本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种拟海桑提取物的生物活性srb测定方法。
背景技术：
拟海桑(sonneratiaparacaseolaris)属于海桑科海桑属，为我国稀有濒危红树植物，仅天然分布于海南岛，分布范围狭窄，个体数量稀少。正处于濒危状态，被列入《中国生物多样性国情研究报告》中国被子植物濒危及稀有种名录。在前期的生物活性筛选实验中，拟海桑的甲醇提取物对小鼠白血病肿瘤细胞株p-388和人肝癌细胞株bel-7402显示较强的细胞毒活性。因此，本项目选择拟海桑进行细致的化学成分研究，期望发现海洋来源活性先导化合物。
拟海桑化学成分的研究只有一篇报道，2012年郭跃伟课题组对采自广东湛江的拟海桑进行化学成分研究，从中分离得到一个新骨架化合物paracaseolidea(69)是一个二聚-烷基丁内酯类化合物内酯甲素，体外药理活性筛选显示该化合物对细胞周期分裂蛋白25b具有显著的抑制活性。
技术实现要素：
本发明旨在为拟海桑的提取物提供一种方便可靠的生物活性测定方法。
一种拟海桑提取物的生物活性srb测定方法，步骤如下：
(1)取对数期的肿瘤细胞，用新鲜的rpmi-1640培养基调整细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每孔200μl加入96孔板中，每孔加入不同浓度的样品溶液2μl；
(2)37ºc培养17h；
(3)离心3min(4ºc、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μl预冷的80%tca溶液，移入4ºc冰箱中固定1.5h，再用去离子水冲洗5次，室温晾干；
(5)每孔加入0.5%srb染液(1%的tca溶液)50μl，室温静置30min后，用预冷的1%tca水溶液冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；
(6)每孔加入150μl非缓冲tris溶液溶解(10mm，ph=10.5)与蛋白结合的染料，用酶标仪在520nm下测定每孔吸光度od值。在96孔板中每个样品浓度设3孔，另设空白对照3孔，取3孔平均值，按公式ir(%)=(od空白-od样品)/od空白×100%计算细胞增殖抑制率(ir%)，再利用bliss方法由各种浓度的ir求出半数抑制浓度(ic50)的标准差和平均值。
本发明的测定原理：磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。srb是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在520nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
本发明的测定方法相对于现有技术简单快速、而且检测结果可靠，适于推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
选择hela和a549肿瘤细胞株用srb法对从拟海桑分离得到的三萜类化合物(sp-1~sp-17)进行了体外抗肿瘤活性筛选，包括如下步骤：
(1)取对数期的肿瘤细胞，用新鲜的rpmi-1640培养基调整细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每孔200μl加入96孔板中，每孔加入不同浓度的样品溶液2μl；
(2)37ºc培养17h；
(3)离心3min(4ºc、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μl预冷的80%tca溶液，移入4ºc冰箱中固定1.5h，再用去离子水冲洗5次，室温晾干；
(5)每孔加入0.5%srb染液(1%的tca溶液)50μl，室温静置30min后，用预冷的1%tca水溶液冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；
(6)每孔加入150μl非缓冲tris溶液溶解(10mm，ph=10.5)与蛋白结合的染料，用酶标仪在520nm下测定每孔吸光度od值。在96孔板中每个样品浓度设3孔，另设空白对照3孔，取3孔平均值，按公式ir(%)=(od空白-od样品)/od空白×100%计算细胞增殖抑制率(ir%)，再利用bliss方法由各种浓度的ir求出半数抑制浓度(ic50)的标准差和平均值。
测定结果表1-2，分析表中数据可以看出在浓度为50μm浓度水平，除了化合物sp-16所有进行活性的测定的化合物均对肿瘤细胞株hela有抑制作用，化合物sp-2~4，sp-6，sp-8~9，sp-12，sp-14~15对hela表现中等强度的抑制活性，抑制率在50%以上。在浓度为50μm浓度水平，化合物sp-7~11对a549细胞表现出中等强度的细胞毒活性，抑制率50%~70%之间，其余化合物对a549细胞株的抑制活性较弱。
表1拟海桑中三萜化合物sp-1~sp-17对hela肿瘤细胞株的抑制率(%)
表2拟海桑中三萜化合物sp-1~sp-17对a549肿瘤细胞株的抑制率(%)