一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机污染物致大鼠肝脏蛋白质氧化损伤的检测方法，该方法利用固相萃取法提取有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，感染12周以后采用用2,4-二硝基苯肼比色法检测蛋白质羰基，以达到快速明显检测大鼠肝脏蛋白质氧化损伤过程，本发明中饮用水有机污染物对大鼠肝功能指标的敏感顺序依次为CHE>ALT>AST>ALB。由于血样采集方便、肝功能指标测定方法简便易行，故可考虑将外周血CHE指标作为监测该地饮用水有机污染物致大鼠肝功能损害的敏感指标，联合ALT、AST或ALB进行暴露人群肝功能损害的动态监测，为该地饮用水有机污染物致人体肝脏损害的早期发现、早期防治及预后判断提供科学依据。
【专利说明】一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法，属于卫生 评估【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 化学物对机体的损伤往往涉及多个组织器官、影响众多观测指标，健康危害监测 及评价中若对多个指标同时进行检测，不仅花费大、而且实施困难。因此，实际工作中常筛 选敏感指标对高危因素暴露者进行动态监测并施以医学干预，这在预防和控制疾病的发生 发展上有着重要的现实意义。在敏感指标的筛选方法中，基准剂量法自1984年第一次使用 以来，在环境污染物的危险度评价方面作出了巨大的贡献而得以广泛的采纳和使用，是近 年来应用于筛选敏感生物学标志的最佳方法。BMD是根据环境物质的某种接触剂量可引发 某种不良健康效应的反应率发生预期变化（其增高范围通常为1%_1〇%)而推算出的一种剂 量，BMDL是指BMD的95%可信下限。BMD提出至今已在如镍、铬、甲基汞、苯乙烯、氟化氢等 毒物的发育毒性、神经毒性和内分泌干扰等研究中得到了应用。目前国内外尚未见有关饮 用水有机污染物接触研究的BMD报道。因此发现肝功能指标的敏感顺序，对于人类肝脏损 害的筛查及早期发现、早期防治及预后具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：提供一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方 法，找出肝功能损伤的敏感指标，以便能快速有效的筛查人类肝脏功能的损伤，并对早期发 现、早期防治及预后具有重要的意义。
[0004] 本发明的技术方案 一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法，该方法利用固相萃取法提 取饮用水中的有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，染毒动物模型成功后，对大鼠 进行心脏取血，分离血清，应用全自动生化分析仪检测进行肝功能检，经分析，评估肝脏毒 性的敏感监测指标。
[0005] 前述的一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法中，采用固相萃 取法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，水样过柱流速 为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0. 1倍柱 体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25°C减压蒸馏挥干，将已挥干的浓缩提取物用玉米油定容 至50L/ml(母液）-200C冰箱保存备用。
[0006] 前述的一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法中，计算ALT、 AST、CHE、ALB的AIC、BMD、BMDL，在拟合优度检验P> 0. 05的模型中选择AIC值最小的作 为最合适的剂量-反应模型，通过BMD模拟的最优剂量-效应曲线，当BMR为5%时，以AST、 ALT、CHE、ALB为效应标志物计算得出有机污染物暴露剂量的BMD、BMDL，根据各指标BMD和 BMDL值大小，评估肝功能指标的敏感性。
[0007] 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明中饮用水有机污染物对大鼠 肝功能指标的敏感顺序依次为CHE>ALT>AST>ALB。由于血样采集方便、肝功能指标测定方法 简便易行，故可考虑将外周血CHE指标作为监测该地饮用水有机污染物致大鼠肝功能损害 的敏感指标，联合ALT、AST或ALB进行暴露人群肝功能损害的动态监测，为该地饮用水有机 污染物致人体肝脏损害的早期发现、早期防治及预后判断提供科学依据。
【具体实施方式】
[0008] 下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0009] 本发明的实施例： 1材料 1.1实验动物 清洁级SD大鼠，由中国人名解放军第三军医大学提供，4?6周龄，体重100±20g，雌 雄各半，40只，合格证号[SCXK(渝）2007-003]。动物房温度22?24°C，湿度为40%? 60%，明暗周期为12h:12h。
[0010] 1.2主要试剂及其配制 1. 2. 1主要试剂 二氯甲烷购自川东化工，氯化钠、XAD-2大孔树脂（20-60目）、戊巴比妥钠均购自美国Sigma公司，谷草转氨酶测定试剂盒、谷氨转氨酶测定试剂盒总蛋白测定试剂盒、总蛋白测 定试剂盒、白蛋白测定试剂盒、血清总胆红素试剂盒、直接胆红素试剂测定盒、胆碱酯酶试 剂测定盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。
[0011] 1.2. 2试剂配制 0. 9.%戊巴比妥钠 戊巴比妥钠0. 9g 蒸馏水 100ml 1. 3主要仪器 电子天平（AR1530/C，美国奥豪斯公司）、振荡器（DH2-D，江苏太仓）、旋转蒸发仪 (RE-3000,上海亚英生化仪器有限公司）、循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸 有限公司）、离心机（LD4-2，北京医用离心机厂）、全自动生化分析仪（AU400,OLYMPUS有限 公司）、-80〇C低温冰箱（MDF-73V，日本sanyo公司）。
[0012] 2实验方法 2. 1水样采集与处理 采集某地管网末梢水水样20000L，采用固相萃取法富集水中有机物，萃取剂为XAD-2 树脂，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱 体积的二氯甲烷和甲醇先后洗柱，流速〇. 1倍柱体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25°C减压 蒸馏挥干，将已挥干的浓缩提取物用玉米油定容至50L/ml(母液），即lml玉米油溶液相当 于50L水样中有机提取物（作为母液），-200C冰箱保存备用。在萃取有机物的整个过程 中，所有的器皿均为玻璃器皿，以避免使用塑料过程中邻苯二甲酸酯类物质释放到水中。
[0013] 2.2染毒剂量的确定 结合文献资料[28]，依据预实验结果，确定大鼠染毒高剂量组剂量为80L饮用水有机 污染物提取物/kg.bw.day,向下设置低、中2个剂量组，分别为20L/kg.bw.day, 5L/kg.bw. day〇
[0014] 2.3动物分组 将40只SD大鼠按随机区组法分为4组，每组10只，雌雄各半，1组为对照组（予玉 米油），其余3组为低、中、高剂量染毒组，染毒剂量分别为5L/kg.bw.day、20L/kg.bw.day、 80L/kg.bw.day〇
[0015] 2. 4动物模型的制作及标本采集 模拟人体接触途径，利用萃取的有机污染物对大鼠经口灌胃染毒，灌胃体积为lml/100g.bw.day，连续灌胃90d，最后一次染毒结束后，空腹12小时，称重，用0. 9%戊巴 比妥钠麻醉大鼠，心脏取血,收集血液标本于非抗凝管中，放置2-3小时，3000r/min，离心 15-20min，分离血清放入-80°C冰箱待测。
[0016] 2. 5检测指标及方法 2. 5. 1肝功能指标测定 丙氨酸转氨酶（Alanineamunotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酸（Aspartate aminotransferase，AST)、胆喊酯酶（Cholinesterase，CHE)、总蛋白（Totalprotein, TP)、白蛋白（Albumin，ALB)、白球比（A/G)、胆固醇（Cholesterol，CH0)、甘油三酯 (Triglyceride，TG)、总胆红素（Totalbilirubin，TBIL)、直接胆红素（Directbilirubin, DBIL)测定采用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪测定。
[0017] 2. 5. 5基准剂量及其可信限下限计算 计算基准剂量（Benchmarkdose,BMD)的效应指标首先应满足两个条件：（1)染毒组的 改变存在剂量-反应（效应）关系；(2)与对照组比较，至少有一个染毒组的改变有统计学 意义。本研究以肝损伤指标作为效应指标，对满足上述条件的AST、ALT、CHE及Alb指标采 用美国环境保护署（U.SEnvironmentalProtectionAgency，EPA)的BMDSV2. 0 软件计 算，该软件提供了Linear、Polynomial、Power、Hill4类连续变量的剂量反应模型，依据EPA 发行的BMDS应用指南，对各剂量-反应数学模型进行拟合优度检验，在拟合优度检验P> 0.05的模型中选择赤池信息量准则（Akaikeinformationcirterion，AIC)值最小的作为 最合适的剂量-反应模型[45]，在该模型下，以BMR=5%分别计算各指标的BMD及其可信限 下限（Benchmarkdoselowerconfidencelimit，BMDL),根据BMD及BMDL的大小判断各效 应指标的敏感性，BMD及BMDL越小，则该效应指标越敏感。
[0018] 2.6数据处理 采用SPSS13. 0统计软件录入数据，剂量资料进行正态性检验，满足正态分布的结果 以[±s表示，经方差齐性检验，满足方差齐性的采用单因素方差分析，不满足的采用独立 样本秩和检验。剂量-反应（效应）关系采用Spearman秩相关分析，检验水准a=0. 05。基 准剂量计算采用美国EPA提供的BMDSV2. 0软件。
[0019] 3质量控制 3. 1实验室操作 仪器设备：所以实验仪器在使用前，要进行检查并校准，严格按照仪器使用操作规程进 行。
[0020] 实验操作：选择合格的实验动物，并保证足够的样本例数；实验环境和营养等实 验条件，符合国家有关标准；实验指标的检测过程中，均由一人操作；对样本进行检测应尽 早尽快，避免反复冻融。
[0021] 3. 2数据分析 采取双人录入数据，认真、仔细地进行核对，数据分析要严格按照统计学方法要求，以 确保数据的准确性。
[0022] 4?结果与分析 4. 1对肝脏血清酶学指标的影响 随着染毒剂量的增加，染毒组血清AST、ALT、CHE的活性均呈上升的趋势，其中，中、高 剂量组ALT、CHE的升高具有统计学意义（P〈0. 05) ;AST则仅有高剂量组的升高具有统计学 意义（P〈0. 05)。详见表1。
【权利要求】
1. 一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法，其特征在于：该方法利 用固相萃取法提取饮用水中的有机污染物，对大鼠进行经口亚慢性灌胃染毒，染毒动物模 型成功后，对大鼠进行心脏取血，分离血清，应用全自动生化分析仪检测进行肝功能检，将 数据进行统计分析，评估肝脏毒性的敏感监测指标。
2. 根据权利要求1所述的一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法， 其特征在于：采用固相萃取法富集水中有机污染物，萃取剂为XAD-2树脂，洗脱剂为二氯甲 烷和甲醇，水样过柱流速为4倍柱体积/min，过柱完后依次用3倍柱体积的二氧甲烷和甲醇 先后洗柱，流速〇. 1倍柱体积/min，洗脱液经旋转蒸发仪25°C减压蒸馏挥干，将已挥干的浓 缩提取物用玉米油定容至50L/ml (母液）-200C冰箱保存备用。
3. 根据权利要求1所述的一种评价有机污染物致大鼠肝功能损伤指标敏感性的方法， 其特征在于：计算大鼠肝功能相关指标AST、ALT、CHE、ALB的41(：、81?、81?1，在拟合优度检 验P > 0.05的模型中选择AIC值最小的作为最合适的剂量-反应模型，通过BMD模拟的 最优剂量-效应曲线，以AST、ALT、CHE、ALB为效应标志物计算得出有机污染物暴露剂量的 BMD、BMDL，根据各指标BMD和BMDL值大小，评估肝功能指标的敏感性。
【文档编号】G01N33/92GK104459166SQ201410739947
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞