一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，包括盒体，盒体内置8个下凹瓶位，8瓶设有密封盖试剂瓶、一块腮腺炎包被酶标反应板及三张封板膜，其中所述的8个下凹瓶位内分别相应放置样本稀释液、酶标记物、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、阳性对照、阴性对照和终止液各一瓶。本发明提供的一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒与德国EUROIMMUNMedizinischeLabordiagnostikaAG的一致性高，灵敏度为96.67%，特异性为96.67%，因此具有十分广阔的应用前景。
【专利说明】一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶联检测试剂盒及其用途，具体说，是设计一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，属生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]腮腺炎分为细菌性和传染性两种。本试剂盒检测的为病毒性腮腺炎通常称为流行性腮腺炎，是由腮腺炎病毒侵犯腮腺引起的急性呼吸道传染病，一年四季均可发病，但以冬春两季多见。较多发生于幼儿或少年时期有传染接触史，以4至15岁儿童发病率较高，成人发病症状往往较儿童为重。可双侧或单侧受累，白细胞不但不增高反而减低或正常，局部症状和化脓性差不多，但没有化脓。一次得病之后，可有持久的免疫力。腮腺的非化脓性肿胀疼痛为突出的病征，病毒可侵犯各种腺组织或神经系统及肝、肾、心、关节等几乎所有的器官。因此，常可引起脑膜脑炎、心肌病、睾丸炎、胰腺炎、乳腺炎、卵巢炎等并发症。
[0003]腿腺炎病毒(paramyxovirus parotitis)与副流感、新城、麻疫、呼吸道合胞病毒等病毒同属于副粘液病毒，系核糖核酸(RNA)型,病毒直径约为85?300nm,平均140nm。对物理化学因素的作用均甚敏感。该病毒只有人类中发现，但可在猴、鸡胚羊膜和各种人和猴的组织培养中增殖。猴对本病最易感。该病毒只有一种血清型。腮腺炎病毒的核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)具有可溶性抗原(S抗原),其外层表面含有神经氨酸酶(neuraminidase)和一种血凝素糖蛋白(hemagglutinin glycoprotein)具有病毒抗原(V抗原)。S抗原和V抗原各有其相应的抗体。S抗体于起病后第7d即出现，并于二周内达高峰，以后逐渐降低，可保持6?12个月，可用补体结合方法测得，S抗体无保护性。V抗体出现较晚，起病2?3周时才能测得，I?2周后达高峰，但存在时间长久,可用补体结合,血凝抵制和中和抗体法检测，是检测免疫反应的最好指标，V抗体有保护作用。感染腮腺炎病毒后无论发病与否都能产生免疫反应，再次感染发病者很少见。于病程早期，可自唾液、血液、脑脊液、尿或甲状腺等分离出腮腺炎病毒。本病毒很少变异，各毒株间的抗原性均甚接近。
[0004]目前国内市场上腮腺炎病毒的各种免疫检测试剂盒质量参差不齐，既无统一的质量标准，又在无序生产与应用，给腮腺炎病毒的预防和检测造成严重障碍。目前虽有国外试剂商提供同类商品化检测试剂盒来用于检测，但是此种试剂盒的价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，包括盒体，盒体内置有8个下凹瓶位，8瓶设有密封盖的试剂瓶、一块酶标反应板3片封膜构成，所述试剂瓶内的试剂分别为:样本稀释液、酶标记物、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液、阴性对照和阳性对照，其中: 所述酶标反应板由1.5-2.0ug/ml腮腺炎病毒抗原包被；
所述样本稀释液为含10%牛血清白蛋白、PH7.4的磷酸盐缓冲液；
所述浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液；
所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的酶标羊抗人IgG多抗，稀释度1:10000-1:12000 ；
所述底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液；
所述底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液；
所述终止液为lmol/L硫酸溶液；
所述阴性对照为由阴性血清10ml，对照血清稀释液90ml ；
所述阳性对照为腮腺炎IgG抗体阳性血清。
[0007]作为进一步优先方案，所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
[0008]作为进一步优选方案，所述酶标反应板位于所述试剂瓶之前，所述封板膜与所述酶标板相邻；且所述酶标反应板的大小一致。
[0009]作为进一步优选方案，所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
[0010]作为进一步优选方案，所述酶标反应板上共设有96个微反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。
[0011]本发明提供的腮腺炎病毒酶联检测试剂盒具有较好的特异性，检测结果与德国EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG 的一致性高，灵敏度为 96.67%,特异性为96.67%，因此具有十分广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明提供的一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒的结构示意图；
图2为本发明提供的一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒中的96孔酶标板的结构示意图。
【具体实施方式】
[0013]以下结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
[0014]下面结合附图其实施例对本发明进一步详细说明。
实施例
[0015]如图1和图2所示，本发明提供的一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，包括盒体
(15)、盒体内置有8个下凹瓶位(4)、8瓶试剂瓶组、一块酶标反应板(I)三张封板膜(3)其中所述的8个下凹瓶位内分别相应放置装有样本稀释液(8)、酶标记物(11)、浓缩洗涤液(12 )、底物液A (9 )、底物液B (7 )、终止液(5 )、阴性对照(6 )、阳性对照(10 )各一瓶，所述酶标反应板位于所述试剂瓶之后，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致；所述酶标反应板包括支撑架(13)，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条(16);所述酶标反应板上共设有96个微反应孔(14)，且所述酶标反应板外设有封套(2)。
[0016]试剂盒的制备: (I)试剂
包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)=Na2CO3 1.5g,NaHCO3 2.9g、加双蒸水至1000ml,调至pH9.6 ；
样本稀释液(含10%牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.4)，PBS:由NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KCl 0.2g，卟啉 300 1ml，双蒸水至 1000ml,(缓慢搅匀直至溶解)调至PH7.4，即得；
封闭液:(10%小牛血清PBS溶液)小牛血清100ml XPBS (pH7.4) 900ml ；
浓缩洗涤液(PBST, ρΗ7.4):由 NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KCl0.2g、Tween200 5ml 加双蒸水至 1000ml,调至 pH7.4 ；
酶标记物(HRP*羊抗人IgG多抗):辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG多抗，稀释度1:10000-1:12000 ；
底物液A:由过氧化脲0.4g、柠檬酸2.lg、无水乙酸钠7.38g、丙三醇50ml加纯化水定溶至 1000ml (pH4.2)；
底物液B:由3，3，5，5-四甲基联苯胺0.4g、二甲基亚砜20ml、柠檬酸2.lg、丙三醇50ml加纯化水定溶至1000ml (ρΗ2.7)；
终止液:由硫酸52ml加纯化水定溶至1000ml (硫酸缓慢滴加并缓慢搅拌)；
阴性对照:由阴性血清10ml，对照血清稀释液90ml ；
阳性对照:腮腺炎IgG抗体阳性血清。
[0017](2)主要仪器
酶标仪:热电MK3，水浴锅，洗板机移液器ELISA反应板:厦门云鹏。
[0018](3)方法
酶标记物最适滴度的选择:
取96孔酶标板一块，用100ng/ml人IgGlOOul/孔4°C包被过夜，洗涤液洗板2次，350ul/孔，甩干；将酶标羊抗人IgG多抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，IOOul/孔，37°C孵育30min，后用洗板5次，350ul/孔，甩干；加底物显色，每孔加入底物A及底物B液体各50ul，37°C避光显色15分钟；后加入终止液50ul终止反应，在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值，取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标记物的最适滴度为 1:10000-1:12000。
[0019]选择包被抗原最适滴度:
取96孔酶标板一块，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔IOOul ;2-8°C过夜孵育18-22小时；弃去孔中包被液，洗涤液洗板2次，350ul/孔，拍干，将抗原包被板加150ulPBS稀释的10%小牛血清封闭液，2-8°C过夜孵育18-22小时。弃去封闭液，拍干，将已包被完成的抗原包被板置于干燥间干燥，干燥时间不得低于16小时，温度≤35°C，湿度(30%,最后封袋备用。
[0020]加按最适滴度稀释的酶标记，保温，洗涤。
[0021]加底物显色，加终止液终止反应后再酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值； 选择强阳性参考血清的A值为0.8-1.0间、阴性参考品血清的A值小于0.2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被腿腺炎病毒的稀释度为1.5-2.0ug/ml O
[0022]腮腺炎病毒包被反应板的制备方法:
取96孔聚苯乙烯酶标板一块；包被，以1.5-2.0ug/ml腿腺炎病毒抗原包被,每孔加入IOOul抗原包被液于酶标板孔中，置于2-8°C冰箱18-22小时；弃去孔中抗原包被液洗板2次拍干；洗板，用0.01mol/L的PBST洗涤液洗板2次拍干；封闭，每孔加入150ul含10%小牛血清封闭液置于2-8°C冰箱18-22小时；弃去孔中封闭液，拍干；干燥，将已包被完成的抗原包被板置于干燥间干燥，干燥时间不得低于16小时，温度≤35°C，湿度≤30%，得到抗原包被反应板。
[0023]腮腺炎病毒IgG检测试剂盒，由上述腮腺炎病毒包被反应板、样本稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物液A、底物液B、终止液、阴性对照、阳性对照构成。
[0024]具体分为:
样本稀释液为含10%牛血清白蛋白，PH7.4的磷酸盐缓冲液；
酶标反应板由1.5-2.0ug/ml腿腺炎病毒抗原包被；
浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液；
酶标记物为辣根过氧化物酶标记的酶标羊抗人IgG多抗，稀释度1:10000-1:12000 ； 底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液；
底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液；
终止液为lmol/L硫酸溶液；
所述阴性对照为由阴性血清10ml，对照血清稀释液90ml ；
所述阳性对照为腮腺炎IgG抗体阳性血清。
[0025]实施例2:利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中腮腺炎IgG抗体
1.实验前，将试剂盒从冰箱取出，室温放置30分钟后使用；
2.将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后使用；
3.每次试验设阳性对照、阴性对照各I孔，每孔加对照液IOOul;空白I孔(不加血清样品稀释液、样品和酶标抗体，只加底物A、B和终止液)；其余为样品孔，每孔加血清样品稀释液IOOul和样品Iul。贴上封口膜置37°C温育30分钟；
4.弃去孔中液体，拍干，每孔加洗涤液350ul，静置5~10秒钟后弃去，拍干，重复洗涤5次，拍干；
5.加入酶标记物IOOul，贴上封口膜，置37°C温育30分钟；
6.弃去孔中液体，拍干，每孔加洗涤液350ul，静置5~10秒钟后弃去，拍干，重复洗涤5次，拍干。
[0026]7.每孔滴加底物A、底物B各50ul，37°C避光显色15分钟；
8.加底物显色15分钟后，每孔立即加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。设定酶标仪波长450nm或双波长450nm/630nm。当使用单波长时，以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值；当使用双波长时,可以不设空白孔,用酶标仪直接读取450nm/630nm处的A值。注意:在终止反应15分钟内读数。
[0027]9.实验结果判定:
每个试验结果独立使用，通过(Cut off)值判定结果.计算临界值=Cut off (C.0) =0.15+阴性对照(NC) A值(当阴性对照A值小于0.05时按0.05计算；大于0.05时按实际值计算)
结果判定:标本A值〈临界值，则判为阴性。标本A值>临界值，则判为阳性。
[0028]特异性试验:
分别筛选HBsAg、HCVAb, HIVl+2Ab，TPAb, MVIgG，RVIgG的阳性血清以及含EDTA，柠檬酸钠抗凝剂，RF的血清各20份，采用腮腺炎病毒检测试剂盒进行试验，均在临界值以下对试剂盒试验结果均无影响，说明该试剂盒特异性良好。
[0029]重复性试验:
以同一批试剂盒测定参考品10次进行重复检测，进行变异系数测算(标准差/平均值*100%)，得批内CVS 10%，以不同批次试剂盒测定参考品10次进行重复检测，进行变异系数测算(标准差/平均值*100%)，得批间CV ( 15%，证明该试剂盒具有良好的重复性。
[0030]标本检测:
利用本试剂盒与德国EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的腿腺炎病毒试剂盒对240例血清样品进行了对比检测，样品包括45份可疑的腮腺炎急性感染病人血样、154份健康成年人的血样和41份怀孕妇女的血样。具体结果表1所示。
[0031]表一两种试剂盒检测结果比较
【权利要求】
1.一种腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，其特征在于，包括盒体，盒体内置有8个下凹瓶位，8瓶设有密封盖的试剂瓶、一块酶标反应板和3片封板膜构成,所述试剂瓶内的试剂分别为:样本稀释液、酶标记物、洗涤液、底物液A、底物液B、阴性对照、阳性对照和终止液，其中: 所述酶标反应板由1.5-2.0ug/ml腮腺炎病毒抗原包被； 所述样本稀释液为含10%牛血清白蛋白、PH7.4的磷酸盐缓冲液； 所述浓缩洗涤液为含有15%氯化钠的磷酸盐缓冲液； 所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的酶标羊抗人IgG多抗，稀释度1:10000-1:12000 ； 所述底物液A为0.04%过氧化脲乙酸缓冲液； 所述底物液B为0.04%TMB的柠檬酸缓冲液； 所述终止液为lmol/L硫酸溶液； 所述阴性对照为由阴性血清10ml，对照血清稀释液90ml ； 所述阳性对照为腮腺炎IgG抗体阳性血清。
2.根据权利要求1所述的腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，其特征在于；所述下凹瓶位可由塑料或纸板制成。
3.根据权利要求1所述的腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，其特征在于:所述酶标反应板位于所述试剂瓶之后，所述封板膜与所述酶标反应板相邻；且所述封板膜与所述酶标反应板的大小一致。
4.根据权利要求1所述的腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，其特征在于:所述酶标反应板包括支撑架，及放置在支撑架之上的数条可拆卸的微孔反应板条，每条微孔反应条上设有数个可拆卸的微反应孔。
5.根据权利要求1所述的腮腺炎病毒酶联检测试剂盒，其特征在于:所述酶标反应板上共设有96微孔反应孔，且所述酶标反应板外设有封套。
【文档编号】G01N33/569GK103713128SQ201410000080
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月1日 优先权日:2014年1月1日
【发明者】席甘, 安军, 陶杰, 席昇州 申请人:武汉翰雄生物技术有限公司