一种柴胡药材的检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种柴胡药材的质量检测方法。该方法包括对柴胡所含的柴胡皂苷a、d的测定以及对柴胡药材农药残留量的测定。本发明解决了传统理化特性的鉴别方法的操作复杂和局限性以及质量难以调控的技术问题，以提供了一种准确度高，操作简便快速，成本低廉的检测方法，具有良好的应用前景和经济效益。
【专利说明】一种柴胡药材的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种柴胡药材的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 柴胡为石竹科植物，干燥根经加工制成的中药，味甘、性微温，具有归肝、胃经、 清虚热、除疳热等功效，临床用于阴虚发热，骨蒸劳热，小儿疳热等病症的治疗。柴胡药 材在我国已上市多年，临床效果得以广泛肯定。柴胡含多种化学成分，主要含柴胡皂苷 (saikosapoins a、b、c、d四种），留醇，挥发油，脂肪酸和多糖等。现代研究表明柴胡含有 的成分具有广泛的生理活性作用，其中柴胡皂苷a、d的含量与柴胡的解热抗炎功效密切相 关，因此所含柴胡皂苷a、d含量的多少常作为柴胡药材质量控制的重要指标。
[0003] 近几年柴胡的市场需求量持续增加，野生资源逐年减少，人工栽培发展缓慢，使得 柴胡资源蕴藏量和产量都在大幅下降。导致市场上出现了很多伪品，其中不少伪品的农药 残留量超标爆表，给柴胡药材的质量、用药的安全性及有效性带来了很大的冲击，已成为制 约柴胡系列药材开发的瓶颈。
[0004] 目前，正品柴胡的有效检测方法是传统的形态特征和理化特性的鉴别方法，具有 一定的局限性，不足以从整体上控制柴胡的质量，作为一味临床常用中药，其真伪优劣受其 理化指标、农药残留量多等诸多因素的影响，因此有必要建立一种科学的质量检测方法对 柴胡的质量进行评价。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中柴胡药材检测方法复杂，质量 难以调控的问题，进而提供一种准确度高，简单、快速的检测柴胡药材的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种柴胡药材的检测方法，该方法包括如下柴胡皂苷a、d的含量测 定步骤以及农药残留量的测定步骤，其中：
[0008] -种柴胡药材的检测方法，其特征在于，该方法包括如下柴胡皂苷a、d总量的测 定步骤以及农药残留量的测定步骤，其中，
[0009] A :所述柴胡皂苷a、d总量的测定包括如下步骤：
[0010] (1)精密称取胡皂苷a、胡皂苷d对照品，加甲醇制成每lmL含胡皂苷a0.4mg、胡皂 苷d0. 5mg的溶液，即为对照品溶液；
[0011] (2)精密称取待测柴胡药材粉末0· 5g，加入含5%浓氨试剂的甲醇溶液25mL，30°C 水温超声处理，滤过后用20mL甲醇分2次洗涤容器及药渣，合并洗液和滤液并回收溶剂至 干；残渣加甲醇溶解并定容至5mL，滤过后取续滤液，即为供试品溶液；
[0012] (3)按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相 A、以水为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：从0-50min，流动相A :流动相B的体积比 由25% :75% - 90% :10% ;从50-55min，流动相A :流动相B的体积比为90% :10% ;检测 波长为210nm ;理论塔板数按柴胡皂苷a峰计算不低于10000 ;
[0013] 分别精密称取对照品溶液20 μ 1和供试品溶液10-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定；
[0014] Β :所述农药残留量的测定包括如下步骤：
[0015] (1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每1ml含100 μ g三苯基磷酸酯的溶 液，作为内标贮备液；
[0016] 分别精密量取各农药对照品贮备溶液1ml及所述内标贮备液1ml，加丙酮定容至 100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；
[0017] 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每1ml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山 梨醇适量，加水溶解制成每lml含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨 醇溶液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作为分析保护剂；
[0018] (2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠 lg混匀，精密加入丙酮100ml，冰 浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有lg无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30 分钟；随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸 乙酯溶液溶解样品并定容至l〇ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1 : 1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；
[0019] 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至 石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗 脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5μ 1，加乙腈定容至lml，作为供试 品溶液；
[0020] (3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 μ L，并分别加入所 述分析保护剂1〇〇 μ L混匀，随后分别精密吸取1 μ L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其 中，
[0021] 所述气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1. 3ml/分钟，进样量1 μ 1，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C / 分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟；
[0022] 更进一步的，所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度 230°C，接口温度 250°C。
[0023] 其中所述农药残留量的测定中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为： 填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净化柱为2. 5mmX40cm，具体洗脱参数为净化去杂 900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
[0024] 更进一步的，所述农药残留量的测定中，农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲 胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、氧化乐果、二 嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾 氏剂、克菌丹、磷胺Π 、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死 蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇Α、三唑醇 B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp'-DDE、PP'-DDD、OP'-DDT、PP'-DDT、狄氏剂、 杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯 杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊 菊酯、溴氰菊酯。
[0025] 步骤A中，所述柴胡皂苷a、d含量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
[0026] 更进一步的，步骤B中，所述农药残留量的测定中，所述待测药材的粒径为 180-2000 μ m〇
[0027] 所述柴胡皂苷a、d总量的测定步骤中，所述超声处理步骤的条件为：功率200W、频 率40KHz，超声处理30min。
[0028] 本发明所述方法通过对柴胡药材所含的柴胡皂苷a、d含量的测定以及对柴胡药 材农药残留量的检测，进行柴胡药材真伪优劣的判定标准。并通过高效液相色谱法测定柴 胡皂苷a、d含量，所述方法不仅准确且简单易行。本发明所述方法通过气相色谱-质谱联 用的方式检测药材的残留农药量，不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而且通过对检测 条件的特定筛选，可一次性将柴胡药材中常见的农药种类进行一次性的有效检测，所述方 法准确率及实用效果均较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实验例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0030] 图1是本发明实施例1中柴胡混合对照品图谱图；
[0031] 图2是本发明实施例1中柴胡样品图谱图；
[0032] 图3是本发明实施例2中农药标准品的全扫描气相色谱图；
[0033] 图4是本发明实施例2中农药标准品的0-10分钟扫描气相色谱图；
[0034] 图5是本发明实施例2中农药标准品的10-20分钟扫描气相色谱图；
[0035] 图6是本发明实施例2中农药标准品的20-40分钟扫描气相色谱图。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1柴胡药材中柴胡皂苷a、d总量的测定
[0037] 1仪器与试药
[0038] 1. 1 仪器
[0039] 岛津LC20-AT液相色谱仪；
[0040] waters26%-2"8 液相色谱仪；
[0041] 超声清洗器（250W，40kHz)。
[0042] 1. 2 试剂
[0043] 甲醇、乙腈（色谱纯），屈臣氏蒸馏水；
[0044] 柴胡皂苷a(110777-200507)、柴胡皂苷d(110778-200506)由中国食品药品检定 研究院提供，柴胡皂苷c由天津马克生物技术有限公司提供。
[0045] 1. 3药材样品
[0046] 收集了甘肃各地柴胡样品，供试药材产地批次分别选自：甘肃陇西县、甘肃临夏 县、甘肃漳县后川乡、甘肃漳县金钟镇、甘肃礼县、甘肃陇西县2批次（分别标注为1-2)、甘 肃、甘肃灵台县、甘肃漳县、甘肃武都区安化镇、甘肃灵台县、甘肃平凉市崆峒区、甘肃武山 县2批次（分别标注为1-2)、甘肃陇西县云田镇、甘肃陇西县通安驿镇3批次（分别标注为 1-3)。对各供试药材的鉴定结果为柴胡Bupleurum chinense DC。
[0047] 2.方法
[0048] 精密称取胡皂苷a、胡皂苷d对照品，加甲醇制成每lmL含胡皂苷a0.4mg、胡皂苷 d 0. 5mg的溶液，即为对照品溶液；
[0049] 精密称取待测柴胡药材粉末0. 5g，加入含5%浓氨试剂的甲醇溶液25mL，30°C水 温超声处理，滤过后用20mL甲醇分2次洗涤容器及药渣，合并洗液和滤液并回收溶剂至干； 残渣加甲醇溶解并定容至5mL，滤过后取续滤液，即为供试品溶液；
[0050] 按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以 水为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：从0-50min，流动相A :流动相B的体积比由 25% :75% - 90% :10% ;从50-55min，流动相A :流动相B的体积比为90% :10% ;检测波 长为210nm ;理论塔板数按柴胡皂苷a峰计算不低于10000 ;
[0051] 分别精密称取对照品溶液20 μ 1和供试品溶液10-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定；
[0052] 3.结果
[0053] 对19批次供试药材进行检测，其色谱图见图1、2,检测结果见下表1。
[0054] 表1柴胡样品的收集与含量测定（％ )
[0055]
【权利要求】
1. 一种柴胡药材的检测方法，其特征在于，该方法包括如下柴胡皂苷a、d总量的测定 步骤以及农药残留量的测定步骤，其中， A :所述柴胡皂苷a、d总量的测定包括如下步骤： (1) 精密称取胡皂苷a、胡皂苷d对照品，加甲醇制成每lmL含胡皂苷a0.4mg、胡皂苷 dO. 5mg的溶液，即为对照品溶液； (2) 精密称取待测柴胡药材粉末0. 5g，加入含5%浓氨试剂的甲醇溶液25mL，30°C水温 超声处理，滤过后用20mL甲醇分2次洗涤容器及药渣，合并洗液和滤液并回收溶剂至干；残 渣加甲醇溶解并定容至5mL，滤过后取续滤液，即为供试品溶液； (3) 按照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以 水为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：从0-50min，流动相A :流动相B的体积比由 25% :75% - 90% :10% ;从50-55min，流动相A :流动相B的体积比为90% :10% ;检测波 长为210nm ;理论塔板数按柴胡皂苷a峰计算不低于10000 ; 分别精密称取对照品溶液20 μ 1和供试品溶液10-20 μ 1，注入液相色谱仪，测定； Β :所述农药残留量的测定包括如下步骤： (1) 精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每lml含100 μ g三苯基磷酸酯的溶液，作 为内标贮备液； 分别精密量取各农药对照品贮备溶液lml及所述内标贮备液lml，加丙酮定容至 100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液； 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每lml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇 适量，加水溶解制成每lml含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶 液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作为分析保护剂； (2) 精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠 lg混匀，精密加入丙酮100ml，冰浴超声 处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有lg无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟； 随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸乙酯溶 液溶解样品并定容至l〇ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1 :1的环 已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干； 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至石墨 碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脱，收集 洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5 μ 1，加乙腈定容至lml，作为供试品溶液； (3) 精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 μ L，并分别加入所述分 析保护剂1〇〇 μ L混匀，随后分别精密吸取1 μ L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中， 所述气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1. 3ml/分钟，进样量1 μ 1，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C / 分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟； 所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度 250。。。
2. 根据权利要求1所述的柴胡药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测定 中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净 化柱为2. 5mmX 40cm，具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
3. 根据权利要求1或2所述的柴胡药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测 定中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、α -六六六、 β_六六六、六六六、δ-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷 胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲 基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲 戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇Α、三唑醇Β、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反 式硫丹、PP' _DDE、PP' -DDD、0P' -DDT、PP' -DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷 酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀 螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4. 根据权利要求1-3任一所述的柴胡药材的检测方法，其特征在于，所述柴胡皂苷a、 d含量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
5. 根据权利要求1-4任一所述的柴胡药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量 的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 μ m。
6. 根据权利要求1-5任一所述的柴胡药材的检测方法，其特征在于，所述柴胡皂苷a、d 总量的测定步骤中，所述超声处理步骤的条件为：功率200W、频率40KHz，超声处理30min。
【文档编号】G01N30/02GK104267109SQ201410374865
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】李冬华, 韩斌, 李波, 李登鹏, 赵建邦, 陈杰, 宋平顺, 何禄仁, 张明童 申请人:甘肃中天药业有限责任公司