一种检测钠离子浓度的方法
【专利摘要】本发明提供一种检测钠离子浓度的方法。方法包括：配制标准溶液DNA酶体系；配制待测溶液DNA酶体系；配制标准溶液及待测溶液；测量标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲线；测量待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据标准曲线，得到待测样品中钠离子的浓度。本发明利用DNA酶特异识别钠离子调控的G-四链体结构，可在生理钾离子浓度下操作而不受影响，对钠离子特异性高；使用DNA酶设计的探针，对钠离子调控的G-四链体结构变化十分敏感，伴有颜色的改变，同时在紫外吸收光谱中展现出明显的变化；只需要紫外吸收光谱仪，测试成本低廉；所用试剂品种少，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，环保无污染。
【专利说明】一种检测钠离子浓度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种检测钠离子浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 人体内的钠是维持细胞生理活动的主要阳离子，是保持机体的正常渗透压及酸碱 平衡，参与糖及蛋白质代谢，保证神经肌肉的正常功能所必需，其含量是人体生理活动的重 要指标。尿液、血清中钠离子的含量水平在临床上可用于诊断一些肾脏、心脏等方面的疾 病。
[0003]正常情况下，人体的钠离子浓度有一个合理的参考范围，如血清中：135? 155mmol/L;尿液中130?260mmol/24h。当钠离子高于参考值，表现出高钠症，其原因主要 有：急性肾功能衰竭、严重溶血或组织损伤、急性酸中毒或组织缺氧、肾上腺皮质功能减退、 醛固酮缺乏、长期应用利尿剂等。血清钠高还可引起严重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性 应激紊乱，以及特异的心电图改变。反之当钠的摄入量不足、钠丢失严重、肾脏疾病转入多 尿期等情况时则会出现低钠症。
[0004] 现有技术中测定钠离子浓度的方法主要有：中子活化法、同位素稀释质谱法、化学 测定法、火焰光度法、离子选择电极法、酶动力学法、原子分光光度法等。目前，临床上经常 使用的方法是火焰光度法和离子选择电极法。
[0005] (1)火焰光度法：火焰光度法是一种发射光谱分析法，利用火焰中激发态原子回 降至基态时发射的光谱强度进行含量分析，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+，该方 法属于经典的标准参考法，优点是结果准确可靠，广为临床采用。
[0006] (2)离子选择电极法（ISE法）：在专用仪器上进行血清和尿液的钠离子测定。因 其具有标本用量少，快速准确，操作简便等优点，是目前所有方法中最为简便准确的方法， 几乎有取代其他方法的趋势。其原理是：离子选择电极是一种电化学传感器，其结构中有一 个对特定离子具有选择性响应的敏感膜电极，将离子活度转换成电位信号，在一定范围内， 其电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系，通过与已知离子浓度的溶液比较可求得 未知溶液的离子活度，按其测定过程又分为直接测定法和间接测定法，目前大部分采用间 接测定法，由于间接测定法将待测样本稀释后测定，所测离子活度更接近离子浓度。目前主 要的电极种类有：玻璃膜电极，感应材料为玻璃膜；固相电极，由难溶金属物质加压成型； 液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙烯作为感应膜；缬氨霉素膜制成的K+电极。这些电 极都具有一定寿命，使用一段时间后，电极会老化，且价格昂贵。
[0007] (3)酶法：酶法测定钠的原理是利用对丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯 醇式丙酮酸变为乳酸同时伴有还原型辅酶I的消耗，在波长340nm处测NADH的吸光度下 降。
[0008] (4)原子分光光度法也可用于检测血清中钠离子，但操作复杂，误差较大，不及火 焰光度法简便。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种检测钠离子浓度的方法。
[0010] 本发明所提供的检测钠离子浓度的方法，包括下述：
[0011] ⑴配制标准溶液DNA酶体系
[0012] 用含钾离子的缓冲液溶解可溶性钠盐配置多个浓度梯度的钠离子溶液，分别向每 个浓度梯度的钠离子溶液中均加入DNA，得到多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系；所述 多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系反应后，得到多个构型不同的DNAG-四链体的体系， 分别向各个所述DNAG-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血红素含量相同的多个 DNAG-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNAG-四链体-氯化血红素体系反应后，得到 多个标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA;
[0013] (2)配制待测溶液DNA酶体系
[0014] 将待测样品加入到所述含钾离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品 溶液中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA的含量 与所述多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述待测样品-DNA体 系反应后，得到DNAG-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素,反应后，得到DNAG-四 链体-氯化血红素体系，所述DNAG-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述 多个DNAG-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同；所述DNAG-四链体-氯 化血红素体系反应后,得到待测溶液DNA酶体系；
[0015] (3)标准溶液及待测溶液的配制
[0016] 将2, 2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐ABTS溶液与H202混 合，得到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DNA酶体系中的每一个标 准溶液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶 液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本；
[0017] (4)标准曲线的制备
[0018] 测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钠离子浓度与吸光强度值 的标准曲线；
[0019] (5)待测样本检测
[0020] 测量所述多个待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述 待测样品中钠离子的浓度。
[0021] 上述方法所述（1)中，所述多个可为2个以上，如7个。
[0022] 上述方法所述（1)中，所述含钾离子的缓冲液通过下述至少一种缓冲液制备得 到：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲 液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、柠 檬酸-柠檬酸钾缓冲液。
[0023] 所述含钾离子的缓冲液的pH值为6. 2-8. 2。
[0024] 所述钾离子来源于可溶性钾盐，如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、溴化钾或碘化钾。
[0025] 所述可溶性钠盐的非限制性实例包括：氯化钠、溴化钠、碘化钠和硝酸钠等。
[0026] 上述方法所述（1)中，所述DNA为能够形成G-四链体的DNA，所述能够形成 G-四链体的DNA选自下述至少一种：GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG(核苷酸序列如序列 表中序列1所不）、agggttagggttagggttaggg(核昔酸序列如序列表中序列2所不）和TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列3所示）。
[0027] 上述方法所述（2)中，所述待测样品为人或动物血液、尿液或其他体液。
[0028] 上述方法所述（3)中，所述混合液中的ABTS与H202的摩尔浓度比为0. 1?50,优 选为0. 2?10。
[0029] 所述标准溶液样本中的钾离子浓度可为大于0小于等于30mmol/L，如0-10mm〇l/ L、l_5mmol/L或 2-4mmol/L〇
[0030] 所述标准溶液样本中的DNA分子的浓度可为0.01?10iimol/L，如0? 1?2iimol/ L〇
[0031] 所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度可为0.01?10ymol/L，如0. 1? 2ymol/L〇
[0032]上述方法所述（1)、（2)和（3)中，所述反应的时间均为0.1-3小时。
[0033] 上述方法所述（3)中，所述待测溶液样本中的钾离子浓度、DNA分子的浓度、和氯 化血红素的浓度分别与所述标准溶液样本中的钾离子浓度、DNA分子的浓度、和氯化血红素 的浓度相等。
[0034] 本发明的方法可以方便地用于检测各种溶液样品中的钠离子浓度，例如，可以检 测人或动物血液、尿液或其他体液中的钠离子浓度。
[0035] 本发明的方法的主要优点在于：
[0036] 1)本发明利用DNA酶特异识别钠离子调控的G-四链体结构，可在生理钾离子浓度 下操作而不受影响，对钠离子特异性高；
[0037] 2)本发明使用DNA酶设计的探针，对钠离子调控的G-四链体结构变化十分敏感， 伴有颜色的改变，同时在紫外吸收光谱中展现出明显的变化；
[0038] 3)本发明所设计的探针，只需要紫外吸收光谱仪，测试成本低廉，便于行业内推广 应用；
[0039] 4)本发明所用试剂成分只有4?5种，只需按比例混合就可检测，操作简单、快捷 且成本低廉，该体系在缓冲液环境中操作，环保无污染；
[0040] 5)本发明所用试剂成分简单、种类少，相互之间不会产生影响，且稳定性好，可长 时间储存，能很好保证应用测试效果；
[0041] 6)应用本发明提供的检测方法可以用来测定人体和其它动物体内钠离子的含量， 也可用来检测水质等其他样本中的钠离子水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1为标准溶液样本中钾离子浓度为10mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
[0043] 图2为标准溶液样本中钾离子浓度为7mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
[0044] 图3为标准溶液样本中钾离子浓度为3mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
[0045] 图4为标准溶液样本中钾离子浓度为15mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
[0046] 图5为标准溶液样本中钾离子浓度为3mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
[0047] 图6为标准溶液样本中钾离子浓度为8mmol/L时，钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线。
【具体实施方式】
[0048] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所 用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 下述实施例中用于测量吸光值的仪器为安捷伦-可见光谱仪（Agilent 8453UV-visiblespectrophotometer)；HitachiF4500spectrofluoromete;r(Japan)。會泛够 形成G-四链体的DNA均购自上海生工生物技术有限公司。
[0051] 实施例1
[0052] 对两个尿液样本的钠离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钠离子浓度如下：尿 样1为148. 3mmol/L、尿样2为31. 3mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的 DNA为AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(核苷酸序列如序列表中序列2所示）。
[0053] 将0. 1ymolDNA样品溶解于lmL不含金属离子的Tris-HCl缓冲液（pH7. 4)中，制 备浓度为100Umol/L的DNA母液，用于G-四链体-氯化血红素DNA酶的配制。
[0054] (1)配制标准溶液DNA酶
[0055] 用28.L含有12. 4mmol/L钾离子的Tris-HCl缓冲溶液溶解可溶性钠盐配制 多个浓度梯度的钠离子溶液，分别向每个浓度梯度的钠离子溶液中加入1. 5iiL100iimol/ L的DNA母液，反应0. 1-3小时，得到一系列构型不同的DNAG-四链体的体系，分别向所述 DNAG-四链体的体系中的每一个中加入20iiL的10iimol/L的氯化血红素溶液，反应0. 1-3 小时，得到50iiL-系列含G-四链体-氯化血红素DNA酶的体系；
[0056] (2)配制待测溶液DNA酶
[0057] 将17. 5iiL尿样1加入到lliiL含有12. 4mmol/L钾离子Tris-HCl缓冲溶液中， 向得到的溶液中加入和步骤（1)相同量的DNA，反应0. 1-3小时，得到DNAG-四链体的体 系，向该体系中加入和步骤（1)相同量的氯化血红素，反应〇. 1-3小时，得到50yL待测溶 液DNA酶体系；
[0058] (3)标准溶液和待测溶液的配制
[0059] 取225iiL105mmol/L的2, 2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐 (ABTS)加入 3375iiLTris-HCl(含有 12. 4mmol/LK+)，平均分到 9 个管里，每份 400iiL，在 每份中随后加入50iiL9mmol/L的H202，形成显色底物。将步骤（1)和步骤（2)的50iiL含 G-四链体-氯化血红素DNA酶加入上述显色底物，反应10分钟，得到标准溶液样本和待测 溶液。（其中，标准溶液样本钠离子浓度分别为〇、2、4、6、8、10、15mmol/L，标准溶液样本和 待测溶液中，DNA分子的浓度均为0? 3ymol/L，氯化血红素的浓度均为0? 4ymol/L)
[0060] (4)标准曲线的制备
[0061] 测量标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钠离子浓度与吸光强度值的标准曲 线，如图1。
[0062] (5)待测样本检测
[0063] 测试溶液在420nm处的吸光度在标准曲线上找到对应的钠离子浓度，将测得的吸 光度与步骤（4)中得到的标准溶液样本的吸光度进行比较，结合尿液1的稀释比例（待测 样本溶液中尿液1占3. 5% )，计算出尿液1中的钠离子浓度为145. 2mmol/L，与尿样1中钠 离子的实际浓度（148. 3mmol/L)吻合，得到尿液2中的钠离子浓度为32. 6mmol/Lmmol/L，与 尿样2中钠离子的实际浓度（31. 3mmol/L)吻合。
[0064] 实施例2
[0065] 对两个尿液样本的钠离子浓度进行验证，各尿液样本的实际钠离子浓度如下：尿 样3为65.Ommol/L、尿样4为47. 9mmol/L。在本实施例中使用的能够形成G-四链体的DNA为
【权利要求】
1. 一种检测钠离子浓度的方法，包括下述： (1) 配制标准溶液DNA酶体系 用含钾离子的缓冲液溶解可溶性钠盐配置多个浓度梯度的钠离子溶液，分别向每个浓 度梯度的钠离子溶液中均加入DNA，得到多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系；所述多个 DNA含量相同的钠离子-DNA体系反应后，得到多个构型不同的DNA G-四链体的体系，分别 向各个所述DNA G-四链体的体系中加入氯化血红素，得到氯化血红素含量相同的多个DNA G-四链体-氯化血红素体系，所述多个DNA G-四链体-氯化血红素体系反应后，得到多个 标准溶液DNA酶体系；所述DNA为能够形成G-四链体的DNA ; (2) 配制待测溶液DNA酶体系 将待测样品加入到所述含钾离子的缓冲液，得到待测样品溶液，向所述待测样品溶液 中加入所述DNA，得到待测样品-DNA体系，所述待测样品-DNA体系中所述DNA的含量与所 述多个DNA含量相同的钠离子-DNA体系中所述DNA的含量相同；所述待测样品-DNA体系 反应后，得到DNA G-四链体的体系，向该体系中加入氯化血红素，反应后，得到DNA G-四链 体-氯化血红素体系，所述DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量与所述多 个DNA G-四链体-氯化血红素体系中的氯化血红素含量相同；所述DNA G-四链体-氯化 血红素体系反应后，得到待测溶液DNA酶体系； (3) 标准溶液及待测溶液的配制 将2, 2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐ABTS溶液与H202混合，得 到混合液，将该混合液称为底物溶液，向所述多个标准溶液DNA酶体系中的每一个标准溶 液DNA酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到多个标准溶液样本；向所述待测溶液DNA 酶体系中加入所述底物溶液进行反应，得到待测溶液样本； (4) 标准曲线的制备 测量所述多个标准溶液样本在420nm处的吸光度，绘制钠离子浓度与吸光强度值的标 准曲线； (5) 待测样本检测 测量所述待测溶液样本在420nm处的吸光度，根据所述标准曲线，得到所述待测样品 中钠离子的浓度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述（1)中，所述含钾离子的缓冲液通过 下述至少一种缓冲液制备得到：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、三乙 醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、磷酸二 氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钾缓冲液； 所述含钾离子的缓冲液的pH值为6. 2-8. 2。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述能够形成G-四链体的 DNA 选自下述至少一种：GGGCCAGGGAGCGGGGCGGAGGGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 和 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG 〇
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述（3)中，所述混合液中的 ABTS与H202的摩尔浓度比为0. 1?50 ; 所述标准溶液样本中的钾离子浓度大于〇小于等于30mmol/L ; 所述标准溶液样本中的DNA分子的浓度为0. 01?10 y mol/L ; 所述标准溶液样本中氯化血红素的浓度为0. 01?10 y mol/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述（2)中，所述待测样品为 人或动物体液。
【文档编号】G01N21/78GK104458728SQ201410743760
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】孙红霞, 陈宏博, 唐亚林 申请人:中国科学院化学研究所