环保组织固定液及其生产方法与流程

本发明属于生物环保领域，尤其涉及一种环保组织固定液及其生产方法。

背景技术：

组织固定是生物学与医学研究中不可或缺的技术，传统的以福尔马林为主体配方的固定液在让我们窥见生物体秘密的同时，却让研究者饱受了甲醛毒性给我们的灾难。尤其在大量使用甲醛作为组织标本固定液的病理科，取材室内空气中弥散的甲醛浓度高出安全浓度数百至数千倍！

甲醛是健康的一大杀手，是被世界卫生组织确认为对人体有毒害、致癌、致畸形的化学物质，是公认的有毒反应源，在我国有毒化学品控制名单上位居前列。在日常病理组织制片及染色过程中，甲醛作为病理常规试剂被大量应用。这些试剂具有强烈的刺激性和挥发性，不仅污染环境，而且严重危害身体健康.福尔马林是一种高毒性的试剂, Classified carcinogenic of class I by WHO since October 2006, it is demonstrated to be at the proven beginning of respiratory pathologies, allergies and respiratory tract cancers.致癌性分类自2006年10月由世卫组织，它被证明是在呼吸道病症，过敏和呼吸道癌症的成熟的开始。因此，寻找一种对人体无毒无害且安全的甲醛替代品，已成为病理技术工作者的一种迫切愿望。我公司从国外引进环保固定液技术,环保型组织固定液应用于病理技术工作中，高质量保存细胞形态，DNA，蛋白质，RNA.产生同AFA（乙酸+酒精+福马）相似的着色,广泛应用于生态影像，HE,免疫组化，原位杂交等各方面.在组织处理过程中，组织固定至关重要，它直接影响着各种染色效果。甲醛对组织的渗透力强、组织固定均匀、组织收缩小，尽管它具有高毒性，但由于其成本低、能较好地保存组织结构，所以至今仍广泛被人们所接受。但甲醛有如下缺点:

①易挥发，具有较强烈的刺激性和腐蚀性，而防护又极为困难;

②甲醛存放过久易产生白色沉淀( 即三聚甲醛) ，而影响组织标本固定效果;

③甲醛容易氧化变成甲酸，使溶液变为酸性，导致标本酸化，严重时影响细胞核的染色效果;

④不能固定肝糖原和尿酸;

⑤废液需特殊处理，不能直接排入管道，且费用较高;

⑥以醛类为基础的固定液( 如甲醛) 处理标本，可引起组织内广泛的蛋白质交联，免疫组化染色时需进行抗原修复。

研究显示，无交联作用的醇类固定剂在保存DNA 方面比醛类固定剂效果更好。而单纯用乙醇类固定液，易导致核固缩、细胞空泡出现、组织变硬、变脆等缺陷。理想固定液应该是无毒，无致癌性，保护操作者且不污染环境同时还有利于DNA/RNA 生物大分子的修复，以便进行分子生物学研究。虽然国外已有使用甲醛、苯类等替代产品进行病理制片的相关报道，但国内相关报道较少。所以现有的固定液环保性能差。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种环保组织固定液，旨在解决现有的技术方案环保性能差的问题。

一方面，提供一种环保组织固定液，所述环保组织固定液由多元醇、乙酸、冰醋酸和水组成；所述环保组织固定液的PH值为：5.0-6.5，其中，多元醇与冰醋酸的体积比为：120:7。

可选的，所述多元醇为：乙醇或丙醇。

另一方面，提供一种上述环保组织固定液的生产方法，所述方法包括：

101、用精度为0.01ml的50ml移液管吸取35ml的冰醋酸于1L的烧杯中；

102、往烧杯中加入100ml水摇匀后，往烧杯瓶中加入600ml的多元醇，摇匀得到混合溶液；

103、把上述混合溶液移至1L的定量瓶中，加水定量至1L，摇匀，静置10min；

104、取10ml上述溶液，用pH计进行测量，用乙酸稀释液微调pH值至5.0～6.5得到环保组织固定液。

在本发明实施例中，本发明提供的技术方案提供一种环保组织固定液，其没有致癌风险，所以其具有环保性能好的优点。

附图说明

图1为本发明提供的乳腺组织示意图；

图2为本发明提供的宫颈组织示意图；

图3为本发明提供的扁桃腺组织示意图；

图4为本发明提供的小肠粘膜示意图；

图5为本发明提供的染色后的小肠粘膜示意图；

图6为本发明提供的染色后的肝组织示意图；

图7为本发明提供的染色后的食道组织示意图

图8为本发明提供的染色后的胸腺细胞示意图

图9为本发明提供的HPV DNA原位杂交检测示意图；

图10为本发明提供的EBER RNA原位杂交检测示意图；

图11为本发明提供的Ewing’s肉瘤基因转位示意图；

图12为本发明提供的DNA自动序列分析示意图；

图13为本发明提供的环保组织固定液的生产方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明具体实施方式提供一种环保组织固定液，该环保组织固定液由多元醇、乙酸、冰醋酸和水组成；所述环保组织固定液的PH值为：5.0-6.5之间，其中，多元醇与冰醋酸的体积比为：120:7。

本发明提供的全新的环保组织固定液，该组织固定液替代了福尔马林，其具有环保好的优点。

可选的，上述多元醇可以为：乙醇或丙醇。

环保组织固定液的特性和作用

（一）特性

1.物理化学性质

性状：无色透明液体

气味：无味/淡醇香味

溶解性：可溶于水

氧化性：无

2.组成成份

主要成分为水溶性多元醇。

3.作用机制

本品固定属于自然沉淀模式，经固定的组织呈灰褐色，但仍然保持良好的组织弹性，组织固定良好，与福尔马林无明显区别。

4.安全性

根据国际权威专业文献报道，主要成份的毒性和刺激性都非常小，迄今尚未发现受害者，其安全性是甲醛的400-600倍，所以本品的安全性非常高。

5．稳定性和反应性

稳定性：在正常使用或保存条件下十分稳定。

聚合现象：不发生。

6．对生态环境影响的分析

自然条件下容易进行生物降解；生物体内无蓄积作用；在土壤中极易降解；使用后用常规方法处理不会对环境产生危害。

（二）作用

1.适用于病理组织标本、常规染色、组织化学染色、免疫组化染色等，全面替代甲醛。

2.迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有变化。

3.固定液有相当的渗透力，可使组织内外完全固定，且无损伤。

4.缩短脱水、脱脂时间。固定的同时，发生脱水、脱脂作用，缩短了病理切片制作过程中的脱水、透明时间。

5.增加细胞内含物质的折光度，易于鉴别，增加媒染作用和染色作用。

6.蛋白间不发生交联反应，免疫组化效果大大优于甲醛。

具体效果如图1、2、3、4、5、6、7、8所示。

彻底解决了甲醛对病例工作者的影响。长期接触甲醛的人群如医院病理科、外科工作人员等经常吸入少量甲醛能引起慢性中毒、记忆力衰退、体内白细胞数明显下降。

淡黄色液体、气味清香，绿色环保、无毒、无害，彻底解决了甲醛对病理工作者的危害。 适用于病理组织标本、常规染色、组织化学染色、免疫组化染色等，全面替代甲醛。 迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有变化。 固定液有相当的渗透力，可使组织内外完全固定，且无损伤。

甲醛是健康的一大杀手，是被世界卫生组织确认为对人体有毒害、致癌、致畸形的化学物质，是公认的变态反应源，在我国有毒化学品控制名单上位居前列。

甲醛对人体的危害有三种：

刺激作用：甲醛对皮肤和黏膜有很强的刺激作用，可使人眼部干涩、流泪、视力模糊、鼻黏膜水肿、咽喉不适、皮肤瘙痒。

毒性作用：可引起头晕、失眠、疲倦、注意力不集中、记忆力下降等神经系统损害，腹痛、恶心、呕吐、全身无力等消化系统损害，咳嗽、胸闷、气喘等呼吸系统损害。还可导致免疫力下降、月经紊乱、不孕症、新生儿畸形等，儿童和孕妇对其尤为敏感。

致癌作用：动物实验证明甲醛既是致癌剂又是促癌剂，有可能导致鼻咽癌、肺癌、皮肤癌、白血病、结肠癌等。10克甲醛可使人致死。

甲醛一直是污染病理科及周边环境的有害物质，病理科工作人员因此患化学性鼻炎的几率几乎是100%，在英国一份对病理工作人员的疾病调查报告中指出，病理工作人员患恶性淋巴瘤的概率远高于其它医疗部门人员。

环保组织固定液的优势

本发明提供的组织固定液是以乙醇、多元醇、天然添加剂为主体的新一代复合组织固定液，不含甲醛、甲醇，是无毒无害的水性溶液，符合环保要求，克服了福尔马林（甲醛溶液）对环境的污染和对人体健康的危害，是福尔马林的更新换代产品，因为绿色环保，受到社会和人类的高度认可，尤其医院，全国三甲医院2013年统计接近800家，三甲以下的医院有30多万家。

每个医院都需要使用福尔马林，但会危害到医护工作者的健康也污染环境，故无毒无害的环保组织固定液将会取代它，进入到每个医院。除此之外，功效方面也优于福尔马林： A.免疫组化抗原免修复。蛋白之间不发生交联，避免了甲醛导致的抗原决定簇隐蔽现象，抗原无需修复，简化了免疫组织化学切片制作程序，消除了修复可能产生的假阳性。 B.组织细胞结构清晰、背景对比度高。组织常规染色、组织化学和免疫组化染色形态更清晰，明显优于福尔马林；背景对比度提高，易对淋巴结病变做出判断。 C.缩短脱水、脱脂时间。固定同时发生脱水、脱脂作用，缩短了脱水、脱脂时间。 D.标本颜色与新鲜标本的颜色接近，弹性优于福尔马林固定标本。 E.绿色环保。自然条件下容易生物降解，生物体内无蓄积作用，在土壤中极易降解，使用后不会对环境产生危害。由此可见环保组织固定液在市场上很有优势。

本发明意在利用酸性缓冲环境的杀菌、防霉作用和环保低毒交联剂的固定作用协同配合，达到保存动物标本的目的，取代福尔马林保存液。

多羟甲基杂原子化合物是一种含有多官能团的活性高分子化合物，含有至少2个羟甲基，杂原子的高电负性增加了与其相邻的羟甲基的活性，能够对动物组织蛋白进行适度的交联，进而起到一定的固定作用，保持动物标本的原始形态。该化合物的平均分子量为 200〜800，具有很好的亲水性和组织渗透性。在进行动物标本保存的过程，能够均匀、快速 的渗透在组织内部发生作用。此化合物不挥发，因而在动物标本保存过程中，有效物浓度不 降低，克服了因甲醛挥发导致保存效果差、空气中甲醛浓度超标危害环境等缺点。此化合物 毒性较低，无生物积累，因此不会对环境造成污染，是一种安全、环保的化学品。

众所周知，食醋一般都具有2〜5年的保质期。这可以充分说明，在酸性条件下，微生物不宜滋生。本发明利用氢氧化钠、柠檬酸和盐酸配制成ΡΗ4. 3〜6. 5缓冲体系，即弱酸性环境，可以很好的抑制细菌、霉菌的生长，保证动物组织标本在保存的过程不受腐蚀。上述三种物质均为常规化学品，不会对人体和环境造成污染。

本发明保存液特点有无色透明液体；无刺激性气味；杀菌防霉性能优异；具有抗血栓物质形成和溶血栓作用；组成成分不含挥发性物质，效果持久；组成成分不含甲醛和 芳香族化合物等有害物质，绿色环保。经本发明产品保存的动物组织标本，形态保持良好、 柔软有弹性、不霉变、不腐蚀。经本保存液保存5年的标本质量依然良好。

实施例一：将质量为15Kg多羟甲基杂原子化合物[P⁺(CH₂OH)₄]NO₃^—溶解于85Kg pH5. 3缓冲溶液，其中缓冲溶液是将1224g氢氧化钠、2083g柠檬酸和578mL浓盐酸用去离子水溶解稀 释至85Kg制得。最终得到pH5. 3的环保型动物标本保存液100Kg，适用于保存固定较好但霉变的动物组织标本。

实施例二：将质量为20Kg多羟甲基杂原子化合物[Si⁺(CH₂OH) ₃]₂S0₄^2—溶解于80Kg pH5.8缓冲溶液，其中缓冲溶液是将1488g氢氧化钠、2280g柠檬酸和840mL浓盐酸用去离子水溶解 稀释至50Kg制得。最终得到pH5.8的环保型动物标本保存液100Kg，适用于保存固定较差 但未发生霉变的动物组织标本。

实施例三：将质量为10Kg多羟甲基杂原子化合物[N⁺ (CH₂OH) ₄] ₂S0₄^2—溶解于90Kg pH6. 5缓冲溶液，其中缓冲溶液是将1404g氢氧化钠、2394g柠檬酸和1134mL浓盐酸用去离子水溶解稀释至90Kg制得。最终得到pH6. 5的环保型动物标本保存液100Kg，适用于保存固定较好且为发生霉变的动物组织标本。

实施例四：将质量为30Kg多羟甲基杂原子化合物[P⁺(CH₂OH)₃] Cl^—溶解于70Kg pH4.3缓冲溶液，其中缓冲溶液是将581g氢氧化钠、1477g柠檬酸和315mL浓盐酸用去离子水溶解稀释至70Kg制得。最终得到pH4. 3的环保型动物标本保存液100Kg，适用于保存固定较差且发生霉变的动物组织标本。

福莱安研究这项目的贡献在于：能使我国在新型固定液研究和生产上达到国际先进水平，彻底消除福尔马林对病理工作者健康的伤害和环境污染。医学病理诊断需要高质量病理切片，正确的标本固定是制成高质量切片的第一步，如果组织自溶、结构破坏、细胞变形，就无法诊断，所以组织标本离体后必须用固定液固定，使离体后的组织标本不发生上述变化。福尔马林是最常用的医院病理科、外科、医学院病理解剖教研室组织标本固定液，福尔马林中的甲醛能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质凝固，其用于病理组织标本的固定及动物、人体的防腐已有一百多年的历史。但福尔马林外观无色透明，易挥发，具有高刺激性和腐蚀性，它的毒性为甲醇的30倍。

国内外医学研究确认，长期直接接触福尔马林的人群如医院病理科、外科人员，存在一定程度的职业危害。针对福尔马林的高毒性、致癌性，国内外许多学者进行了多年研究，希望能通过对福尔马林进行适度干预，降低其在病理工作过程中对人体的伤害，但效果并不理想。国内一些医院、医学院在福尔马林使用场所采用排风设备进行不间断通风，但并不能完全清除，而操作人员直接面对福尔马林，甲醛吸入量下降并不明显；由于医院病理科、外科等大量使用福尔马林，通过器具、职业服装、下水管道、空调系统等可扩散至病区、办公室等场所，近年医院病理科逐步使用自动脱水机处理组织标本，需在空调实验室进行，无法通风排除甲醛，福尔马林对医护人员健康的隐患仍然存在，同时，废弃的福尔马林对环境也有影响。

环保型组织标本固定液这是可取代福尔马林的新一代组织标本固定液，将会给病理学很好的帮助。我们的目标尽快完成国内病理职业危害的绿色替代品研究，突破环保型标本固定浓缩液的关键技术并使之产业化，这是国内病理解剖学界的迫切要求。

我们会走自主研发和生产之路，根据自然沉淀固定机理，从无毒环保的醇类，如一元、二元、三元及多元醇等中按不同活性基团初选出符合要求的种类，筛选固定增效高分子聚合物、组织细胞渗透促进剂等材料，满足临床病理诊断的要求，彻底消除福尔马林对病理工作者的职业危害，同时在自然界能自然降解，不产生污染。成功研制的这种新型无毒环保型病理用组织标本固定液为浓缩液，经稀释后使用，产品无色、无味、无毒，绿色环保；对标本抗原无影响，免疫组织化学病理制片不需修复，简化了制片工艺、节约了时间；组织细胞结构清晰、背景对比度高，可全面替代福尔马林,是一种优异的无毒环保型病理用组织标本固定液。研究成果将能使我国在新型固定液研究和生产上达到国际先进水平，该产品无毒、无色、无味，安全性比福尔马林高1190倍，彻底消除福尔马林对病理工作者健康的伤害和环境污染，具有极好的社会、经济效益。

使用方便，环保固定液，无福尔马林成分。

福尔马林成分的环保组织固定液是不含福尔马林的水溶性溶液，且克服了以往纯酒精固定液或乙醇类固定液所存在的明显的组织皱缩、细胞空泡以及核固缩等缺陆。环保组织固定液能够相对有效地保存组织抗原、维护良好的细胞核和胞浆形态学结构。同时能保护细胞膜的完整性，从而减少溶血改变。 而且，能够获得理想的DNA/RNA以及蛋白质修复，这对一些下游的分子生物学分环保固定液在取材室中的优势 ：

•组织浸泡在组织环保固定液中可取得同步固定、脱水、脱脂的效果；

•经组织环保固定液固定的大体样本，取材时触之感觉良好，易于分离井切取较薄的具有代表性的组织块；

•经组织环保固定液固定后，淋巴结显灰白色，易于淋巴结的检出；

•可去除脂肪组织标本的粘滑感及粘稠性，使清洁工作快速及简单。对脂肪组织可达到快速去脂( EliminationOf Sling)的效果；

•与福尔马林灰蒙蒙的染色效果相比，组织着色更显真实鲜艳【如附图9、10、11、12】；

•组织处理时间短，因在固定过程中较旱开始脱水及去脂:

•非常适用于微波快速组织处理及常规组织过程的固定步骤;

•非常适用于后固定，可去除含脂较多组织中的脂肪，如乳腺标本:

•可作为全自动组织脱水机的福尔马林替代品。

甲醛的环境污染已成为一大国际性问题。甲醛废物的处置，回收或在实验室销毁相当昂贵。长期接触甲醛的人群如医院病理科、外科工作人员等经常吸入少量甲醛能引起慢性中毒，记忆力衰退，体内白细胞数明显下降。甲醛慢性中毒也可导致女性月经紊乱、妊娠综合症或致基因突变，引起新生儿染色体异常、白血病，甚至导致鼻咽癌、结肠癌、脑瘤等。欧美国家病理实验室已放弃使用甲醛作为固定剂，研发和生产理想的甲醛替代固定液在我国已刻不容缓。

环保组织固定液，以植物多糖为主要原料配制，用作常规组织病理学诊断能提供满意的效果，形态结构清晰、背景对比度高；免疫组化和分子病理技术方面明显优于甲醛固定液，多数抗体无需抗原修复处理，简化了免疫组化步骤，减少因固定产生的假阳性现象，并且绿色环保。

环保组织固定液可全面替代甲醛成为病理组织细胞实验室的常规组织细胞固定液，最大限度地减少了对病理科和外科等相关人员的健康危害和环境污染，主要用于病理组织学常规制片染色、传统组织细胞化学染色、免疫组织细胞化学和原位分子杂交等其它分子病理学新技术。

环保组织固定液系列的优点是为无色、无异味、无刺激性和无毒性挥发成分，最大限度地减少对病理及相关工作人员的健康危害和环境污染。适用于医院病理科、血液科或检验科对脱落细胞涂片和组织切片制作前组织标本的固定处理，保存组织细胞结构，便于显微镜下进行组织和细胞学形态结构观察。不仅用于常规制片染色、传统特殊染色，更有利于开展免疫组织细胞化学和原位分子杂交等其它分子病理学新技术，提高了细胞中核酸类物质保存完好水平，给 PCR和RT-PCR实验带来更多的方便。

本发明还提供一种环保组织固定液的生产方法，该方法如图13所示，包括：

101、用精度为0.01ml的50ml移液管吸取35ml的冰醋酸于1L的烧杯中；

102、往烧杯中加入100ml水摇匀后，往烧杯瓶中加入600ml的多元醇，摇匀得到混合溶液；

103、把上述混合溶液移至1L的定量瓶中，加水定量至1L，摇匀，静置10分钟；

104、取10ml上述溶液，用pH计进行测量，用乙酸稀释液微调pH值至5.0～6.5得到环保组织固定液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。