一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及试剂盒，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。所述试剂盒中包括胶体金快检试纸条，所述试纸条是以流行性乙型脑炎病毒的原核表达抗原JEV-Ag45制备而成。本发明还公开了该重组抗原蛋白的制备方法。本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与流行性乙型脑炎病毒抗体具有极高亲和力，能够快速、准确地检测流行性乙型脑炎病毒抗体，从而诊断流行性乙型脑炎病毒的感染情况。
【专利说明】一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白及试剂 盒 【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，尤其涉及一种诊断流行性乙型脑炎病毒抗体的重 组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的流行性乙型脑炎病毒检测试 剂盒。 【背景技术】
[0002] 流行性乙型脑炎简称乙脑，是日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus， JEV)引起的最常见的病毒性脑炎。为了与本世纪初曾流行于欧洲的昏睡性脑炎（又称甲 型脑炎）相区别，解放后我国卫生部定名为流行性乙型脑炎。它曾经一度被称为"东方的瘟 疫"。乙型脑炎病毒属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，基因组为单股正链RNA，两端为非编码 区，整个基因组为一个开放阅读框，编码一个多蛋白质前体。流行性乙型脑炎是乙型脑炎病 毒感染引起的人畜共患病，人通过蚊虫叮咬或密切接触感染。我国是乙型脑炎流行的高发 地区，发病人数占全世界乙型脑炎病例的80%以上，每年报告病例有1万一 2万，存活的患 者多数会留下严重的神经精神后遗症。由于乙型脑炎尚无特效疗法，早期准确的诊断和有 效的预防是防治本病的主要手段。因此选用简便、快速准确，便于推广使用的诊断方法对于 乙型脑炎的防控具有重大意义。
[0003] 目前国内外关于流行性乙型脑炎病毒检测方法一般采取血清学诊断、分离培养、 免疫细胞化学法和分子生物学方法。血清学诊断主要包括ELISA、血凝抑制试验、中和试验、 间接免疫荧光试验等，但这些方法费时费力，不能达到早期诊断的目的。由于IgG抗体可以 在宿主体内存在很长时间，使得鉴别过去、最近还是现在乙型脑炎病毒十分困难。因此，对 其抗原表位进行深入细致的研宄，鉴别其共同及特异性抗原表位，对于疫苗及诊断试剂的 研制都具有重要意义。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA)及胶体金等方法， 速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以快速的、高通量的检测大量样品，同时也比 较灵敏、可靠，并且已经在不同的病原检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫 人员熟练掌握，有其他方法无法代替的优势。
[0004] 从现有技术中公开的流行性乙型脑炎病毒血清学诊断方面的资料来看，主要存在 以下方面的问题：（1)不同黄病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种黄病 毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困 难。（2)由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的还会超过10个月，甚至终生携 带，使得鉴别过去、最近还是现在感染流行性乙型脑炎病毒十分困难，对抗原的质量也提出 了更高的要求。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测流行性乙型脑炎病毒抗 体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它 相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与流行性乙型脑炎病毒抗体具有极高亲和力。
[0006] 本发明的所解决的技术问题在于提供一种流行性乙型脑炎病毒的检测试剂盒，利 用所制备的重组抗原蛋白，建立流行性乙型脑炎病毒抗体的胶体金快速检测技术。
[0007] 为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测流行性乙型脑炎病毒的重 组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列
[0008] 优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序 列。
[0009] 该重组抗原蛋白是通过选择乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码 基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表答 而制备得到，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包 括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽 表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。
[0010] 另一方面，本发明【具体实施方式】中还提供了一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的 重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 一、选择乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片 段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重 组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩 盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；
[0012] 二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；
[0013] 三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有 所述目的基因片段的重组表达质粒；
[0014] 四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细 胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
[0015] 优选地，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下：
[0016] 正向引物：CGGGATCCGCGAGCAGGGTCATCGACTG〈SEQ ID NO. 3>
[0017] 反向引物：ACGCAAGCTTTTATGCCTCTGTCCAATGGGCTAG〈SEQ ID NO. 4>。
[0018] 优选地，在本发明的一个具体实施例中所述原核表达载体选用pMAL c2x原核表达 载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。
[0019] 对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了乙型脑炎病毒蛋白中呈现病 毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白 柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达 的重组抗原蛋白正确折叠，同时结合上述方案中涉及的专用引物，有效地获取了该目的基 因，同时结合该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表 达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用相 近虫媒病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的乙型脑炎病毒检 测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验和对具体临床标本的测试试验结果，更进一步地说 明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗 原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。
[0020] 另外，本发明还提供了一种乙型脑炎病毒的检测试剂盒，包括胶体金快检试纸条 和样品稀释液，所述胶体金快检试纸条上包被有检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原 蛋白，而所述重组抗原蛋白即为本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白。
[0021] 其中，所述胶体金快检试纸条上分别形成有T线和C线，所述T线所处区域包被有 检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白为权利要求1-3中任意 一项中所述的重组抗原蛋白；所述检测试剂盒中还包括样品稀释液，干燥包。
[0022] 优选地，所述抗体检测试纸条的制备过程包括如下步骤：
[0023] -、按照本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白制备方法制备重组抗原蛋白；
[0024] 二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于试纸条上，该过程包括将步骤一中纯化得到 的重组抗原蛋白包被到NC膜上，将标记好的金标-SPA灌注在玻璃硝酸纤维素膜上，一起真 空冷冻干燥4小时，然后将试纸条和金标垫进行机械组装，装入试剂盒后即得到所述抗体 检测试剂盒；而所述重组抗体为即为本发明上述方案中揭示的检测乙型脑炎病毒抗体的重 组抗原蛋白。
[0025] 优选地，在本发明的一个具体实施例中，所述重组抗原蛋白为Jev_Ag45。
[0026] 结合本发明的优选实施例中揭示的实验内容可以看出，实验中在保证反应原性的 基础上，确保所筛选的原核表达抗原具备良好的特异性，与所测试的登革热、黄热、西尼罗 河、基孔肯亚、辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山及盖塔病毒均无交叉反应。同时， 所建立的制备方法及流行性乙型脑炎病毒的检测试剂盒均具备较高灵敏度及检出范围，以 流行性乙型脑炎病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清1:1?1:1280倍稀释范围内， 均可获得阳性结果，而且无非特异性结果。
[0027] 再则，结合本发明的重组抗原蛋白用于乙型脑炎病毒的检测试剂盒的具体实施方 式，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断乙型脑炎病毒试剂盒中的运用，能够保 证乙型脑炎病毒诊断过程中的灵敏度和特异性
[0028] 另一方面，结合本发明的重组抗原蛋白用于流行性乙型脑炎病毒的检测试剂盒的 【具体实施方式】，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断流行性乙型脑炎病毒试剂盒 中的运用，并能够保证流行性乙型脑炎病毒诊断过程中的灵敏度和特异性。相对于全病毒 抗原，重组抗原蛋白纯度高、特异性强，便于质量控制，可以去掉不与抗体结合的无关区段， 将使得检测灵敏度和特异性增加，并且成本也较低，在病毒检测中具有较大优势。 【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1是本发明实施特异性实验结果表明，所研制快检试纸条仅与乙型脑炎多克隆 抗体呈阳性反应，而与黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒、登革热病毒1?4型、辛德毕 斯病毒、玛雅罗病毒、盖塔病毒、鹭山病毒、罗斯河病毒、西门利克病毒多克隆抗体均无交叉 反应，说明该试纸条具良好特异性
[0030] 图2是本发明实施敏感性实验表明，所研制试纸条可检测做1:10?1:1280倍稀 释的乙型脑炎多克隆抗体，并具良好的重复性。
[0031] 图3是本发明实施的试纸条成品，并做了阴性和阳性对照。 【具体实施方式】
[0032] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0033] 下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如胶体金检测 试纸条实施手册中所述的条件。
[0034] 本发明的下列实施例中，选用的乙型脑炎病毒：17D株， 申请人:实验室内有毒株样 本；而实验中用的内切酶、连接酶、T载体购自大连TaKaRa公司。凝胶纯化回收及质粒快速 提取试剂盒购自OMEGA公司。Trizol及反转录试剂购自Invitrogen公司pMAL-C2x表达载 体购自New England Biolabs公司，Amylose Resin亲和层析试剂购自NEB公司，表达宿主 菌Rosetta(DE3)由本实验室传代保存。
[0035] 实施例1、检测乙型脑炎病毒的重组抗原蛋白的制备
[0036] 按照如下步骤制备检测乙型脑炎病毒的重组抗原蛋白：
[0037] 步骤一、选择乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基 因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编 码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位 的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；
[0038] 步骤二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；
[0039] 步骤三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建 含有所述目的基因片段的重组表达质粒；
[0040] 步骤四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿 主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如 SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
[0041] 具体实现实现时，上述步骤一中，参考乙型脑炎病毒17D株基因组序列，利用 DNAstar及ANTHEPR0T软件对其编码蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性进行详细分析， 并参考Genbank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，初步筛选可能的抗原性片段 45段。
[0042] 步骤二中，根据步骤一中所选的抗原性片段，并结合多肽结构中需要的延伸区段， 通过优化设计与各区段对应的引物，通过PCR扩增相应的目的基因片段，从而使由延伸区 段编码柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正 确折叠。为此，在本步骤的优选过程中，设计PCR扩增引物45对，并分别于引物5'末端及 3'末端导入BamH I及Hind III酶切位点。
[0043] 作为获取目的基因片度的预先步骤，还需反转录乙型脑炎病毒的基因组，该反转 录过程为：乙型脑炎病毒17D株经C6/36细胞培养传代培养，采用Invitrogen的Trizol试 剂提取病毒RNA，采用常规方法进行反转录获得其cDNA。
[0044] 而后按如下条件进行PCR :
[0045] 取 cDNA2yl，10XPCR 缓冲液 5μ1，正向引物、反向引物各 2μ1、dNTP 8μ1、Taq 2U，补水至总体积50 μ 1进行PCR扩增。反应参数为：95°C 5min，然后94°C 30s，55°C 40s， 72°C 60s，共32次循环，最后一次循环后72°C延伸7min，扩增片段经纯化、回收后，-20°C保 存备用。
[0046] 步骤三中、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构 建含有目的基因片段的重组表达质粒。在本发明实施例中，所述原核表达载体为pML c2x 原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。本步骤具体如下：
[0047] 酶切：各取IOul经纯化的扩增产物，分别加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III 各1111(1(^)，灭菌去离子水15111，37°0酶切过夜。另取？嫩1^(：21表达载体质粒2即，加入 Buffer K 3ul，BamH I 及Hind III各 1111(1011)，灭菌去离子水补至3〇111，37°(^酶切过夜。酶 切产物分别用TaKaRa公司凝胶回收试剂盒纯化回收。
[0048] 连接：取2ul经以上处理的pMAL c2x载体（约130ng)，5ul酶切目的片段（约 40ng)，45°C加热5min，以使退火的粘端解链，立即冰浴lOsec，加入T 4DNA连接酶0. 5U，连 接酶Buffer lul，用灭菌四馏水补至10ul，16°C连接过夜。取重组质粒5ul转化感受态菌 DH5a，加入无抗生素的LB液体培养基300ul，37°C复苏45min后，取IOOul涂氨苄青霉素 (100ug/ml)平皿，37°C培养 18h。
[0049] 重组子鉴定：挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定，PCR反应体：10XPCR缓冲液2 μ 1， 正向引物、反向引物各lyl、dNTP 0.4yl、Taq 2U，补水至总体积20μ1进行PCR扩增。PCR 反应条件同步骤二，阳性克隆送生物工程（上海）有限公司测序确认。经测序确认获正确 重组表达质粒45组，并提取质粒，并-20°C保存备用。
[0050] 步骤四中、将重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养表达宿主细胞， 并检测其重组蛋白表达情况，在本实施例中本步骤具体为：挑经转化重组表达载体的表达 宿主菌单菌落分别接种于LB液体培养基中，37°C震荡培养4h，当OD值达0. 6时，吸取未诱 导对照菌lml，并向剩余菌中加入诱导物IPTG使其终浓度为0. 5mmol/L，于37°C振荡培养 4h，冰浴5min后，4°C、12000g离心2min收菌，并进行SDS-PAGE检测，参照分子克隆实验指 南，配制好反应液体，积层胶浓度为4%，分离胶浓度为12%，积层胶恒流10mA，分离胶恒流 25mA电泳，电泳完毕后，考马斯亮蓝染色，验证重组蛋白表达情况。经本步实验，所构建的 45个重组表达载体中38个获高效表达。
[0051] 而后、对所获重组表达抗原进行western blot分析，以验证其免疫反应原性及免 疫学反应的特异性，在本实施例中本步骤具体为：SDS-PAGE电泳同步骤四，电泳完毕后，电 转硝酸纤维素膜，基孔肯雅、辛德毕斯、罗斯河病毒多克隆抗体I :5000稀释，进行蛋白质印 迹（western-blot)，验证表达抗原的反应特异性。获得能高效表达乙型脑炎病毒特异性重 组抗原的基因工程菌株一株：E. coli-JEV45。因此，在本发明实施例中，最终优化得到的目 的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，而重组抗原蛋白则具有如SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列，与之对应的，在步骤二中，所选择采用的PCR扩增引物序列如下：
[0052] 正向引物：CGGGATCCGCGAGCAGGGTCATCGACTG〈SEQ ID NO. 3>
[0053] 反向引物：ACGCAAGCTTTTATGCCTCTGTCCAATGGGCTAG〈SEQ ID NO. 4>。
[0054] 另外，通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化实验，获取适合用 于ELISA实验的重组抗原蛋白，本实施例中本步骤具体为：E. coli-JEV45菌过夜培养物 IOml接种IL LB培养基（含100 μ g/ml氨苄青霉素），37°C振荡培养2?3小时，待OD值 达0. 6时，加入IPTG至终浓度0. 5mM，继续37°C振荡培养4小时后，离心收获细菌，并用PBS 洗绦两次，50mlPBS重悬，超声波破碎细菌后，采用NEB公司Amylose Resin亲和层析柱纯化 纯化重组蛋白，核酸蛋白分析仪测定其浓度为9627ug/ml。
[0055] 进行SDS-PAGE实验和蛋白质印迹，参照分子克隆实验指南，配制好反应液体，积 层胶浓度为4%，分离胶浓度为12%，积层胶恒流10mA，分离胶恒流25mA电泳，电泳完毕后， 电转硝酸纤维素膜，基孔肯雅、辛德毕斯、罗斯河病毒多克隆抗体I :5000稀释，进行蛋白质 印迹（western-blot)，验证表达抗原的反应特异性，并获得能高效表达乙型脑炎病毒特异 性重组抗原的基因工程菌株。而后通过此高效表达菌株进行上述重组抗原蛋白的表达纯化 实验，获取适合用于ELISA实验的重组抗原蛋白
[0056] 实施例2、检测试纸条的优化
[0057] 在本实施例中需要对本发明的重组抗原蛋白的包被条件和浓度进行优化；为了达 到此目的还需要先对试剂盒中组成进行说明：包括抗体检测试纸条和样品稀释液，所述抗 体检测试纸条上包被有检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白，而所述重组抗原蛋 白即为本发明上述方案中揭示的重组抗原蛋白。
[0058] 其中，试剂盒中包括：含流行性乙型脑炎病毒重组抗原蛋白检测试纸条，样品稀释 液，干燥包。
[0059] 检测试纸条：T线包被有乙型脑炎病毒重组抗原蛋白，C线包被有特异抗体；
[0060] 样品稀释液：含有0· 5% BSA的生理盐水。
[0061 ] SPA与胶体金结合最佳pH确定：胶体金溶液用0· lmol/L碳酸钾溶液分别调pH为 4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、8· 0、9· 0、10· 0、11· 0,取上述胶体金溶液各100 μ 1分别加入96孔板孔 中，每孔分别加入3 μ 1浓度为lmg/mL的SPA，混匀，静止5min后加入20 μ 1浓度为10% NaCl溶液，混匀，室温下放置IOmin观察胶体金颜色变化，记录保持红色的pH值，每个梯度 设3个重复。
[0062] 标记SPA最小蛋白量的确定：取一 96孔板，分别加入最佳pH的胶体金100 μ 1，分 别加入 lmg/mL 浓度的 SPA 蛋白 3、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0 μ 1，混匀，室温下放 置15min，加入20 μ 1 10% NaCl溶液，室温下放置2h，每个梯度设3个重复，记录颜色仍保 持红色的最小蛋白用量。
[0063] 实施例3、金标记SPA探针的制备
[0064] 将30ml胶体金溶液加入50ml烧杯中，调整胶体金的pH到最适pH值，在250r/ min的转速搅拌下，逐滴加入Iml最佳浓度的SPA蛋白溶液，继续搅拌30min，最后逐滴加入 10 %的PEG20000溶液，使得体系中PEG20000浓度为0. 25 %，室温3000rpm离心15min，弃 去沉淀，取红色上清液在4°C，IlOOOrpm条件下离心35min，轻吸弃去上清液，用1 %的BSA 将沉淀混悬至原量，重复离心2次，彻底除去未结合的蛋白质。最后一次洗涤离心的沉淀用 含1 %的BSA和0. 02mol/LNaN3的PB将沉淀混悬为原体积的1/10,4°C保存备用。
[0065] 实施例4、试剂盒的特异性实验
[0066] 采用优化条件进行胶体金试纸条特异性测试实验，选择黄热病毒、西尼罗病毒、基 孔肯亚病毒、登革热病毒1?4型、辛德毕斯病毒、玛雅罗病毒、盖塔病毒、鹭山病毒以及西 门利克病毒多克隆抗体1 :40稀释后，作为参考样品，验证胶体金方法的特异性，并设置空 白对照及阴性对照，结果如图1所示。
[0067] 实施例5、试剂盒的灵敏度及重复性实验
[0068] 用含0. 5% BSA的生理盐水将乙型脑炎多克隆抗体做1:10?1:5120稀释系列倍 比稀释，测定其检出范围。从3个不同批次的试纸条中随机抽取试纸条3份，分别用阳性及 阴性抗体验证不同批次试纸条的稳定性，结果如图2所示。
[0069] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护 范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和 范围。
【权利要求】
1. 一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于：所述重组抗原蛋 白具有如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在 于：所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO. 2所不的核昔酸序列。
3. 根据权利要求2所述的检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在 于：所述重组抗原蛋白为流行性乙型脑炎病毒高特异性抗原。
4. 一种检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤： 一、 选择流行性乙型脑炎病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因 片段，该目的基因片段包含如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码 重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的 掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠； 二、 设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段； 三、 通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述 目的基因片段的重组表达质粒； 四、 将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使 其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述原核表达载体为pMAL c2x原核 表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序 列如下： 正向引物：CGGGATCCGCGAGCAGGGTCATCGACTG 反向引物：ACGCAAGCTITTATGCCTCTGTCCAATGGGCTAG。
7. -种流行性乙型脑炎病毒的检测试剂盒，包括胶体金快检试纸条和样品稀释液，其 特征在于：所述胶体金快检试纸条上包被有检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋 白，所述重组抗原蛋白为权利要求1-3中任意一项中所述的重组抗原蛋白。
8. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金快检试纸条上分别形 成有T线和C线，所述T线所处区域包被有检测流行性乙型脑炎病毒抗体的重组抗原蛋白， 所述重组抗原蛋白为权利要求1-3中任意一项中所述的重组抗原蛋白；所述检测试剂盒中 还包括样品稀释液，干燥包。
9. 根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述测试试纸条的制备过程包括 如下步骤： 一、 以权利要求4-6中任意一项所述的制备方法制备重组抗原蛋白； 二、 将纯化后的重组抗原蛋白固定于试纸条上，该过程包括将步骤一中纯化得到的重 组抗原蛋白包被到NC膜上，将标记好的金标-SPA灌注在玻璃硝酸纤维素膜上，一起真空冷 冻干燥4小时，然后将试纸条进行机械组装，装入试剂盒后即得到所述抗体检测试剂盒；所 述重组抗体为如权利要求1-4中任意一项中所述的重组抗原蛋白。
10. 如权利要求1-3中任意一项所述的重组抗原蛋白在制备诊断流行性乙型脑炎病毒 试剂盒中的运用。
【文档编号】G01N33/569GK104497109SQ201410736841
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】任瑞文, 梁克峰, 沓世远, 杨柳, 张培, 胡文龙, 唐博恒 申请人:任瑞文