蛋白酶处理的抗原修复在37℃下15分钟)、细胞角蛋白混合物(18-0132，Invitrogen，1:50和349205，BD Biosciences 1:50，用胃蛋白酶处理的抗原修复在37℃下15分钟)和CD45 (M0701，Dako，1:200；抗原修复用柠檬酸钠10 mM，pH 6.0在100℃下30分钟)。将第一抗体在室温下孵育60分钟。在室温下使用Dako Envision辣根过氧化物酶第二抗体30分钟，用DAB试剂(Vector kit SK 4100)检测信号。载玻片用苏木素和伊红复染，并使用各标志物合适的阳性(局限性前列腺组织微阵列切片)和阴性对照(模拟物抗体)，由经训练的病理学家评价表达。
统计分析。为了测定AT3-M和AT3-T之间显著差异性表达的基因，采用具有以下性质的GeneSpring GX “Filtering on Volcano plot”特征：(1)检验类型：参数检验，不假设方差相等；(2)多重检验校正：无；(3)倍数差异：2倍或更多倍和0.05的P值截断值。为了针对共表达波形蛋白、N-钙黏着蛋白或CD133的CTC的比例来比较CTC计数(标准细胞SEARCH®方法)，进行了线性回归分析。拟合优度通过方差分析检验。
实施例2. 占据中间表型状态的各AT3克隆的分离
FGFR2转录物的可变剪接(其分别在上皮细胞和间充质细胞中产生FGFR2-IIIb或FGFR2-IIIc变体)受高度调节(图1A)。图1A是FGFR2的IIIb和IIIc可变剪接同种型的图示。FGFR2含有1个胞外结构域(具有3个IgG样结构域)、1个跨膜结构域(TM)和2个胞内酪氨酸激酶结构域。IIIb同种型存在于上皮细胞中，而IIIc同种型存在于间充质细胞中。外显子IIIb和IIIc被协调地调节以提供两种同种型互斥的表达，无义介导的衰变破坏包括两个外显子的转录物的稳定。我们之前使用FGFR2可变剪接报道基因，特别是测量外显子IIIc (例如图1B中的pRIIIcl2)的上皮特异性沉默的构建体，以报道体外和体内细胞的表型状态。图1B是pRIIIcl2小基因和荧光读出的示意图。小基因含有DsRED可读框，其被外显子IIIc和FGFR2基因的侧翼内含子间断。在上皮细胞中，外显子IIIc缺失(skipped)，形成了DsRED可读框，并产生荧光信号。在间充质细胞中，外显子IIIc被包括在内，DsRED可读框被破坏，导致低荧光信号或接近背景的荧光信号。当外显子IIIc沉默时产生不同红色荧光蛋白(DsRED)的pRIIIcl2剪接报道基因，显示来源于植入哥本哈根白鼠两胁的AT3细胞的原发性肿瘤的MET。虽然大多数肿瘤含有MET病灶，但每个肿瘤具有非常少的病灶，并且这些不是随机分布的，而是与胶原基质缔合。与原发性肿瘤中低频率的MET不同，在这些动物中观察到肺转移物中MET的高发生率，表明了在更多上皮表型和侵略性行为之间预料不到的关联。这些研究无法确定肺中存在的上皮样AT3细胞在原发性肿瘤中或在转移过程中是否进行MET。
在体外寻找MET后细胞的尝试中，使用有限稀释从用pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3细胞中获得克隆。获得27个最大计算回收率中的共16个克隆，其为~60%克隆率。这16个克隆中的11个表达RIIIcl2转录物(在表2中用斜体字表示)，并且在这些当中，8个表达DsRED (表2)。一些克隆具有上皮样形态(细胞有鹅卵石外形，并彼此粘附)，而其它具有间充质样形态(梭状)，以及显示混合表型的克隆。重要的是注意到，鉴于DsRED+克隆的高克隆率和高频率，这些上皮样克隆来自亲本AT3细胞内的极少群体是极不可能的。更确切地说，亚克隆过程在大量的AT3细胞中诱导表型转化。
表2. AT3克隆的性质。
1参见图1C。“+”表示遗失外显子IIIc的RIIIcl2转录物的检测，“-”所有RIIIcI2转录物包括外显子IIIc，ND意味着未检出RIIIcl2转录物。
2通过落射荧光显微术测定(高的定义是高于幼稚AT3细胞背景的荧光，低的定义是无法从相同细胞中区分出来)。
3本文进一步阐述，并在图1C中说明。
分析通过有限稀释获得的所有克隆以确定RIIIcl2的剪接状态和内源FGFR2转录物。我们无法在具有间充质样形态的克隆中检出pRIIIcl2转录物中的外显子IIIc缺失或内源FGFR2转录物中外显子IIIb加入的任何证据(图1C和表2)。图1C显示报道基因(上部分)和内源FGFR2 (下部分)的RT-PCR分析。设计了位于外显子IIIc侧翼的DsRED区域中的用于报道基因的引物。RT-PCR显示与克隆AT3M相比，克隆AT3-T中较高百分比的缺失产物。不包括RT (-RT)的反应显示通过真实cDNA模板(AT3-M泳道)的存在而竞争出局的污染产物。由于外显子IIIb和IIIc在大小上仅以3个核苷酸之差而不同，通过使用侧接外显子的引物和所得RT-PCR产物的特异性限制酶切消化，对FGFR2基因中IIIb或IIIc外显子的存在进行分析。外显子IIIb用Aval (A)消化，IIIc用HincII (H)消化。在克隆AT3-T中有较高百分比的外显子IIIb。RT-PCR是自2个克隆的3种不同培养物的重复。这些克隆不表达可检测水平的DsRED (图1D和表2)。图1D显示克隆AT3-M和AT3-T的落射荧光和相衬照片，显示两种克隆之间的荧光强度和形态学的差异。以相同的曝光度拍摄落射荧光照片。以200X放大倍数获得所有照片。虽然可预期来自上皮样克隆的pRIIIcl2转录物中外显子IIIc缺失，但是所有这些克隆既缺失又包括外显子IIIc的观察结果是未预料到的(图1C，表2和数据未显示)。内源FGFR2转录物的分析显示，具有上皮形态和DsRED表达的4个克隆具有共表达IIIb和IIIc同种型两者的明确证据(表2，和图1C和1D)。如图1所示，AT3-T细胞表达FGFR2的上皮和间充质同种型。DsRED在所有细胞中的表达表明培养中的各细胞均表达两种同种型(图1C)。
我们跟踪了具有上皮形态、高DsRED水平和共表达FGFR2-IIIb和-IIIc转录物的2个克隆(克隆2和克隆5 (克隆5在本文为AT3-T))，并注意到上文所述表型性质在6个月以上是稳定的。同样，我们跟踪了克隆11 (克隆11在本文为AT3-M)和克隆12达6个月，并注意到间充质形态、不可检出的DsRED表达和唯一产生的FGFR2-IIIc也是稳定的。我们从这些观察中得到结论，AT3细胞是可塑的，并通过亚克隆诱使其处于具有上皮细胞和间充质细胞性质的中间表型状态。
采用培养基交换实验研究表达DsRED的克隆中RIIIcI2转录物的剪接是否受可溶性因子调节。将表达DsRED的克隆(表2中的克隆5)调节的培养基过滤，加入DsRED阴性克隆(表2中的克隆11)中。在用DsRED+条件培养基孵育的DsRED-细胞中观察到DsRED+细胞(图2)。图2A显示在用来自克隆AT3-T的条件培养基处理时由AT3-M细胞形成的DsRED阳性细胞簇的实例。调节培养基24小时，过滤并加入AT3-M细胞中。在培养基交换后48小时拍摄照片(以200X获得)。图2B显示来自相同实验的流式细胞术分析的结果。左上部分表示来自相同克隆用培养基调节的克隆AT3-M，作为阴性对照。右上部分表示克隆AT3-T，其是DsRED阳性。下部分表示在加入来自克隆AT3-T的条件培养基后48小时的克隆AT3-M。不同批次的胎牛血清引起这种作用的变化。该作用通过流式细胞术量化，且这些数据表明，约一半的DsRED-细胞被诱导表达DsRED，其水平等同于DsRED+细胞中所观察到的水平(图2)。所观察到的变化不是由于相同孔中细胞的长期培养所致，因为来自单独的DsRED-培养物的条件培养基不诱导DsRED表达。如图2所示，AT3-T条件培养基诱导AT3-M细胞表达DsRED。这些观察结果表明，由DsRED+克隆分泌的可溶性因子或存在于DsRED-条件培养基中因子的稀释可有助于可塑性。
实施例3. AT3-M和AT3-T细胞是致瘤的
AT3-T的最初表征显示，与AT3-M相比，这些移行细胞生长得较慢，并达到较低的汇合密度(图3A)。图3A显示克隆AT3-T和AT3-M的生长曲线。细胞在0小时时间点接种，经胰蛋白消化，并在规定时间计数。数据为均值± S.D. (n = 3)。为了研究其体内生长，AT3-M和AT3-T细胞用pGint (一种在间充质和上皮细胞两者中表达EGFP (本文为GFP)的质粒)共转染，并采用流式细胞术针对均一的GFP强度分选各个细胞系的稳定群。在亚克隆后首次观察到表达GFP的细胞保持形态性质、差异性DsRED表达和pRIIIcl2剪接和FGFR2转录物的差异。
我们在哥本哈根白色2331雄性大鼠两胁皮下组织注射3 x 105个表达GFP的AT3-T或AT3-M细胞。所有动物都发生了两侧肿瘤，表明了AT3-M和AT3-T细胞两者在这些同基因大鼠中是高度致瘤的。作为人道终点，当通过触诊估计肿瘤长度达到1 cm时，处死大鼠。AT3-M和AT3-T肿瘤的体内生长曲线显著不同，如通过对数秩检验测定(p = 0.0020；图3B)。图3B是注射AT3-M或AT3-T细胞的大鼠的处死曲线。图3C显示自AT3-T和AT3-M注射产生的肿瘤体积的比较。Y轴表示在动物处死时间的肿瘤体积，X轴为从植入时间到处死时间的天数。直到处死的平均肿瘤体积和平均天数用S.D.柱表示。一些点表示在同一天具有相同体积的一个以上肿瘤。测量肿瘤体积(图3C)，虽然大多数AT3-T动物稍后处死，但是肿瘤大小无显著差异(p = 0.76)。如图3所示，AT3-T细胞在体外和体内的生长比间充质样AT3-M细胞慢，但是两者同样是致瘤的。我们得出结论，虽然相对于其更间充质性亲缘细胞，AT3-T细胞在体外和体内的生长较慢，但这些移行细胞能够形成肿瘤。
实施例4. AT3-M和AT3-T两者是塑性的
由于植入的AT3-M和AT3-T细胞可通过GFP表达跟踪，且上皮特性可通过DsRED表达查询，因此能够研究肿瘤的可塑性。AT3-M肿瘤中绝大多数的细胞表达GFP，但不表达DsRED (图4A)。如图4所示，来自AT3-T和AT3-M克隆两者的肿瘤具有可塑性的证据。图4A显示在用Gint和pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3-M肿瘤周边表达RFP和GFP两者的细胞的代表性实例。照片以200X放大倍数拍摄。为了补偿低的RFP信号，调整整个照片的色彩曲线。虽然如此，在许多AT3-M肿瘤切片中，尤其接近肿瘤囊，都观察到表达GFP和DsRED两者的细胞群(图4A；另参见图5)。图5显示在用Gint和pRIIIcI2报道基因稳定转染的AT3-M肿瘤周边表达RFP和GFP两者的细胞的代表性实例。照片以200X放大倍数拍摄。在该方案中，在拍摄图像后，总体RFP信号不通过色彩曲线调节。RFP阳性细胞明显高于背景水平。
来自AT3-T肿瘤的许多切片共表达GFP和DsRED；然而，观察到在所有所研究的64个切片中表达GFP但不表达DsRED的大量区域(图4B)。图4B显示来自用GFP和pRIIIcl2报道基因稳定转染的AT3-T肿瘤的切片的代表性实例。照片以200X放大倍数拍摄。从AT3-T肿瘤的这些区域提取的RNA证实pRIIIcl2转录物的存在。AT3-T和AT3-M细胞两者是可塑的，且用显示各种上皮-间充质性质的细胞产生肿瘤。
实施例5. AT3-T细胞体外是能动的而体内是转移性的
在培养中进行了AT3-T和AT3-M移动性和侵袭潜力的比较。通过“伤口闭合”测定法测量培养物中的运动，在培养物中产生刮擦伤口后24和48小时，发现细胞系间无显著的运动差异(p = 0.59) (图6)。图6A显示刮伤测定法的代表性照片(各克隆以一式三份进行实验)。照片以40X放大倍数拍摄。图6B显示按方法中所述迁移的量化。均值和SO值来源于一式三份实验。图6C显示使用基质胶包覆膜的侵袭测定法。各克隆和针对对照膜和基质胶包覆膜两者的代表性照片(n = 5)。细胞用苏木素-伊红染色。照片以40X放大倍数拍摄。图6D显示侵袭测定法结果的量化。均值和SD值来自5个单独的实验。为了估计细胞的侵袭性质，我们测量了在22小时时间内穿越基质胶膜的细胞的数目。在基质胶膜上观察到相同数目的AT3-T和AT3M细胞，表明了2个细胞系同样能够侵入该膜(图6)。虽然与克隆AT3-M相比，在对照膜上观察到较高数目的克隆AT3-T的细胞，但是这些研究仍表示更似上皮的AT3-T细胞具有与AT3-M细胞类似的运动性和侵袭潜力。如图6所示，AT3-M和AT3-T细胞显示类似的体外迁移。
为了评价体内侵袭，针对转移灶的存在研究了来自带有AT3-M和AT3-T肿瘤的20只动物的肺。在任何肺中未观察到肉眼可见的转移性结节，这可能是由于当肿瘤达到特定大小便用于动物的处死方案而非使用存活作为终点所致。通过落射荧光显微术，检查了来自Gint报道基因的GFP表达以评价微转移的存在。为了确保全面评价，研究了每个肺的7-8个等距的切片(每个克隆共150个切片)。通过GFP荧光，接着将切片用苏木素伊红复染，测定转移灶的存在(图7)。图7A表示(上部分)显示转移灶中克隆AT3-T的预期模式(即GFP+，DsRED+)的切片的实例，(下部分)显示转移灶中显示克隆AT3-T的可塑性模式(即GFP+，DsRED-)的切片的实例。图7B显示(上部分)转移灶中显示克隆AT3-M的预期模式(即GFP+，DsRED-)的切片的实例，(下部分)显示转移灶中克隆AT3-M的可塑性模式(即GFP+，DsRED+)的切片的实例。如图7所示，在患有来自AT3T或AT3-M克隆(用GFP和pRIIIcI2报道基因稳定转染)的肿瘤的动物肺中的转移灶具有可塑性的证据。对于克隆AT3-M在10个肺中有7个肺发现转移灶，对于克隆AT3-T，10个肺中6个有转移灶。
使用GFP和DsRED报道基因的综合输出对转移灶可塑性的评价，在以下两个克隆的情况下显示可塑性转化灶(对于AT3-M为DsRED+，对于AT3-T为DsRED-)：对克隆AT3-T，12个中有3个，对于克隆AT3-M，16个中有13个(图7)。这些研究表明AT3-M细胞的表型可塑性，并且针对AT3-T细胞提示表型可塑性。重要的是，2个细胞系是转移性的，尽管原始上皮相对于间充质表型有差异。
癌细胞的可塑性和转移性行为。间充质AT3-M和更似上皮的AT3-T细胞两者有效地转移。然而，转移的驱动器在这两种细胞中可能不同。AT3-M和AT3-T克隆之间的基因表达比较显示至少一种令人感兴趣的可能性：微阵列分析显示与AT3-M相比，在AT3-T中连接粘附分子C (JAM-C)的表达增加12倍，这得到RT-PCR和免疫印迹分析的证实。JAM存在于白细胞中和上皮与内皮细胞的紧密连接处，并显示参与单核细胞的跨内皮迁移。JAM-C在几个具有高转移性潜力的细胞系中表达，且在HT1080人纤维肉瘤系中该分子的敲减显著降低其体内转移性质。而且，JAM-C还存在于与同限定克隆AT3-T的基因有明显重叠的干细胞性相关的基因集。因此克隆AT3-T，通过不同粘附分子的过量表达可获得转移能力。另外，与更似间充质的AT3-M细胞相比，下游Hedgehog途径效应物GLI3的过量表达可在更似上皮和干细胞样AT3-T细胞中显著上调。在几个肿瘤类型中，Hedgehog信号转导与EMT、干细胞性和转移/侵略性有关，因此在这些细胞系中差异表达或发育程序的调节可成为这些表型差异的基础。Patched (一种Hedgehog途径组分)的表达增加，在不依赖于雄激素的进展期间与前列腺肿瘤有关，并且在患有转移性去势抵抗性前列腺癌的男性的循环肿瘤细胞中。
实施例6. AT3-T细胞显示干细胞样基因表达特征
AT3-T细胞有时形成类似于原生质球(protosphere)的紧密聚簇。虽然球体形成不是干细胞的唯一性质，但是它与许多不同系统的干细胞性有关。鉴于这些观察结果及AT3-T和AT3-M细胞的高致瘤性，针对与癌干细胞样细胞有关的标志物的表达对它们进行测试。还包括亲本AT3细胞和另一个Dunning肿瘤细胞系，DT细胞，其显示上皮标志物，且在哥本哈根白鼠中仅是弱致瘤的。DT细胞表达极低水平的CD44和CD133，它与高度恶性的癌干细胞样细胞有关(图8)。只有当加载4倍的裂解物时，在DT裂解物中才可检出CD133。与DT细胞相比，间充质样AT3细胞表达水平高得多的CD44和CD133两者(注意图8A中DT样品的泳道过载)，这与EMT诱导乳腺上皮癌细胞中的干细胞性的最新报道一致。图8A显示将含连续两倍稀释的全细胞裂解物的膜切成两半并针对CD133 (上部分)或β-肌动蛋白(下部分)进行免疫印迹法。大小标志物的单位为kDa。标注仅在DT裂解物中可重复检出的更快迁移的CD133带(*)，表明了可能的翻译后调节。图8B显示将含连续两倍稀释的全细胞裂解物的膜切成两半并针对CD44 (上部分)或β-肌动蛋白(下部分)进行免疫印迹法。显示了来自两组独立裂解物的代表性印迹。AT3-T表达CD44和CD133。引人关注的是，AT3-T细胞比更似间充质的AT3-M表达总体较高水平的CD44和CD133。而且，当与AT3-M细胞相比时，AT3-T细胞表达较高比率的CD44H/CD44E。CD44H同种型与恶性肿瘤有关，而CD44E与之无关。这就表明在上皮转化和干细胞样性质的获得性之间更复杂的关系。与干细胞样标志物的表达一致，AT3-M和AT3-T细胞两者在软琼脂中形成集落，当注射入哥本哈根白鼠中时形成肿瘤，这些肿瘤导致类似于亲本AT3细胞的广泛转移(图3B)。
为了进一步探索转化与干细胞性之间的这些关联，比较了AT3-M和AT3-T细胞中的整体基因表达。该分析显示在这两种细胞中，422个基因差异性表达(≥ 2倍；p-值< 0.05) (表3)。相对于AT3-M，在AT3-T中上调的许多基因在上皮细胞中优先表达，并且对于在间充质细胞中优先表达的那些基因反之亦然(表4)。然而也有例外。基因解联蛋白样和金属蛋白酶的表达与间充质表型一致，但是与AT3-M相比，这种mRNA水平在AT3-T中高4倍。与AT3-M相比，通常与上皮样细胞有关的整联蛋白β-4在AT3-T中的表达低3倍。这些观察结果与AT3-T细胞的显示比AT3-M细胞更似上皮的特征和处于中间表型状态的特征一致。
表3
表4. 在克隆AT3-T和AT3-M的表达数据分析中上皮或间充质基因的实例。
装配了2个基因集：一个由在AT3-T中上调(相对于AT3-M)的基因产物组成，第二个是在AT3-T中下调(相对于AT3-M)的那些。针对与Molecular Signature Database合集(基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) http://www.broad.mit.edu/gsea/)的5,452个基因集的重叠，对两个基因集进行比较。通过基因集富集分析(GSEA)，针对与来自Molecular Signature Database合集的5,452个基因集的重叠，相对于AT3-M在AT3-T中过量表达的基因的分析不显示与EMT或MET有关的集的任何显著富集。在这一方面，AT3-M和AT3-T两者类似于间充质样的亲本AT3系。在AT3-T中过量表达的基因的15个最显著的重叠中，有在造血干细胞(p = 3.24 x 10-8)、神经干细胞(p = 3.07 x 10-7)和胎鼠干细胞(p = 5.14 x 10-6)中激活的3个基因集(表5)，而在AT3-T细胞中相对下调的基因的20个最显著的重叠中是与成熟细胞类型发育有关的2个基因集。发现与AT3-M细胞相比，下游hedgehog途径效应物GLl3的表达在AT3-T细胞中为3.4倍过量表达，表明了前列腺癌中的这种发育/干细胞性途径的调节在EMT/MET期间可受基础性表型状态约束，与其它肿瘤中报道的类似。这些数据表明，AT3-T细胞具有类似于干细胞的基因表达概况，而且根据CD44和CD133蛋白表达的分析，表明与更似间充质的AT3-M细胞相比，AT3-T细胞以更似干细胞样的状态存在。
表5
上皮可塑性和干细胞样行为。已充分认识到，经诱导进行EMT的细胞激活干细胞途径。本文提供的研究显示，朝着更似上皮状态转化(即参与MET)的AT3细胞，也激活干细胞样标志物的表达。该结果表明可塑性和干细胞样特征或干细胞性之间更广阔的关系，这利用吉布斯自由能图建模(图9)。图9显示比较干细胞样特征和上皮-间充质表型的模型。x轴表示上皮至间充质表型的谱，y轴表示细胞的干细胞样特征。左箭头表示EMT，右箭头表示MET。模型假设在细胞沿上皮和间充质x轴来回转化时，它们在不同干细胞性的状态中流动，该性质在上皮和间充质表型之间的中间状态达到峰值。不同状态的数目和状态间的屏障的确切高度是推测的，并不意味着是呈比例的。显示了两种表型转化，第一种是部分EMT (左箭头)，第二种是部分MET (右箭头)。这两种转化产生具有较高干细胞样特征的状态。应注意，该模型还预测一些EMT以及同样地一些MET将导致干细胞性减弱，实际上，这在诱导高侵略性的人DKAT基础类型乳腺癌细胞系进行EMT时观察到(N. D'Amato和V. Seewaldt，个人通信)。该模型还提出干细胞性、可塑性和转移倾向之间的联系，或许通过某些致癌途径(例如PI3激酶/Akt)和发育途径的激活来解释。
该模型还预测具有最大干细胞性质的细胞(根据定义其将是高度恶性的)，应显示上皮和间充质性状两者，因为它们占据上皮间充质轴上的中间状态。高度恶性的大鼠腺癌AT3-T细胞是呈这种状态的类型。重要的是，在患有转移性乳腺癌和前列腺癌的人中，许多CTC也以这些中间状态存在。这些细胞与疾病进展相关，被认为是高度侵略性的。富含CTC的细胞群表达编码间充质标志物的RNA；然而，数据不表明上皮和间充质标志物是否在同一细胞中共表达。中间状态的细胞的另一个临床实例存在于肉瘤样肾细胞癌中，其显示共表达上皮标志物例如上皮膜抗原和间充质抗原像波形蛋白。然而，这些肿瘤尽管极少(1-8%的肾肿瘤)，但是高度侵略性的，并难以治疗。类似情况也存在于前列腺和乳腺两者的癌肉瘤中，是高度侵略性的，极少肿瘤具有混合的上皮和间充质组分，但是同种细胞来源的。不完全清楚这些肿瘤中的单细胞是否共表达上皮和间充质标志物，并因此真正处于中间状态。
最后，模型表明，在肉瘤进行MET时，它们将激活干细胞样途径，并变得更有侵略性。实际上，有许多在紧密相邻处具有混合的上皮和间充质组分的肉瘤的描述，如在一些滑液肉瘤和骨肉瘤中观察到的。新的遗传限定的软组织肉瘤小鼠模型可阐明这些肿瘤的进展中细胞中间细胞状态的存在和意义。
实施例7. 人循环肿瘤细胞中的表型可塑性
上述实验表明占据中间表型状态的Dunning大鼠前列腺腺癌细胞是致瘤的，转移的，并具有干细胞样抗原和细胞程序。为了研究类似的移行细胞是否可在人类癌症中起作用，检查自患有转移性去势抵抗进行性前列腺癌(CRPC)的男性或进行性转移性乳腺癌(mBC)的女性的血液分离的癌细胞。鉴于这些细胞可能在转移之前和转移定居期间处于循环中，因此循环肿瘤细胞(CTC)表示理想的组织来源以研究体内这种可塑性的证据。CTC在多种上皮恶性肿瘤(包括乳腺和前列腺癌)中具有独立的预后和预测意义。可针对与癌症生物学有关的各种生物标志物，收集、分离和分析这些细胞。
测试了通过FDA批准的靶向EpCAM (上皮细胞粘附分子)的铁磁抗体俘获的CTC群内是否有发现移行细胞的高度可能性。通过免疫荧光，针对CD45的表达(在许多白细胞中的表达；图10A)、细胞角蛋白(CK；上皮标志物)和波形蛋白(间充质标志物)研究了这些细胞。CTC定义为CD45阴性和CK阳性有核完整细胞(图10B)，转化的CTC如果另外共表达波形蛋白则如此定义(图10C-D)。图10显示来自上皮和间充质标志物染色阳性的前列腺腺癌患者的CTC。使用用Alexa 647标记的抗CD45抗体、用Alexa 555标记的抗细胞角蛋白(CK)抗体和用Alexa 488标记的抗波形蛋白抗体，进行三重染色。核用DAPI标记。图10A显示来自人外周血单核细胞样品的白细胞的实例：CD45 (+)、CK (-)和波形蛋白(+)。另外，观察到CD45 (+)、CK (-)和波形蛋白(-)细胞。图10B显示来自转移性乳腺癌患者的CD45 (-)、CK (+)和波形蛋白(-)细胞的实例。所述细胞在表6中作为波形蛋白(-) CTC计数。图10C显示来自转移性乳腺癌患者的CD45 (-)、CK (+)、波形蛋白(+)的实例。所述细胞在表6中作为波形蛋白(+) CTC计数。图10D显示来自患有转移性进行性去势抵抗性前列腺癌的患者的CD45 (-)、CK (+)、波形蛋白(+)的实例。所述细胞在表6中作为波形蛋白(+) CTC计数。
转化的CTC在CTC计数升高(≥5 CTC/7.5 mL，通过标准测试)的许多患者中共表达波形蛋白和CK (表6，图10)。实际上，在9名患有进行性转移性CRPC的患者和8名患有进行性mBC的患者中，发现约75% (范围0-100%，CRPC中为85.5%，mBC中为54%)的CTC针对CK和波形蛋白两者染色(图10C-D)，表明了转化表型。这些数据表明在患有转移性乳腺和前列腺癌的患者中循环肿瘤细胞共表达上皮(EpCAM和细胞角蛋白)和间充质(波形蛋白)标志物，因此以转化的表型状态存在，与我们的临床前模型中所观察到的类似。
表6. 患有转移性去势抵抗性前列腺或转移性乳腺癌的患者中循环肿瘤细胞(CTC)计数和波形蛋白表达。
*第2栏表示每个受试者的CTC计数，如通过基于标准Cellsearch EpCAM的方法测定，而第3栏表示发现表达细胞角蛋白和共表达波形蛋白的手工计数的CTC的数目和比例，以比率和百分比表示。
可塑性和CTC。在有效的患者样品子集的CTC中可塑性的鉴定提供了几个重要的临床机会。可塑性的表现在患有转移性癌症(尤其在针对可塑性显示有效范围的值的mBC)的患者中可具有预后或预测价值。因此，具有极高可塑性的患者亚群可具有更为侵略性的自然史，并对全身治疗显示更大的抗性。就诊断和作为预测生物标志物的实用性而言，数据表明除表达上皮和间充质标志物两者的细胞以外，还可有未知数目的进一步向间充质极移动且是EpCAM阴性的CTC。通过FDA批准的CELLSEARCH®系统以及通过Adna Test (AdnaGen AG)系统和现有的微流体技术(其通过表达MUC1或EpCAM的细胞的免疫吸附富集CTC)将遗漏这些细胞。实际上，乳腺癌的最新研究表明，过量表达EMT和干细胞抗原(CD44+，CD24-)两者的“正常”类型乳腺癌细胞系可能缺乏EpCAM，因此通过目前已批准的CTC检测系统是不可检出的。因此在转移性癌症患者中CTC的数目大大高于目前已认知到的是可能的。与目前已测定的CTC计数相比，该额外的CTC亚群的鉴定可提供更大的预后价值，以及较早检出CTC和患有前期疾病的患者的转移性潜力。
此外，中间状态中的CTC，其包含50-75%的本文从患有转移性乳腺和前列腺癌的患者分离的细胞以及因为进行更完全的EMT所以未能检出的那些细胞，表示治疗问题。已充分证实了，EMT改变肺癌细胞的药物敏感性，对具有干细胞样性质的癌细胞的直接疗法具有挑战性，或许是由其对进行细胞凋亡的反抗所致。
虽然最新研究表明筛选方法和实际的化合物(例如盐霉素)两者可选择性靶向癌干细胞，但是这些侵略性的细胞仍代表了难以克服的治疗挑战。因此，包含对本文所述EMT生物标志物具有结合特异性并与抗癌剂连接的结合剂的分子提供额外的治疗选择。
实施例8. 来自患有转移性乳腺和前列腺癌的患者的CTC表达波形蛋白和N-钙黏着蛋白
合格的男性患有进行性转移性CRPC (进展，尽管睾酮< 50 ng/dL)，并且即将开始新的全身疗法。合格的女性患有进行性转移性乳腺癌(mBC)，并且即将开始新的全身疗法。表7中提供患者(n = 29)的基线性质。
表7. 患者(n = 29)的基线性质
将CTC抽入标准FDA批准的Cellsave管中，在48小时内使用基于EpCAM的铁磁俘获的CELLSEARCH®方法处理。CTC定义为表达泛CK和缺乏白细胞抗原CD45表达的完整有核(DAPI+)细胞，并采用标准方法计数。收集第二CELLSEARCH®管，并利用EpCAM俘获处理，针对用Alexa 555标记的CK (IgG1, AbD Serotec)、用Alexa 647标记的CD45 (IgG1, AbCam)和使用用Alexa 488免疫荧光标记的波形蛋白(IgG1，BD Biosciences)或N-钙黏着蛋白(IgG1，DAKO)，使分离的细胞染色。从第二管手工评价的CTC的总数，计算针对EMT抗原的CTC染色阳性的比例。使用American Red Cross来源的PBMC的阳性对照(CD45)、PC3前列腺癌细胞(波形蛋白、N-钙黏着蛋白)和T47D乳腺癌细胞(CK)用于各标志物。使用模拟物抗体的阴性对照用于使各抗原的染色/评分最优化。
表8和表9分别提供CTC中的波形蛋白和CK共表达的发生率及CTC中N-钙黏着蛋白和CK共表达的发生率。在17/20名(85%)患有mCRPC或mBC的患者和78%的全部CTC中检出波形蛋白共表达。在8/9名(89%)患者和81%的CTC中检出N-钙黏着蛋白共表达。图11中显示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像(A，白细胞；B，波形蛋白阴性CTC (CRPC)；C，波形蛋白阳性CTC (BC)；和D，波形蛋白阳性CTC (CRPC))。图12显示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像(A，白细胞；B，Ncad阳性CTC (BC)；C，Ncad阴性CTC (BC)；和D，两个NCad阳性CTC (箭头)和1个Ncad阴性CTC (CRPC))。图13中显示来自mCRPC和mBC患者的CTC的免疫荧光图像(A，相差显微术/DAPI；B，CD45/DAPI；C，CK/DAPI；D，患有mCRPC的男性中波形蛋白/DAPI阳性；E，相差显微术/DAPI；F，CD45/DAPI；G，CK/DAPI；和H，患有mCRPC的第二名男性中波形蛋白/DAPI阴性)。
数据显示在来自患有转移性CRPC的男性和患有转移性乳腺癌的女性的CTC中细胞角蛋白与EMT抗原波形蛋白和N-钙黏着蛋白共表达。通过免疫荧光标记，大部分所检查的CTC共表达CK和EMT蛋白。该研究中大部分患者具有共表达波形蛋白或N-钙黏着蛋白的CTC，表明了在转移期间潜在的上皮可塑性。数据表明CTC可能缺乏上皮标志物，并提供用于评价患有乳腺和前列腺癌的患者以及用于最佳检测其它常见恶性肿瘤中的循环肿瘤细胞的方法。
表8
表9
*自基线(无介入疗法)之前3个月的计数
**自2号时间点的计数
在测试转化CTC存在的第二个试验中，从31名患有mCRPC的男性和16名患有mBC的女性(参见表10和表11中患者基线性质)中采集血液。CTC采用基于CELLSEARCH® EpCAM的免疫俘获方法处理，并通过免疫荧光(IF)针对CD45 (PTPRC) (白细胞标志物)、细胞角蛋白(CK) (上皮标志物)、波形蛋白(VIM)和N-钙黏着蛋白(CDH2) (间充质标志物)及CD133 (干细胞标志物)的表达，分析概况(表2)。白细胞定义为有核(DAPI阳性)、CD45阳性和CK阴性细胞，而CTC定义为有核(DAPI阳性)、CD45阴性和CK阳性细胞。在CTC中，我们鉴定移行细胞为另外表达波形蛋白或N-钙黏着蛋白的细胞。
表10. 患有转移性CPRC的男性的基线人口统计学和临床性质。
1 PSA：前列腺特异性抗原。
2 疼痛以线性模拟量表进行评分(0-10范围)。
表11. mBC患者的基线性质。
在患有mCRPC的10名男性中，在10/10 (100%)患者中CTC共表达波形蛋白和CK，根据该标准，108/126 (86%)的计数CTC是转化的(表12，图14)。在CTC收集的一周内对这些患者的2人中进行的骨转移活检显示在CK阳性肿瘤灶中无波形蛋白表达，但在缺乏CK表达的周围骨基质中有强的波形蛋白表达。这些相同的患者具有在与CT引导的肿瘤活检同一时间采集的CTC，所述CTC普遍表达共表达的CK和波形蛋白。这些研究结果与通过随后进行MET的转化CTC的侵袭和转移一致；或者，与CTC表达类似，波形蛋白表达可在转移物中异源表达。
表12. 患有转移性CRPC的患者中的循环肿瘤细胞(CTC)和转化的CTC
i 中栏表示各受试者CTC的来自FDA批准的CELLSEARCH®计数法的CTC计数。
ii 右栏表示在人工计数的CTC总数中，表达波形蛋白(指定个体中范围为60-100%的细胞的波形蛋白的共表达，且与CTC计数无关(R2=0.11))、N-钙黏着蛋白(指定个体中范围为55-100%的细胞的N-钙黏着蛋白的共表达，且与CTC计数无关(R2=-0.09))或CD133 (指定个体中范围为55-100%的可评价细胞的CD133的共表达，且与CTC数无关(R2=0.04))的CTC的比率。CTC定义为缺乏CD45表达和表达细胞角蛋白的完整DAPI阳性(有核)细胞。
表13. mBC患者中的CTC和转化的CTC
在下一组10名患有mCRPC的男性中，10/10 (100%)患者中CTC共表达N-钙黏着蛋白和CK，根据该标准，167/206 (81%)的CTC被鉴定为转化的(表12，图15)。在10名患有mBC的女性中，9人具有可检测CTC，且这些当中，我们发现了7名(78%)患者中波形蛋白共表达的证据，且总体55/88 CTC (63%)共表达波形蛋白(表13，图14)。在另外的具有可检测CTC和mBC的6名女性中，4人具有CK和N-钙黏着蛋白共表达的证据，总体78/95 CTC (82%)具有N-钙黏着蛋白表达，在指定个体中具有明显的表达异质性(表13，图15)。这些数据表明，mBC和mCRPC患者中的许多CTC共表达上皮(EpCAM和细胞角蛋白)和间充质(波形蛋白、N-钙黏着蛋白)标志物，因此以转化的表型状态存在，与我们的临床前模型中所发现的类似。
鉴于转化的AT3-T细胞中干细胞相关抗原CD133的表达，评价了来自患有mCRPC的男性的CTC的CD133表达。CD133在11/11 (100%)具有CTC的男性和在154/180 (86%)来自这些男性的CTC中表达(表12，图16)。这些数据表明来自患有常见的上皮性恶性肿瘤的患者的CTC处于转化状态，其特征在于上皮和间充质标志物以及CD133(这些生物标志物与干细胞样性质、侵袭和化学抗性有关)共表达。
实施例9. CTC分离
抗体选择。对于细胞俘获，使用阳性对照(PC3)和阴性对照(LNCaP)细胞系测试针对OB-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白的胞外结构域的几个抗体，并通过流式细胞术分析。选择在PC3细胞中具有最高信号和具有LNCaP细胞的最小背景的抗体用于与磁性颗粒缀合。采用与前述方法类似的程序，使抗OB-钙黏着蛋白抗体(R&D Systems，克隆283416)和抗N-钙黏着蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，D-4)与磁性颗粒缀合(Allard等(2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904；另参见美国专利号6,645,731)。
间充质俘获测定法。将间充质俘获测定法与CELLSEARCH®平台(Veridex LLC)一起使用，包括用于样品制备的CELLTRACKS® AUTOPREP®和用于俘获细胞分析的CELLTRACKS ANALYZER II® (Allard等(2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904)。间充质俘获测定法包括用抗OB-钙黏着蛋白抗体或抗N-钙黏着蛋白抗体包被的铁磁流体以产生俘获试剂(其可免疫磁性地富集间充质细胞)和染色试剂，例如与β-联蛋白结合的藻红蛋白(PE)缀合抗体(来自Cell Signaling Technology, Inc.的克隆L54E2)；与别藻蓝蛋白(APC)缀合的CD45的抗体；和核染料4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以荧光标记细胞。该测定法包括洗涤、透化和重新悬浮细胞的缓冲液，例如来自CELLSEARCH®试剂盒的下列组分：俘获改进试剂、透化试剂、细胞固定剂和稀释缓冲液。
样品制备。采用间充质俘获测定法，将7.5 mL血液转移到15 mL CELLTRACKS® AUTOPREP®样品管中，与6.5 mL稀释缓冲液混合，以800 g离心10分钟，然后置于CELLTRACKS® AUTOPREP® (Veridex LLC)中用于自动样品制备。在用仪器吸出血浆和缓冲液层后，加入铁磁流体。在孵育期和随后的磁性分离后，吸出未结合的细胞和剩余的血浆。使用CELLTRACKS® AUTOPREP®在MAGNEST® Cell Presentation Device (Veridex LLC)中，富集靶细胞，荧光标记，并重新悬浮。由MAGNEST®装置产生的磁场引起磁性标记的细胞均匀分布在盒体的分析表面用于使用CELLTRACKS ANALYZER II®分析。
样品分析。在铁磁抗体俘获后，加入染色试剂连同透化缓冲液以荧光标记免疫磁性富集的细胞。细胞用标记的抗β-联蛋白抗体、标记的抗CD45抗体和DAPI染色用于显现。使用抗β-联蛋白抗体鉴定间充质CTC。在系统中孵育后，重复磁性分离，抽吸过量的染色试剂。在最后的处理步骤中，将细胞重新悬浮于MAGNEST®装置中，其包括一室和引导免疫磁性标记的细胞的2个磁体用于使用CELLTRACKS ANALYZER II®的分析。
将MAGNEST®置于CELLTRACKS ANALYZER II®中，一种四色半自动化荧光显微镜。拍摄涵盖4个荧光滤光片立方各自的盒体整个表面的图像帧。在同一帧中含有PE以及DAPI阳性事件的拍摄图像以网络激活浏览器画廊(web-enabled browser gallery)呈现用于根据细胞荧光和形态学对事件分类。由操作者做出细胞的最终选择。将对象归类为间充质细胞(命名为“事件”)的标准包括大致为椭圆形态、大于4 µm的具有可见核(DAPI阳性)、对抗β-联蛋白-PE阳性染色、对抗CD45-APC阴性染色的完整细胞，如图17所示。细胞计数的结果表示为细胞数/7.5 mL血液。
根据我们的初步数据，即β-联蛋白在肿瘤细胞中观察到但未在白细胞观察到，如图18所示，采用该测定法的分离的“CTC”定义为β-联蛋白阳性、CD45阴性、有核完整细胞。相比之下，50-75%的EpCAM-俘获CTC针对β-联蛋白染色，如图19所示(Bitting等(2012) J Clin Oncol 30S:abstr 10533)。使用OB-钙黏着蛋白抗体或N-钙黏着蛋白抗体铁磁流体以俘获具有阳性β-联蛋白表达、缺乏CD45表达和阳性核DAPI染色以表征细胞的CTC，测定间充质CTC表型。
为了确定符合上述标准的循环间充质样肿瘤细胞是否存在于健康个体中，从年龄在18岁以上的健康成人中抽取血液到10 mL EDTA管中。如果受试者患有需要药物的任何慢性医学病况或癌症史，则他们不合格。如上所述，在血液采集的8小时内处理样品。所有受试者采用机构评审委员会批准的方案招募，并提供知情同意。在健康志愿者中检出OB-钙黏着蛋白俘获的β-联蛋白阳性事件(“罕见事件”)。在健康志愿者中鉴定的罕见事件如前所述用内皮标志物CD31 (BD Biosciences，克隆WM59)染色以进一步表征(Pusztaszeri等(2006) J Histochem Cytochem 54:385-395)。健康志愿者中所检出的全部事件均是CD31阳性，这表明了这些细胞可表示内皮细胞。健康个体中OB-钙黏着蛋白俘获的β-联蛋白阳性和CD31阳性事件的实例见图20。
在确立用于在健康志愿者中检测的阈值(如果包括CD31作为另外的表征标志物，则为零个OB-钙黏着蛋白、β-联蛋白阳性细胞)后，在开始新的全身疗法之前，在相关临床抽血研究中招募的患有进行性转移性CRPC的男性中测定这些细胞事件的发生率。参见表14。该群大部分由有骨转移的男性组成(>90%)，因此在理论上可富集OB-钙黏着蛋白阳性细胞，如存在的话。
表14
在基线、在治疗周期3和在进展时收集1个CELLSAVE®和2个EDTA 10 mL管血液。EDTA管中获得的血液用于一式两份的OB-钙黏着蛋白俘获，并尽可能快地处理，在采集时间过去不超过8小时。按照已确立的方案(Allard等(2004) Clin Cancer Res 10:6897-6904)，在CELLSAVE®管中获得的血液仅用于标准EpCAM俘获，并在72小时内处理。采用CELLSEARCH®系统，如上所述将循环间充质细胞用抗OB-钙黏着蛋白铁磁流体俘获，然后透化，并染色用于进一步表征。对每7.5 mL血液进行细胞计数，将间充质CTC计数与基于标准EpCAM的俘获方法进行比较。通过在两位独立评审者之间讨论消除事件评分中的任何偏差。
基于EpCAM的俘获测定法在大多数患者中检出较多的肿瘤细胞，然而有例外，其中观察到较多间充质事件。此外，OB-钙黏着蛋白俘获导致每个视野比EpCAM俘获更多的细胞片或块和多种细胞，如图22所示。
如表15所示，采用间充质俘获方法，在健康志愿者中检出罕见事件。在CRPC患者中，与基于EpCAM的俘获相比，OB-钙黏着蛋白俘获(“O-cad俘获”)在5名受试者的3名中检出更多事件，并且大多数俘获细胞为细胞角蛋白阴性。
表15.
表16显示使用N-钙黏着蛋白(“N-cad”)和OB-钙黏着蛋白(“O-cad”)铁磁流体，来自CRPC患者的血液中俘获细胞的事件。与基于EpCAM的技术相比，从CRPC患者俘获的细胞数在一些患者中显得较高，且对于至少OB-钙黏着蛋白俘获，检测率显得比一些健康志愿者中的检测率高。
表16.
实施例10
为了验证使用抗OB-钙黏着蛋白抗体的间充质俘获测定法可分离和检测目标细胞，进行了阳性和阴性对照细胞的掺入研究(spiking studies)。通过免疫荧光和流式细胞术两者，研究前列腺癌PC-3细胞系中OB-钙黏着蛋白表达的初步数据显示，在约40-50%的PC3细胞中OB-钙黏着蛋白表达，如图23所示。
在含有补充10%胎牛血清的DMEM高葡萄糖的培养瓶中培养前列腺癌细胞系PC-3，随后按照包装说明书使用细胞解离液(Gibco目录号13150-016)收获。在血细胞计数器中对细胞计数，将500或1,000个细胞掺入如上所述获自健康志愿者的7.5 mL血液中。使用OB-钙黏着蛋白俘获回收中位值为31.4% (范围16.1-103.4，n=13)的掺入细胞，并如上所述表征为β-联蛋白阳性、CD45阴性细胞。
间充质表型CTC的收集未解决细胞事件不是癌细胞而是宿主细胞的可能性。例如，在健康志愿者中，OB-钙黏着蛋白阳性细胞最可能是来源于放血的内皮细胞，因为它们是CD31阳性。在患有转移性CRPC (mCRPC)的男性中，这些OB-钙黏着蛋白阳性细胞可能是内皮或循环成骨细胞、骨髓来源的间充质细胞或表达OB-钙黏着蛋白的其它循环间充质样细胞。为了确定来自患者的OB-钙黏着蛋白俘获事件的意义和这些细胞事件是表示宿主细胞还是前列腺癌细胞，针对前列腺癌特异性基因组事件进行了DNA荧光原位杂交(FISH)。如上所述采用CELLTRACKS ANALYZER II®鉴定细胞事件，然后并在盒体上固定和干燥用于DNA FISH。如前所述(Attard等(2009) Cancer Res 69:2912-2918)，使用用于雄激素受体(AR)扩增、PTEN丢失的4色FISH测定法和涉及TMPRSS2-ERG基因座的基因融合(ERG分离测定法)，针对这些前列腺癌特异性变化评价俘获的间充质细胞。如图24所示，AR扩增和TMPRSS2-ERG融合存在于EpCAM和OB-钙黏着蛋白俘获细胞两者中，表明了这些细胞事件是肿瘤来源的。
因为这些基因组扩增或缺失事件不可能存在于正常组织中，并且存在于EpCAM阳性细胞中，这些研究结果表明OB-钙黏着蛋白、β-联蛋白阳性细胞的至少一些是前列腺癌来源的，且不来源于肿瘤微环境或正常宿主细胞。在患有mCRPC和其它肿瘤类型的男性的更多人群中这些间充质表型CTC的发生率的进一步分析表明，该测定法补充现有的CTC测定法的有用性。这些分析可包括与基于EpCAM的方法的比较，特别在尽管进行性转移性疾病但具有低CTC计数的男性中，以限定OB-钙黏着蛋白阳性事件的临床实用性。另外，OB-钙黏着蛋白阳性细胞事件与临床和病理性质和用全身性疗法的患者结局的相关性进一步限定该测定法在其它预后生物标志物的情况下的独立作用。这些方法和数据表明，这些细胞在患有mCRPC的男性中是可检出的，在健康志愿者中不存在，且所公开的方法在血液中检出OB-钙黏着蛋白阳性人前列腺癌细胞。
CTC中OB-钙黏着蛋白的普遍表达表明骨拟态(osteomimicry)，并提供大致了解前列腺癌归巢至骨和成骨细胞性骨转移发生的机制。健康志愿者中的OB-钙黏着蛋白事件不均匀地表达内皮标志物CD31，而癌症患者中的CD31状态是更可变的。其它标志物可用来证实这些间充质样细胞是肿瘤细胞(例如FISH、细胞角蛋白、PSA)。
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