一种以大型溞毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法
【专利摘要】本发明公开了一种以大型溞毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，属于非目标污染物识别领域。其步骤包括：水样中有机物的富集；水样有机提取物的大型溞毒性实验；水样有机提取物的分级分离，将不同极性的化合物分开；分离组分的大型溞毒性实验；致毒组分中化合物的定性识别、定量确认。本发明利用分级分离技术将不同极性的化合物分开，筛选致毒组分来降低样品的复杂性，通过高效液相色谱-飞行时间质谱来定性识别潜在致毒物质，利用液质联用对可疑致毒物定量确认，弥补了传统非目标性化学分析无法得到混合体系中关键致毒污染物的不足，同时通过分级分离与特征物筛选分辨率高，准确度高，信息量大，使得非目标性关键毒物鉴别更加便捷可靠。
【专利说明】一种以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种不同污染程度农药废水的毒性识别与致毒有机物鉴别的方法，具体地说是一种以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，基于大型潘急性毒性与混合污染样品分级分离的致毒物质筛选、定性识别与定量确认的方法。
【背景技术】
[0002]农药可以用来杀灭昆虫、真菌和其他危害作物生长的生物。由于其高效性，中国大量使用，成为了农药生产和使用大国。《2012年中国农药市场产量监测分析》中显示2012年我国生产农药354.9万吨，居世界第一位。而由此也导致了大量的农药废水排放。据不完全统计，我国农药生产每年排放废水总量约3亿吨。这些废水通常具有成分复杂、毒性大、难生物降解、色度高、COD高等特点。农药废水排放到江河湖泊已严重破坏了生态环境，农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。因此找到农药废水中关键致毒物具有重大意义。
[0003]20世纪80年代，为了评估排放的工业废水是否对受纳水体具有生态风险，美国EPA提出了将毒性评估和化学分析手段结合起来的毒性鉴别评估(ToxicityIdentification Evaluation, TIE)方法。《农业环境科学学报》2009年第28卷第7期上1392页公开了一篇有关农药废水有毒组分追踪的文章《农药废水对秀丽隐杆线虫毒性效应及其主要有毒组分》，初步揭示了农药厂废水进水毒性主要来源是易受酸性调节影响的有机毒物，出水毒性主要来源是易受碱性调节影响的有机毒物。但是由于有机物种类繁多，用TIE方法来识别致毒物时无法确定有机物的具体类别。
[0004]通过检索发现目前国内外文献还没有报道基于农药废水对大型潘的急性毒性，通过制备色谱分离致毒组分，并利用四级杆-飞行时间质谱(Quadrupole Time Of Flight,Q-T0F)与定量构效关系(Quantitative Structure Activity Relationships,QSAR)中的生态结构活性关系ECOSAR(Ecological Structure Activity Relationships)软件估算化合物的毒性值来追踪农药废水中的关键致毒物。
【发明内容】
[0005]1、发明要解决的技术问题:
[0006]针对人们日益关注的有毒农药废水中关键致毒物质提取、分离、筛选与鉴别的问题，本发明的目的在于提供一种以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，以大型潘急性毒性为先导的农药废水中有毒污染物分级分离、定性识别、筛选与确认的方法，用来追踪农药废水中关键致毒物，为农药废水排放标准与环境基准的制定提供科学依据。
[0007]2、技术方案
[0008]为了实现上述目的本发明通过以下技术方案实现:
[0009]一种以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其步骤为:[0010](I)固相萃取:水样通过玻璃过滤器0.45um的尼龙滤膜过滤，过滤后的水样通过沃特世固相萃取柱(Waters Oasis HLB)进行富集，该柱使用之前依次用正己烷、二氯甲烷、甲醇和去离子水活化，流速控制在I~2滴/秒，萃取结束后在5000r/min的转速下离心5min来除去萃取柱中的水分。
[0011](2)富集:依次用5mL正己烷、IOmL 二氯甲烷和IOmL甲醇将有机物从固相萃取柱洗脱下来并收集洗脱液，将洗脱液旋蒸、氮吹浓缩，溶剂替换再定容，转移至进样小瓶中保存。
[0012](3)大型潘毒性实验:将水样有机提取物替换成二甲基亚砜DMS0，配制成一系列稀释倍数为2的试验液，接着往试验液里加入5只24h以内刚产的幼潘，设置4个平行，最后将其放入培养箱培养24h，观察记录每个烧杯中活动的大型潘的数量。
[0013](4)分级分离:基于有机氮农药、多环芳烃、壬基酚、辛基酚建立化合物的流出曲线及良好的质控建立制备色谱分离技术，并对水样有机提取物进行分离，其参数如下:
[0014]制备色谱仪:沃特世制备纯化色谱仪(Waters AutoPurification HPLC)；
[0015]色谱柱:沃特世制备柱(Waters XBridge C18,尺寸为19mmX 150mm,粒径为5um)；流速:5mL/min ;流动相:甲醇，水(含体积百分比为1%。三氟乙酸)；收集方式:用15mL规格的玻璃管按时间段来收集馏分；
[0016]流动相梯度:
[0017]
【权利要求】
1.一种以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其步骤为: (1)固相萃取:水样通过0.45um的尼龙膜过滤，过滤后水样通过固相萃取柱进行富集; (2)富集:利用不同极性溶剂将有机物从固相萃取柱上洗脱下来，浓缩定容； (3)大型潘毒性实验:将样品替换成二甲基亚砜DMSO后溶于水配成不同浓度进行大型潘暴露实验； (4)分级分离:基于有机氮农药、多环芳烃、壬基酚、辛基酚建立制备色谱分离技术，并对样品进行分离来降低样品的复杂性； (5)分离组分的大型潘毒性实验:制备分离之后的组分利用液液萃取和固相萃取来浓缩，分离组分替换成二甲基亚砜DMSO溶于水配成不同浓度进行型潘暴露实验； (6)大型潘毒性结果计算:将大型潘的观测值与浓度值的对数LogC用SPSS软件中的回归Probit做统计，在统计中找到50%抑制率对应的LogC，计算出半数抑制浓度EC50 ； (7)致毒组分中化合物的定性识别:利用高效液相色谱-飞行时间质谱对致毒组分进行扫描，得到一级及二级谱图； (8)可疑致毒物的筛选:基于分级分离方法得到化合物的流出曲线，从而确定正辛醇-水分配系数LogKow对时间的分布,利用LogKow范围来筛选化合物,通过挖掘和解析质谱谱图数据软件PeakView打开一级二级谱图，将其谱图通过网络化学数据库ChemSpider搜索得到化合物清单，并将文献查阅带的化合物定量离子对与二级谱图匹配； (9)可疑致毒物的定量确认:筛选到的化合物通过生态结构活性关系ECOSAR软件得到其毒性值EC50，并利用液质对其进行定量，得到化合物的毒性单位TU，计算化合物在样品总毒性中的贡献率最终找到主要致毒物。
2.根据权利I要求所述的以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其特征在于:所述的步骤⑴中所用的固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱,使用之前用正己烷、二氯甲烷、甲醇以及去离子水活化，整个过程保证小柱湿润。
3.根据权利I要求所述的以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其特征在于:所述的步骤(2)中所用的不同极性溶剂为5mL正己烷、IOmL 二氯甲烷和IOmL甲醇。
4.根据权利I要求所述的以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其特征在于:所述的步骤(4)中分级分离的参数如下: 制备色谱仪:Waters AutoPurification HPLC ;色谱柱:Waters XBridge C18 制备柱，所述制备柱尺寸为19mmX 150mm,粒径为5um ;流速:5mL/min ;流动相:甲醇,含体积百分比为1%。三氟乙酸与水的混溶液。
5.根据权利I要求所述的以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其特征在于:所述的步骤(7)中的仪器参数如下:高效液相色谱仪HPLC:Agilentl260 ；色谱柱:Agilent C18柱，所述色谱柱尺寸为2.1mmX 150mm,粒径为2.5um ;柱温:30°C ；流速:0.3mL/min ;流动相:乙腈,含体积百分比为5%乙腈与水的混溶液；质谱仪:TripleT0F5600—AB SCIEX ;离子源:ESI ；电离模式:正离子模式；MS扫描范围:100— 2000m/z ；MS-MS扫描范围:100— 1250m/z ;驱簇电压:80V ;碰撞电压:35±15eV。
6.根据权利1-5中任一项所述的以大型潘毒性为先导的农药废水中关键致毒物质鉴别方法，其特征在于:所述的步骤(8)中利用挖掘和解析质谱谱图数据软件PeakView中的提取离子使用窗 口提取精确的质荷比得到一级质谱图，再利用信息依赖性获取模式找到该质荷比的二级质谱图，利用一级及二级质谱图通过网络化学数据库ChemSpider搜索得到化合物清单，再将文献报道化合物的定量离子对与二级质谱图匹配。
【文档编号】G01N30/88GK103983727SQ201410236171
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】史薇, 邓东阳, 于红霞, 王玉婷 申请人:南京大学