25-羟基维生素d定量检测试纸条及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种25-羟基维生素D定量检测试纸条及其应用，属于医用试剂领域。本发明提供的试纸条包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫和PVC衬板，所述样本垫上包被有25-OH VD活化的乳胶微粒和/或1，25-(OH)2VD活化的乳胶微粒，所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-OH VD单克隆抗体及抗VDBP单克隆抗体，所述NC膜依次包括T线和C线，所述T线上包被有25-OH VD-BSA和部分表达的人VDBP，所述C线上包被有羊抗鼠抗体。采用本发明试纸条，无需样本预处理，能够快速、准确测定样品中维生素D的含量。
【专利说明】25-哲基维生素D定量检测试纸条及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种25-哲基维生素D定量检测试纸条及其应用，属于医药制剂领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着研究的不断深入，人们对维生素D(VD)有了更多的认识，VD是所有生 物活性物质中一个非常独特的成员，具有多种作用，它是维生素，但本质上是激素，还可能 是细胞因子。因为VD是来源于食物的必需营养物，而且人体需要量非常小，所W说它是维 生素。它主要是在紫外线的照射下从皮肤内的7-脱氨胆固醇转变而来，然后随血液运行到 全身发挥作用，所W属于类固醇类激素。人们逐渐认识到它具有更广泛的生理作用，除了调 节巧磯代谢外，还具有抗增殖、抗分化、调节细胞调亡、介导免疫反应、调节多种内分泌腺激 素的分泌、调节造血组织造血的作用。该些功能是VD的类似物骨S醇（1，25-(0H)2VD)通过 与具有VD受体（VDR)的细胞相结合并经过一系列生理生化过程而起作用的。该些肾外来 源的骨S醇，作用于细胞周围的某一部位，所W按照其作用也可W认为是一种细胞因子。无 论如何，VD及其类似物在临床上的重要意义越来越受到人们的重视，如何更加科学合理使 用将是我们现在面临的重要课题。
[0003] 维生素D是一种必须经过代谢转变才能达到最佳巧化醇生物活性的脂溶性类固 醇衍生物。皮肤合成的维生素D3或小肠吸收的维生素D由维生素D结合蛋白（vitamin D binding protein, VDB巧运输，需在肝脏25-哲化酶CYP2R1和肾脏1 a -哲化酶 CYP27B1的催化下经2次酶促经化反应形成最终的活性代谢产物1，25 -二哲基维生素 03(1，化-(0H)2VD)，与维生素D受体（vitamin D rec巧tor，VDR)结合发挥生物学功能。VDBP 由肝脏合成，分子量为51335,含有458个氨基酸残基，与维生素D具有高度亲和力。每个 VDBP分子都含有一个VD结合位点，其结合氨基酸位点为35-49氨基酸序列构成的结构域。 因此，在血液中，VDBP存在两种形式，即与VD及其代谢物亲和结合的结合型VDBP (占VDBP 总量的5% )和VD结合位点空缺的游离型VDBP。
[0004] 人体的维生素D的活性形式是1，25二哲维生素D3 (1, 25-hy化oxyvitamin D3)，是 因为它是在1位和25位有两个哲基，其中25哲化是在肝脏完成的，1哲化是在肾脏完成的， 而25哲VD3可W作为机体缺乏VD的指示指标。VD的主要功能是促进小肠巧磯的吸收，促 进肾脏对巧磯的重吸收，调节体内巧磯代谢。所W，缺乏VD即使膳食中巧的量足够多，也会 有缺巧现象的。不过，VD不易缺乏，因为人体内是可W合成的，晒晒太阳就行了，但是有严 重肝、肾疾病的人就例外了，因为上述的VD3的哲化过程无法进行。
[0005] 1，25(0H)2VD在体内的半衰期大约是化，其浓度比25-0H VD低约1000倍，并受血 清PTH、Ca2+及磯酸盐浓度的严格调控。1，25(0H) 2VD水平不能反映人体维生素D状态，但是 其升高与甲状腺机能亢进有关。因此，测定血清1，25 (0H) 2VD含量对获得性或遗传性25-0H VD和磯酸盐代谢素乱（如慢性肾病、遗传性磯酸盐缺乏素乱、肿瘤引起的骨软化、缺乏性何 偿病、慢性肉芽肿形成障碍）辅助诊断有重要价值。
[0006] 目前，用于血清1，25 (0H)2VD测定方法有HPLC、LC-MS/MS、RIA、化IA等方法，其中 由于HPLC、LC-MS/MS样本处理难、检测成本高等原因，在临床应用较少。目前，由于侧向层 析技术的灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成本低等特点，应用越来越广。
[0007] 侧向层析技术，按其原理可分为两类，一类是W酶促反应显色为基础，W显色高度 来定量；另一类则使用着色标记物如乳胶微粒、胶体砸、胶体金W及脂质体等，层析时，标记 物与待测物反应形成的复合物被相应的固定在层析材料上的配体捕获而富集显色，根据层 析材料上显色条带的有无或多少来定性或定量。W酶促反应显色为基础的免疫层析技术由 于待测物的定量是W试纸条上W酶活性为依据，故其测量结果受酶稳定性W及样品基质、 抑值、温育时间和温度等环境因素的影响。
[000引免疫胶体金技术是继=大标记技术（巧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的 固相标记免疫测定技术。80年代出现在临床诊断领域的胶体金免疫层析（colloidal gold immunoc虹omatography assay, GICA)快速诊断试纸条是建立在金标免疫渗滤基础上的一 种免疫检测技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、携 带方便等优点，己成为临床实验诊断领域发展的一个新方向。因此，开发25-哲基维生素D 测试试纸条在维生素D缺乏症的辅助诊断中有重要价值。
[0009] 但是，在血清中80%w上25-0H VD与VDBP结合，通常的免疫检测方法是利用样本 预处理液（如有机溶剂等蛋白变性剂）处理，将25-0H VD从VDBP解离释放后测定；或采用 酸性的反应体系（pH4. 0-6. 0)进行测定；或采用高浓度的VDBP亲和结合物竞争释放25-0H VD，该些方法存在样本稀释过程或25-0H VD释放不完全或亲和结合物的亲和性等因素限 审IJ。因此，研发一种无需样本预处理、检测结果准确的25-哲基维生素D含量测定方法成为 目前的难题。
【发明内容】
[0010] 根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种W 25-哲基维生素D为目标物的检 测试纸条，所述试纸条利用侧向层析原理，无需样本前处理，直接测定样本中25-0H VD的含 量。
[0011] 本发明请求保护的技术方案如下：
[0012] 一种用于25-哲基维生素D定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫 及PCV衬板；所述样本垫、结合垫、NC膜和吸水垫按样品层析方向依次设置于PCV衬板上；
[0013] 其特征在于；所述样本垫采用具有网状结构且可W捕获粒径为2. 0-2. 6 ym之间 的颗粒物的纤维垫，且包被有25-哲基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二哲基维生 素D活化的乳胶微粒；
[0014] 所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-哲基维生素D单克隆抗体和胶体金标记 的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体；
[0015] 所述NC膜上包括检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫，包被有25-哲基 维生素D-牛血清白蛋白偶联物和重组人维生素D结合蛋白，所述质控线靠近吸水垫，包被 有羊抗鼠抗体。
[0016] 所述样本垫上25-哲基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二哲基维生素D活 化的乳胶微粒的包被浓度为0. 5-10 y g/cm2。
[0017] 所述结合垫上胶体金标记的抗25-哲基维生素D单克隆抗体的浓度为0-10 y 1/ cm2;所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓度为0-10 y 1/cm 2。
[001引所述NC膜的检测线上25-哲基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度为 1. 0-2. 0 y g/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为0-2. 0 y g/条；所述质控线上 羊抗鼠抗体的包被浓度为0. 5-2. 0 y g/条。
[0019] 所述重组人维生素D结合蛋白为具有人维生素D结合蛋白第159-458位氨基酸序 列的多肤。
[0020] 所述样本垫上25-哲基维生素D活化的乳胶微粒和/或1，25-二哲基维生素D活 化的乳胶微粒的包被浓度为2. 0 y g/cm2;所述结合垫上胶体金标记的抗25-哲基维生素D 单克隆抗体的浓度为10 y 1/cm2,所述胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克隆抗体的浓 度为10 y 1/cm2;所述NC膜的检测线上25-哲基维生素D-牛血清白蛋白偶联物的包被浓度 为1. 0 y g/条，所述重组人维生素D结合蛋白的包被浓度为1. 0 y g/条；所述质控线上羊抗 鼠抗体的包被浓度为0. 8 y g/条。
[0021] 一种用于25-哲基维生素D定量检测的方法，其特征在于：采用任一所述的试纸条 检测样品中25-哲基维生素D的总含量，其步骤如下：
[0022] (1)将待测样品滴加在样本垫上，室温反应15min ;
[002引 （2)待质控线显色后，将试纸条放入读条仪，读取样品中25-OH VD的浓度。
[0024] 一种用于25-哲基维生素D定量检测的检测卡，包含任一所述的试纸条及卡盒，其 特征在于；所述卡盒包括盒盖和盒底；所述试纸条设置于所述卡盒的盒底；所述卡盒的盒 盖上具有加样孔和观察窗，所述加样孔正对所述试纸条上的样本垫，所述观察窗正对所述 试纸条上的检测线和质控线。
[0025] 本发明基于固相分离技术与免疫侧向层析技术提供一种用于25-哲基维生素 D(25-0H VD)定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫及PCV衬板等结构。所 述试纸条采用特别的侧向层析系统，无需样本前处理，直接测定样本中25-OH VD的总含量。
[0026] 本发明试纸条的样本垫为具有网状结构的纤维垫，可W捕获粒径为2. 0-2.6 ym 之间的颗粒物，其上包被有25-哲基维生素D活化的乳胶微粒（LP-25-OH VD)和/或1， 25-二哲基维生素D活化的乳胶微粒（LP-1，25- (OH) 2VD)。所述LP-25-OH VD为25-OH VD-BSA与活性乳胶微粒（L巧通过1-(3-二甲基氨基丙基）-3-己基碳二亚胺巧DC)法共价 偶联而得。所述样本垫可W捕获样本中游离的VDBP，使游离型VDBP与结合型VDBP分离。 其原理是具有网状结构的样本垫固定的VDBP亲和结合物（如25-OH VD)活化的乳胶微粒 利用层析原理竞争释放25-OH VD，VDBP与25-OH VD亲和力较高化a = 5X 108M-i)且VDBP 高浓度存在（18?65 y g/L)，而竞争结合物不能完全释放25-OH VD，从而捕获游离型VDBP， 而结合型VDBP和游离的25-OH VD继续向前（吸水垫方向）泳动。
[0027] 本发明试纸条的结合垫上涂布有胶体金（Colloidal Gold, CG)标记的抗25-哲 基维生素D单克隆抗体（CG-anti-25-OH VD)和胶体金标记的抗人维生素D结合蛋白单克 隆抗体（CG-anti-VDBP)。所述CG-anti-25-OH VD可W与样本中游离的25-0H VD结合， CG-anti-VDBP可W与样本中的人VDBP结合。
[002引本发明试纸条的NC膜上从左至右依次包括检测线（T线）和质控线（C线），所述T 线上包被有25-0H VD-BSA和重组人VDBP (rProtein)，所述25-0H VD-BSA能够与样本中游 离的 25-册 VD 竞争结合 CG-anti-25-OH VD，形成 25-0H VD-BSA-CG-anti-25-OH VD 复合物， 该复合物的量与样本中游离的25-OH VD含量相关；所述重组人VDBP为部分表达的人VDBP， 缺少VD结合域氨基酸序列，因此不能与25-哲基维生素D结合，能够与样本中结合型VDBP 竞争结合CG-anti-VDBP，形成巧rotein-CG-anti-VDBP复合物，该复合物的量与样本中结 合型25-0H VD的含量相关。所述C线上包被有羊抗鼠抗体，该抗体能够与CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP结合，用W判定结果的有效性，显色为有效，无色为无效。
[0029] 本发明试纸条的吸水垫和PCV衬板，分别为试纸条提供层析泳动动力、支撑和保 护。
[0030] 本发明试纸条检测样本中维生素D含量的原理是；游离的25-0H VD与NC膜T 线上的包被物25-0H VD-BSA竞争结合CG-anti-25-OH VD，结合了游离型25-0H VD的 CG-anti-25-OH VD继续向前泳动，与NC膜C线上的包被物羊抗鼠抗体结合；结合型VDBP与 T线上的包被物重组人VDBP竞争结合CG-anti-VDBP，结合了结合型VDBP的CG-anti-VDBP 继续向前泳动，与C线包被物羊抗鼠抗体结合。此法为竞争法，即样本中25-0H VD含量 越高，结合在T线上的CG-anti-25-OH VD和CG-anti-VDBP越少，显色越浅，吸光度越低， 反之则越高，由T线显色的深浅即可判定VD的含量。而C线结合CG-anti-25-OH VD和 CG-anti-VDBP仅作为有效性判定，显色则有效，反之则无效。由于1，25-(0H)2VD与25-0H VD的结构极其相似，因此本发明25-0H VD试纸条测定的结果为1，25-(0H)2VD和25-0H VD 的总含量，但是由于1，25-(0H)2VD在血液中的浓度远低于25-0H VD，因此对25-0H VD测定 结果的影响可W忽略。
[0031] 为了提高本发明试纸条检测系统的准确度，发明人从样本垫包被物、样本垫包被 物的浓度、结合垫上胶体金标记抗体的浓度及包被量、T线蛋白种类及包被量等方面进行 了优化。在本发明的一些实施例中，所述样本垫包被物优选LP-25-0H VD和/或LP-1， 25-(0H)2VD，包被浓度为2. 0 y g/cm2;所述结合垫上CG-anti-25-OH VD的浓度为10 y 1/ cm2,所述CG-anti-VDBP的浓度为10 y 1/cm2;所述NC膜T线上25-0H VD-BSA的包被浓度 为1. 0 y g/条，所述重组人VDBP的包被浓度为1. 0 y g/条，所述质控线上羊抗鼠抗体的包 被浓度为0.8 yg/条。
[0032] 本发明还提供一种用于25-哲基维生素D定量检测的方法，采用本发明提供的试 纸条进行检测，只需将少量样品滴加在样本垫上，室温下放置15min，待质控线显色后，将 试纸条放入读条仪，读条仪读取检测线和质控线的吸光度后自动代入仪器预设的校准曲线 (四参数拟合）进行计算，直接给出25-哲基维生素D的浓度。该方法无需进行样本前处 理，操作简便，定量快速准确，便于临床VD含量的测定。
[0033] 综上所述，本发明提供的用于25-哲基维生素D定量检测的试纸条能够快速、准确 的检测样品中维生素D的含量。与现有的检测方法相比，采用本发明试纸条进行VD含量检 测具有W下优点；（1)操作简便；由于血液中80%W上25-0H VD与VDBP结合，常规方法需 要进行样本预处理，使25-0H VD暴露后进行检测，而本发明试纸条采用两种抗体分别捕获 游离型25-0H VD和结合型25-0H VD，无需样本预处理，简化了实验步骤，节约了时间；（2) 定量准确；普通试纸条如果不进行样本预处理，只能检测到游离的25-0H VD，而本发明试纸 条可W同时检测游离型和结合型25-0H VD，准确性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1.本发明试纸条的结构示意图，其中1-PVC衬板，2-样本垫，3-结合垫，4-T线， 5-NC膜，6-C线，7-吸水垫；
[0035] 图 2. Protein 与 anti-VDBP、25_OH VD 结合能力；
[0036] 图3. NC膜T/C线包被示意图；
[0037] 图4.本发明试纸条检测结果与IDS试剂盒检测结果的直线拟合。
【具体实施方式】
[003引 W下通过具体实施例对本发明进行解释，需要说明的是，下述实施例仅作为对本 发明的进一步解释和说明，而不W任何方式限制本发明。
[0039] 试验所用试剂：
[0040] 活性乳胶微粒（Latex Particle):其颗粒表面具有活性基团可W与蛋白质共价结 合，购于Merck公司，货号39510001。
[004U 25-0H VD-BSA ;即25-0H VD与BSA通过共价键偶联获得的偶联物，购于上海惠斯 生物。
[0042] 1，25-(0H)2VD-BSA ;即1，25-(0H)2VD与BSA通过共价键偶联获得的偶联物，购于 上海惠斯生物。
[0043] 25mM MES(2-(N-吗咐基）己横酸（sigma，M367l)缓冲液：称取4. SSg MES于 9〇OmL 超纯水中，完全溶解后调节抑5.0,定容至1L。
[0044] 邸C(l-(3-二甲基氨基丙基）-3-己基碳二亚胺）溶液；sigma, 39391。
[0045] pH7. 510mM PBS ;称取0. 27g磯酸二氨钟（KH2PO4)(国药，10017608)、1. 42g磯酸氨 二钢（化2册04)(国药，100203008)，8g氯化钢（化Cn)(国药，10019308)、0. 2g氯化钟化Cl) (国药，10016308)于900mL超纯水中，完全溶解后调节pH至7. 5,然后用容量瓶定容至1L。
[0046] lOmM Tris-HCl ;称取1. 576g(国药，XW020034)于900血超纯水中，完全溶解后调 节到所需的抑值，然后定容至1L。
[0047] 1 %巧樣酸缓冲液：称取l.Og巧樣酸S钢（国药，10019428)于100血超纯水中， 至完全溶解。
[0048] 5% BSA ;称取 5g BSA(amresco,0332)于 100ml PBS 溶液中，至完全溶解。
[0049] TBS ;50mM Tris -肥l，150mM 化Cl，l. 5mM 邸TA'lOmM DTT，0. 5% Triton X-100， 0. 2mg/ml lysozyme，pH 7. 4。
[0050] 2M肥S04 ;取100血浓硫酸于800ml超纯水中。
[0051] Anti-VDBP ;抗人 VDBP 单克隆抗体，购于公司 Santa cruz，货号 SC-365441。
[0052] Anti-25-OH VD ;即抗25-哲基维生素D抗体，一种可W与25-0H VD亲和结合的免 疫球蛋白，购于Meridian,货号K24124M。
[0053] 读条仪；C10066-10,滨松。
[0化4] 纤维垫：用作样本垫，化sion5, GE。
[0化5] 本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可通过本领域常规方法配制 或商购获得，规格为实验室纯级即可。
[0化6] 实施例1、25-哲基维生素D定量检测试纸条的制备 [0057] (一）VDBP重组蛋白的表达及验证
[0化引巧rotein重组蛋白即人VDBP部分序列159-458氨基酸通过GST融合蛋白的表达 方式在E. coli系统表达（表达载体是阳T28a，采用的E. coli细胞是化21 0E3)，购于北京 全式金生物技术有限公司）。细菌在含有lOOmg/ml氨节西林（23YT-Amp)的LB培养基中 培养，37°C过夜培养后W 1:10比例放大培养。当菌液浓度（A600)达到0. 8-0. 9时，加入 0. 5mM IPTG进行诱导表达。25°C培养12-1化后，离屯、收集菌体并用TBS缓冲液重悬。超声 破碎细菌液，40w，10s，10s，50次；12000巧111，41：离屯、15min，收集上清液。采用GE GSTrap FF纯化柱佑E，71-5016-96AK)进行蛋白纯化，蛋白浓度用A280/A260进行测定。
[0059] 用anti-VDBP和25-0H VD-BSA分别包被微孔板（购于深圳金灿华），1. Oug/ ml(pH7. 510mM PBS)，lOOul/孔。37°C条件下放置2小时后，弃去孔内液体，加入5% BSA， 150ul/孔。37°C条件下放置1小时后，弃去孔内液体，待用。
[0060] 将不同浓度的巧rotein加入上述微孔板中，lOOul/孔，37°C解育1小时；然后 弃去孔内液体，用PBST(pH7. 510mM PBS含0. 05% Tween-20)洗板5次，加入HRP标记的 抗GST抗体（购于北京义翅神州，11213-MM05 ;用PBST W 1:10000的比例稀释），l〇〇ul/ 孔，37°C解育0.5小时；然后弃去孔内液体，用PBST洗板5次，加入底物（购于北京索莱 宝，PR1200) 100ul/孔，37°C解育10分钟后加入2M肥S04终止液，50ul/孔，测定其吸光度 (A450nm)。
[00W] 结果如图2所示，重组蛋白巧rotein可W与anti-VDBP结合，而不与25-0H VD结 厶 口 〇
[00创（二）25-0H VD活化的乳胶微粒的制备
[0063] 1、乳胶微粒（LP)的活化
[0064] 取Img乳胶微粒，用1血25mM MES (抑5. 0)缓冲液洗漆3次（每次混匀lOmin);
[00化] (1)配制 lOmg/mL EDC(M = 191. 7g/mol，C = 52mM)溶液巧DC 溶解于冷的 25mM MES，抑5. 0)。
[0066] 0)将 Latex Particle 用 440 y L 25mM MES (抑5. 0)重悬。
[0067] 做加入10 y L EDC溶液，充分混匀，缓慢振摇，30min，室温。
[0068] (4)将反应完成的离屯、管离屯、（3000rmp，5min)，去除上清，并用1血25mM MES，抑 5.0洗漆3次。
[0069] 2、Latex Particle 包被
[0070] (1)用 300 y L 25mM MES,抑 5. 0 重悬 Latex Particle ;
[007U (2)加入 lOul lOmg/ml 25-Hy化oxy Vitamin D3-BSA(上海惠斯生物）（25mM MES, 抑5. 0)溶液；
[007引 （3)用25mM MES,抑5. 0使反应体系定容为500 y L，充分混匀；
[007引 （4)缓慢振摇，室温30-120min或4°C 2小时；
[0074] 妨将反应完成的离屯、管离屯、（3000rmp，5min)，去除上清。
[0075] 3、Latex Particle 洗漆和保存
[0076] (1)用 500 y L 25mM MES (pH 5. 0)洗漆 4 次；
[0077] (2)力口入 100 y L 0. 1-0. 5% BSA (amresco, 033。，3〇-60min，室温；
[007引 做用 lOOyL 50mM Tris-肥l(pH 6. 8,含 1% Tween-20) (sigma，441。）洗漆 4 次，得25-OH VD活化的乳胶微粒（LP-25-0H VD);
[0079] (4)加入 1血 5% BSA 保存。
[0080] (S)金标结合物的制备
[00川 （1)取100血0.01% HAuC14(国药，10010711)溶液，加热至沸腾。
[00間 似加入2. 0血1 %巧樣酸S钢溶液，加热揽拌15min。
[0083] (3)关掉加热旋扭，适当速度揽拌至室温，得胶体金溶液（Colloidal Gold, CG)。
[0084] (4)量取20. OmL的胶体金置于100. OmL的小烧杯中，在揽拌的状态下缓慢加入 0. 4mg 待标记蛋白（如 anti-VDBP、anti-25-OH VD)，揽拌 30min。
[0085] (5)加入5 % BSA至终浓度为1 %，继续揽拌30min。
[0086] (6) W 12000r/min 离屯、30min，弃去上清液，用 PBST 重悬。
[0087] (7) W 12000r/min 离屯、30min，弃去上清液，用 PBST 重悬。
[0088] (8) W 12000r/min离屯、30min，弃去上清液，沉淀用1% BSA重悬，得到1. 0血浓缩 物（即金标结合物），置4°C冰箱备用。
[0089] (四）样本垫、结合垫的预处理
[0090] (1)将样品垫（化Sion 5,G巧和结合垫（上海金标生物科技有限公司）用1% BSA 浸泡30min，37°C烘干。
[OOW] (2)将25-0H VD活化的乳胶微粒（LP-25-0H VD，2. Oug/cm2)涂布于样本垫上，37°C 烘干。
[009引 （3)取金标结合物滴加到结合垫上（l0uL/cm2)，37°C烘干。
[0093](五）T/C线（检测线/质控线）包被
[0094] C线（质控线）；用Img/mL羊抗鼠抗体包被NC膜（135s，Millipore)C线（见图 3a、图 3b)，每条 1.0uL37°C干燥。
[0095] T线（检测线）；将1. Omg/mL 25-哲基维生素D-牛血清白蛋白偶联物和1. Omg/mL 的重组人维生素D结合蛋白按照1 ;5的比例混合包被NC膜（135s，Millipore)(见图3c、 图3d)，每条包被1. 0 y g混合物，37 °C干燥。
[0096] (六）组装试纸条
[0097] 将样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫（C册7M，上海金标生物科技有限公司）、PVC衬板 (上海金标生物科技有限公司）、卡盒（金灿华），由下到上，由内到外进行组装（见图1)。 [009引实施例2、样本垫包被物的选择
[0099] 通过优选样本垫包被物W提高本发明试纸条检测系统的性能。根据测定结果，采 用2例临床样本（25-0H维生素D含量高值H、低值L)按照表1制备添加回收样本，计算回 收率，选择最优的包被物。
[0100] 表1添加回收样本制备方法
[0101]
【权利要求】
1. 一种用于25-羟基维生素 D定量检测的试纸条，包括样本垫、结合垫、NC膜、吸水垫 及PCV衬板；所述样本垫、结合垫、NC膜和吸水垫按样品层析方向依次设置于PCV衬板上； 其特征在于：所述样本垫采用具有网状结构且可以捕获粒径为2. 0-2. 6 ym之间的颗 粒物的纤维垫，且包被有25-羟基维生素 D活化的乳胶微粒和/或1，25-二羟基维生素 D 活化的乳胶微粒； 所述结合垫上涂布有胶体金标记的抗25-羟基维生素 D单克隆抗体和胶体金标记的抗 人维生素 D结合蛋白单克隆抗体； 所述NC膜上包括检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫，包被有25-羟基维生 素 D-牛血清白蛋白偶联物和重组人维生素 D结合蛋白，所述质控线靠近吸水垫，包被有羊 抗鼠抗体。
2. 根据权利要求1所述的试纸条，所述样本垫上25-羟基维生素 D活化的乳胶微粒和 /或1，25-二羟基维生素 D活化的乳胶微粒的包被浓度为0. 5-10 y g/cm2。
3. 根据权利要求1所述的试纸条，所述结合垫上胶体金标记的抗25-羟基维生素 D单 克隆抗体的浓度为0-10 U 1/cm2;所述胶体金标记的抗人维生素 D结合蛋白单克隆抗体的 浓度为 0-10 u 1/cm2。
4. 根据权利要求1所述的试纸条，所述NC膜的检测线上25-羟基维生素 D-牛血清 白蛋白偶联物的包被浓度为1. 0-2. 0 y g/条，所述重组人维生素 D结合蛋白的包被浓度为 0-2. 0 y g/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为0. 5-2. 0 y g/条。
5. 根据权利要求1所述的试纸条，所述重组人维生素 D结合蛋白为具有人维生素 D结 合蛋白第159-458位氨基酸序列的多肽。
6. 根据权利要求1所述的试纸条，所述样本垫上25-羟基维生素 D活化的乳胶微粒和 /或1，25-二羟基维生素 D活化的乳胶微粒的包被浓度为2. 0 y g/cm2;所述结合垫上胶体 金标记的抗25-羟基维生素 D单克隆抗体的浓度为10 y 1/cm2,所述胶体金标记的抗人维生 素 D结合蛋白单克隆抗体的浓度为10 y 1/cm2;所述NC膜的检测线上25-羟基维生素 D-牛 血清白蛋白偶联物的包被浓度为1. 〇 u g/条，所述重组人维生素 D结合蛋白的包被浓度为
1. 〇 u g/条；所述质控线上羊抗鼠抗体的包被浓度为〇. 8 y g/条。
7. -种用于25-羟基维生素 D定量检测的方法，其特征在于：采用权利要求1-6任一 所述的试纸条检测样品中25-羟基维生素 D的总含量，其步骤如下： (1) 将待测样品滴加在样本垫上，室温反应15min ; (2) 待质控线显色后，将试纸条放入读条仪，读取样品中25-OH VD的浓度。
8. -种用于25-羟基维生素 D定量检测的检测卡，包含权利要求1-6任一所述的试纸 条及卡盒，其特征在于：所述卡盒包括盒盖和盒底；所述试纸条设置于所述卡盒的盒底；所 述卡盒的盒盖上具有加样孔和观察窗，所述加样孔正对所述试纸条上的样本垫，所述观察 窗正对所述试纸条上的检测线和质控线。
【文档编号】G01N33/577GK104502599SQ201510005097
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月5日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】肖智, 焦守恕, 李全 申请人:同昕生物技术（北京）有限公司