早期胎盘胰岛素样肽（pro‑EPIL）的制作方法

全世界每年至少有1.3亿妇女生育。她们中的约15％经历妊娠相关的并发症或疾病。

妊娠糖尿病(gestational diabete mellitus，GDM)在美国影响3-7％的妊娠(Berg，C.J.等，Obstet Gynecol，2009.113(5)：第1075-81页)，在欧洲影响2-6％(Buckley BS.等，Diabet Med，2012年7月；29(7)：844-54)，并且与不利的围产期结局相关，包括巨大胎儿、肩难产、剖宫产和新生儿低血糖(ACOG Practice Bulletin.第30期，2001年9月(代替Technical Bulletin第200期，1994年12月).Gestational diabetes.Obstet Gynecol，2001.98(3)：第525-38页)。重要的是，已经示出GDM的治疗改善妊娠结局(Crowther C等，NEJM，2005，352：2477-2486)。目前没有用于预测GDM的测试。早期诊断(即在临床症状开始之前)使得医生能够密切监测具有风险的患者并且提供具有以下特征的治疗：分开的饮食、体育锻炼和/或施用已经表明在该群体中具有益处的物质如胰岛素和二甲双胍(HAPO Study Cooperative Group.N Engl J Med 2008，358：1991-02；Rowan等，NEngl JMed，2008，358：2003-2015)。

在美国和许多欧洲国家，通常在妊娠24-28周通过通用筛选方法检测GDM。目前，没有普遍认可的用于检测GDM的黄金标准测试。美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA)、加拿大妇产科医师协会(Canadian Society of Obstetricians and Gynecologists，SOGC)和美国妇产科学院(American College of Obstetrics and Gynecology，ACOG)推荐所有孕妇在妊娠约28周时使用以下方法筛选GDM：无论禁食状态使用随机50g葡萄糖激发测试(glucose challenge test，GCT)，1小时后测试血糖，如果其筛选为阳性，接着是诊断性禁食100g 3小时经口葡萄糖耐量测试(oral glucose tolerance test，OGTT)。这些测试不是100％可靠，超过20％具有阳性GCT的妇女将是OGTT测试阳性的(假阳性高)。

在许多国家，用于确定产前并发症和/或胎儿畸形的筛选方法已经常规用于帮助治疗和建议孕妇。例如，在欧洲，健康护理提供者通常使用存在于母体血中的生物化学标志物筛选胎儿中的染色体异常。已经证明母体年龄、血清学标志物妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A)和游离β人绒毛膜促性腺激素(free-beta human chorionic gonadotropin，游离β-hCG)以及超声标志物颈半透明度(nuchal translucency，NT)厚度的组合在第11⁺⁰-13⁺⁶周有效，对于唐氏综合征的检出率为约82％至90％，假阳性率为5％(Malone等，2005.NEJM353(19)：2001-2010；Bindra等，2002.Ultrasound Obstet Gynecol 20：219-225)。这样的筛选有助于鉴定具有足够高风险而证明有必要进行进一步的诊断测试的妇女，所述测试可能是侵入性的并且对胎儿具有风险。但是，这种筛选依然不能检测大量唐氏综合征病例和其他非整倍性(aneuploidy)影响的妊娠，并且诊断依然有5％假阳性。

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)定义为无法达到认可的生长潜力。目前基于通过超声估计的胎儿重量(estimated fetal weight，EFW)低于给定阈值(最常见是第十百分位)来进行胎儿“小”的诊断(Figueras等，2014.Fetal Diagn Ther)。目前没有适于使用母体样品早期检测FGR的常规筛选。可预测发展或帮助检测威胁生命的妊娠疾病的非侵入生物标志物的研究依然非常重要。如果可以更早检出胎儿生长受限的风险，则在许多情况下可能具有更好的结局，包括严重性降低以及甚至恢复。在妊娠期间的早期阶段或稍晚阶段，分娩“小于孕龄”儿的可靠风险评估方法或评估宫内生长受限的存在将降低婴儿健康负效应的可能性。

许多研究通过组合不同变量(例如母体病史(maternal history)以及生物化学和生物物理学标志物)评估FGP首三月(first-trimester)筛选的性能。但是，达到的检出率并未足够高(Figueras等，2011.Am J Obstet Gynecol 204(4)：288-300)。

因此，依然需要用于产前并发症和/或胎儿畸形的精确筛选方法。

人胎盘是在胎儿母体适应性应答中有活性的许多蛋白质和肽的来源(Petraglia等，1996.Endocr Rev 17：156-86)。广泛接受的是这些胎盘因子对妊娠期生理和病理性疾病具有影响。胰岛素和胰岛素样生长因子属于对适当调节生理过程如能量代谢、细胞增殖、发育和分化必要的多肽家族。

EPIL肽由胰岛素样4基因(INSL4)编码。通过筛选首三月人胎盘的cDNA文库鉴定该基因。INSL4在早期胎盘中高度表达，除了在正常子宫组织中的微弱表达，INSL4转录本的表达迄今在测试的任何其他正常组织中均未检测到(Chassin等，1995.Genomics 29：465-70)。由胰岛素样4基因编码的早期胎盘胰岛素样肽(early placenta insulin-like peptide，EPIL)是胰岛素相关基因家族的成员，所述家族包括胰岛素、松弛素(RLX)、胰岛素样生长因子1和2(IGFI I和IGF II)、由INSL3编码的莱迪希胰岛素样肽(LEY I-L)以及由INSL5和INSL6基因编码的肽。

EPIL是作为前激素原合成的139个氨基酸的多肽，其特征在于信号肽(下划线)、B链(斜体)、连接C肽(粗体)和末端A链(SEQ-ID No.1)。在胎盘中，发现滋养层细胞将INSL4mRNA翻译成包含B、C和A链的免疫反应性pro-EPIL肽(Bellet等，1997.J Clin Endocrinol Metab82：3169-72)。最初，在正常妊娠期间的羊水和母体血清中检出pro-EPIL肽，并且pro-EPIL的排泄方式与游离β-hCG类似，表明具有共同调节途径(Mock等，1999.J Clin Endocrinol Metab 84：2253-6)。一个研究报道，非整倍体妊娠的特征在于pro-EPIL的羊水浓度变化但是在母体血清中不变化(Mock等，2000.J Clin Endocrinol Metab 85：3941-4)。Bruni等描述了相对于对照样品FGR妊娠样品中pro-EPIL水平的提高(Bruni等，2007.Am J Obstet Gynecol 2007；197：606.el-606.e4)。

本发明人出乎意料地发现，母体血清中pro-EPIL的水平是用于产前并发症和/或胎儿畸形的精确筛选方法的有用工具。

技术实现要素：

本发明涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平；

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述产前疾病或病症的对象的对照水平相比较；

其中显著偏离所述对照水平指示所述对象中的所述产前疾病或病症。

本发明在一个方面还涉及用于确定胎儿中的染色体异常，优选非整倍性，更优选21三体、18三体、13三体，最优选21三体的风险的方法，其包括：

a)测定由妊娠雌性对象取得的一个或更多个血液样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)、胎盘生长因子(PlGF)(和任选的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A))和游离人绒毛膜促性腺激素(游离β-hCG)的水平；

b)任选地测定所述胎儿的超声标志物，并且

c)使用pro-EPIL、PlGF、(任选PAPP-A)和游离β-hCG的测量水平确定所述胎儿中染色体异常的风险。

优选地，还测定所述胎儿的一种或更多种超声标志物，并且使用所述胎儿的pro-EPIL、PlGF、(任选PAPP-A)、游离β-hCG和一种或更多种超声标志物的水平确定所述胎儿中染色体异常的风险。

此外，本发明在另一个方面涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平；

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述产前疾病或病症的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比来自所述对象的所述样品中水平降低指示所述产前疾病或病症。

妊娠雌性对象中的产前疾病或病症可例如选自妊娠糖尿病、早产、胎儿生长受限、分娩大于孕龄儿的风险和先兆子痫，优选妊娠糖尿病。

附图说明

图1示出了实施例2和3使用时间分辨放大穴状化合物发射(Time Resolved Amplified Cryptate Emission，TRACE)技术的pro-EPIL均相夹心荧光免疫测定(homogenous sandwich fluoroimmunoassay)的剂量响应曲线。

图2示出了具有正常妊娠的妇女中pro-EPIL浓度的箱线图(box and whisker plot)。

图3示出了具有正常和21三体妊娠的妇女中pro-EPIL中位数倍数(multiple of median，MoM)的箱线图。

图4示出了具有正常和妊娠糖尿病妊娠的妇女中pro-EPIL中位数倍数(MoM)的箱线图。

图5示出了具有正常妊娠和胎儿生长受限(FGR)组的妇女中pro-EPIL中位数倍数(MoM)的箱线图。

图6示出了中三月具有正常和21三体妊娠的妇女中pro-EPIL中位数倍数(MoM)的箱线图。

以下实施例和附图用于更详细解释本发明，而不是将本发明限制于所述实施例和附图。

发明详述

本发明涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法。所述方法包括测定所述妊娠雌性对象体液样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平。偏离pro-EPIL的对照水平指示所述妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中的产前疾病或病症(即，包括所述妊娠雌性中的产前综合征和/或所述胎儿中的胎儿异常)。根据特定的产前疾病或病症，与对照水平相比所述样品中更高或更低的pro-EPIL水平均可指示产前疾病或病症。对照水平来自健康妊娠个体的样品，或更优选地健康妊娠个体(即不具有所述产前疾病或病症的对象)组的样品中的pro-EPIL水平。因此，将待诊断对象的样品中的pro-EPIL水平与健康妊娠雌性群体(优选与待诊断对象处于相同妊娠三月期的妊娠雌性)相比较。

因此，本发明涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述产前疾病或病症的对象的对照水平相比较；

其中显著偏离所述对照水平指示所述对象中的所述产前疾病或病症。

上下文中的显著偏离是偏离对照水平至少5％，优选至少10％，更优选至少20％。

本发明在一个方面还涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述产前疾病或病症的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比来自所述对象的所述样品中水平降低指示所述产前疾病或病症。

类似地，本发明还涉及用于妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述产前疾病或病症的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比来自所述对象的所述样品中水平提高指示所述产前疾病或病症。

在本文中优选地，对照水平是不具有所述产前疾病或病症的对象中水平的中位数，并且偏离所述中位数＞20％指示所述产前疾病或病症。

因此，本发明还涉及用于诊断妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的方法，其中测定来自待诊断对象的样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)的水平，并且其中pro-EPIL水平低于对照组的0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2“中位数倍数(MoM)”指示所述产前疾病或病症。本发明还涉及用于诊断妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中产前疾病或病症的方法，其中测定来自待诊断对象的样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)的水平，并且其中pro-EPIL水平高于对照组的1.2、1.7、2.0、2.5“中位数倍数(MoM)”指示所述产前疾病或病症。中位数倍数(MoM)是个体测试结果偏离对照组中位数有多远的量度。MoM常用于报告医学筛选测试的结果，特别是在个体测试的结果高度可变时。在整个妊娠中，产前筛选分析物的浓度不断变化。例如，在用于检测开放神经管缺陷的最有利时间(妊娠第15-20周)期间，母体血清中的AFP浓度每周提高约15％。将这些值转化成孕龄特异性中位数(MoM)对这种孕龄效应进行了归一化。因此，实验室可以首先获得由例如300至500位妇女常规获得的血清的测量。测量值最初表达为质量单位(例如，ng/ml)或国际单位(例如，IU/ml)。加权对数线性回归分析用于计算方程以确定每个妊娠周所讨论的分析物的中位数水平。然后将每位妇女的测量值除以适当孕龄的中位数得到中位数倍数(MoM)。妇女群体中的整体中位数值按照定义为1.00MoM。“中位数倍数”表示应用于中位数值的因子，例如，0.90意味着中位数值的90％。在下文中将讨论示例性阈值。然而，根据对照组或预期特异性和/或灵敏度，也可使用其他阈值。例如，用于首三月和中三月时妊娠糖尿病的合适阈值分别是5.3ng/ml(对应于0.31MoM)和7.4ng/ml(对应于0.22MoM)。高于34.4ng/ml(对应于1.71MoM)的值可指示21三体。在中三月和末三月时，具有胎儿生长受限的妊娠的合适阈值分别是19.4ng/ml(对应于0.66MoM)和47.5ng/ml(对应于0.63MoM)。

产前疾病或病症可以是妊娠雌性对象或者所述对象的未出生胎儿的疾病或病症。例如，产前疾病或病症可以是妊娠雌性对象中的妊娠糖尿病以及相关疾病。所述相关疾病可以表现在妊娠雌性对象或胎儿中。所述妊娠雌性相关疾病可以是选自以下的一种或更多种：妊娠诱导的高血压、先兆子痫、早产、心血管疾病、代谢综合征和2型糖尿病。所述胎儿相关疾病可以是选自以下的一种或更多种：死产、巨体、低血糖、高胆红素血症、呼吸窘迫综合征、肩难产、产期窒息、臂丛神经损伤和早产。产前疾病或病症也可涉及不良妊娠结局或胎儿发育，例如胎儿生长受限或“大于孕龄(large for gestational age)”。产前疾病或病症也可涉及不良妊娠结局如先兆子痫或雌性对象早产的风险。产前疾病或病症也可涉及特征在于染色体异常的遗传疾病，例如非整倍性，包括13三体、18三体和21三体。

妊娠糖尿病是指妊娠期间的高血糖病症。高葡萄糖水平可在妊娠后期影响婴儿并造成巨体的婴儿。

早产是指婴儿的出生小于37周孕龄。

胎儿生长受限是指具有子宫内生长限制，不能达到其确定的潜在尺寸的胎儿。胎儿重量小于第10百分位。

大于孕龄是指胎儿重量大于孕龄的第90百分位的胎儿。

术语“先兆子痫”包括孕妇的高血压、多系统疾病，其特征在于高血压和蛋白尿。先兆子痫的最常见症状是高血压，尿中蛋白质增加，手和脸肿胀或浮肿。在本发明的某些实施方案中，先兆子痫定义为高血压(收缩血压和舒张血压分别≥140mm Hg和90mm Hg)以及蛋白尿(24小时尿液收集中的蛋白质排泄≥300mg或者浸渍片(dipstick)≥2+)。

本发明上下文中的“诊断”涉及对象中疾病或临床病症的识别和(早期)检测，并且还可包括差别诊断。在某些实施方案中，疾病或临床病症的严重性的评估也被术语“诊断”涵盖。

“预后”涉及预测患有特定疾病或临床病症之对象的结局或特定风险。这可包括估计所述对象恢复的几率或不良结局的几率。

在本发明中，术语“风险评估”和“风险分级”涉及根据对象的进一步预后将对象分成不同风险组。风险分级还涉及应用预防和/或治疗措施的分级。

本发明上下文中的术语治疗控制是指监测和/或调整所述患者的治疗性治疗。

本发明上下文中的术语“筛选”是指使用特定标志物和确定的筛选截断水平调查群体以鉴定群体中对特定疾病具有更高风险的个体的过程。筛选可应用于群体；诊断在个体患者水平应用。

在与降低的pro-EPIL水平有关的产前疾病或病症的上下文中，与对照水平相比，所述对象样品中pro-EPIL水平低于0.8中位数倍数(MoM)指示产前疾病或病症和/或对象或胎儿患产前疾病或病症的风险提高和/或产前疾病或病症加重的风险提高。类似地，在与提高的pro-EPIL水平有关的产前疾病或病症的上下文中，与对照水平相比，所述对象样品中pro-EPIL水平高于1.2中位数倍数(MoM)指示产前疾病或病症和/或对象或胎儿患产前疾病或病症的风险提高和/或产前疾病或病症加重的风险提高。

妊娠雌性中与降低的pro-EPIL水平有关的产前疾病或病症是例如妊娠糖尿病、早产、胎儿生长受限、分娩大于孕龄儿的风险和先兆子痫。在本发明一个特别优选的实施方案中，妊娠雌性对象中的产前疾病或病症是妊娠糖尿病(GDM)。在另一个特别优选的实施方案中，产前疾病或病症是胎儿生长受限(FGR)。

妊娠雌性的未出生胎儿中的产前疾病或病症包括例如染色体异常，例如非整倍性，如13三体、18三体、21三体、特纳综合征(Turner syndrome)和三倍性。在本发明的一个特别优选的实施方案中，产前疾病或病症是13三体、18三体或21三体，优选21三体。

在本发明诊断、预后和风险评估方法的上下文中，除了pro-EPIL水平之外，可以确定另外的决定参数。例如，与年龄、体重和/或体重指数(BMI)有关的信息可额外用于评估。另外的参数包括对象中其他疾病或病症的存在或之前存在。此外，可以测定样品中的其他相关生物标志物。因此，pro-EPIL可以是用于本发明诊断、预后和风险评估方法的标志物组的一部分。例如，当疾病或病症是妊娠糖尿病时，另外的参数可以是血糖以及应用葡萄糖激发测试或经口葡萄糖耐量测试。例如，当疾病或病症是非整倍性时，另外的参数可以选自妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)、游离β-hCG、颈半透明度(NT)、母体年龄、甲胎蛋白(AFP)、胎盘生长因子(PlGF)、胎儿鼻骨、双顶径/鼻骨比(biparietal diameter/nasal boneratio)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素A(inhibin A)、非缀合雌三醇3和无细胞胎儿DNA。例如，当疾病或病症是胎儿生长限制时，另外的参数可以是选自以下的一种或更多种：PAPP-A、母体病史、PlGF、可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFlt1)、AFP、游离β-hCG、抑制素A、激活素A(activin A)、短内皮糖蛋白(short-Endoglin，sEng)、耻骨联合-宫底高度(symphysis-fundal height)、胎儿生物计量、头围、双顶径、腹围、超声标志物(例如，搏动指数、脐动脉多普勒、大脑中动脉多普勒、静脉导管多普勒)。

在本文中，PlGF包括游离PlGF和与多聚复合物结合的PlGF。因此，除非另有说明，否则PlGF包括所有PlGF同工型。

术语“生物标志物”(生物学标志物)涉及可测量和可量化的生物学参数(例如，特定酶浓度、特定激素浓度、群体中的特定基因表型分布、生物物质的存在)，其充当用于以下健康和生理相关评估的指征，例如疾病风险、精神障碍、环境暴露及其影响、疾病诊断、代谢过程、物质滥用、妊娠、细胞系发育、流行病学研究等。此外，生物标志物定义为作为正常生物过程、致病过程或针对治疗介入之药理学响应的指征客观测量并且评价的特征。可以在生物样品上测量生物标志物(例如，血液、尿或组织测试)，其可以是从个人获得的记录(血压、ECG或Holter)，或者其可以是成像测试(子宫胎盘多普勒超声或颈半透明度(Conde-Agudelo等，2004.Obstet Gynecol 104：1367-1391；Bindra等，2002.Ultrasound Obstet Gynecol20：219-225))。生物标志物可以指示多种健康或疾病特征，包括暴露于环境因素的水平或类型、遗传易感性、针对暴露的遗传响应、亚临床或临床疾病的生物标志物，或者治疗响应的指征。因此，考虑生物标志物的一种简单化方式是作为疾病特性(风险因素或风险生物标志物)、疾病状态(临床前或临床)或疾病速率(进程)的指征。因此，可将生物标志物分为前驱生物标志物(antecedent biomarker)(鉴定发生疾病的风险)、筛选性生物标志物(筛选亚临床疾病)、诊断性生物标志物(识别明显疾病)、分期性生物标志物(对疾病严重程度进行分类)或预后生物标志物(预测未来疾病过程(包括复发和对治疗的响应)，以及监测治疗的效力)。生物标志物还可充当替代终点(surrogate end point)。替代终点是这样的终点，其可替代真实目标结果的测量结果用作临床试验中的结果来评价治疗的安全性和有效性。基本原理是替代终点的改变密切追踪着目标结果的变化。替代终点的优势在于：与需要大型临床试验进行评价的终点例如发病率和死亡率相比，它们可在更短的时间段内并且以更低的成本收集。替代终点的另外价值包括以下事实：与较远的临床事件相比，其更接近目标暴露/介入并且可更易于因果相关。替代终点的重大劣势是如果目标临床结果受多种因素(除替代终点之外)的影响，则残余混杂可降低替代终点的有效性。已提出，如果替代终点可以解释暴露或介入对目标结果的至少50％作用，则其具有较大的有效性。例如，生物标志物可以是蛋白质、肽或核酸分子。

在本发明方法的上下文中，可以区分不同类型的额外参数：a)“低分子量”生物标志物，例如葡萄糖，b)“生物化学”生物标志物，即样品中的生物分子，例如多肽、蛋白质和核酸(特别是DNA)，c)“生物物理学”参数，例如由成像方法(如超声方法)获得的信息，d)其他信息如母体年龄或母体健康史。

优选根据本发明上下文中的额外“生物化学”生物标志物是PAPP-A、PlGF、sFlt1、AFP、游离β-hCG、抑制素A、激活素A、sEng、hCG和无细胞胎儿DNA。

优选包括在本发明上下文中的额外“生物物理学”参数是胎儿耻骨联合-宫底高度、胎儿生物计量、胎儿头围、胎儿双顶径、胎儿腹围、超声标志物(例如，选自搏动指数、脐动脉多普勒、大脑中动脉多普勒、静脉导管多普勒)、颈半透明度(NT)、胎儿鼻骨、胎儿双顶径/鼻骨比。

本文中的术语“样品”是生物样品。如本文使用的，“样品”是指用于目标对象(如患者)的诊断、预后或评价目的的体液样品。用于本发明目的的“患者”或“对象”包括人和其他动物两者，特别是哺乳动物，以及其他生物体。因此，所述方法适于人诊断和兽医应用两者。在一个优选实施方案中，患者是哺乳动物，在一个最优选实施方案中，患者或对象是人。

因此，样品是妊娠雌性对象的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、羊水、尿、唾液、痰和胸腔积液。此外，本领域技术人员将认识到一些测试样品在分级或纯化程序后可能更容易分析，例如将全血分离成血清或血浆组分。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，样品选自包含以下的组：血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿样品或者任何前述样品的提取物。优选地，样品是血液样品，更优选血清样品或血浆样品。在本发明的上下文中，血清样品是最优选的样品。

术语“参照样品”涉及从不具有疾病或病症，以及疾病或病症未发展的对象或对象组获得的样品。所述对象或对象组代表了与测试对象相同的性别和物种。“对照水平”来自一个或更多个“参照样品”，并且优选来自不具有产前疾病或病症的对象。在本文中优选的是，“对照组”与对象来自相同妊娠三月期，或甚至来自相同孕龄(例如，依据妊娠的周数)。例如，当对象处于妊娠22-24周时，对照组也可以来自妊娠22-24周。

本发明上下文中的“血浆”是离心后获得的含抗凝剂的几乎不含细胞的血液上清液。示例性抗凝剂包括钙离子结合化合物如EDTA或柠檬酸盐，以及凝血酶抑制剂如肝素盐或水蛭素。无细胞血浆可以通过抗凝血血液(例如柠檬酸盐化、EDTA或肝素化血液)在2000至3000g下离心至少15分钟获得。

“血清”是在使血液凝固之后收集的全血的液体级分。在离心凝固血液(凝结血液)时，可获得作为上清液的血清。其不含纤维蛋白原，但是有一些凝血因子。

本文使用的术语“对象”是指活的人或非人雌性生物体。优选地，本文的对象是处于妊娠首三月至末三月，更优选首三月之内的人对象。例如，对象处于妊娠11-13周。本文的“胎儿”是指胚胎期之后与出生之前的发育的哺乳动物。在人中，胎儿期开始于妊娠期第九周初始。

妊娠年龄称为“孕龄”。通常，计算“孕龄”(例如，依据妊娠的三月期或周数)的妊娠起点是女性最后一次正常月经期的第一天。妊娠通常分为被称为三月期的三个阶段。根据通常定义，首三月包括第1周至第13周，中三月包括第14周至第26周，末三月包括从第27周到出生的时间。本发明方法原则上可在妊娠的所有三月期中进行。但是，对于某些疾病，所述方法优选在妊娠的特定阶段进行，例如，21三体的诊断优选在首三月中进行，最优选在第10周至第13周进行。另一方面，使用本发明方法诊断胎儿生长受限(FGR)优选在中三月和末三月中进行。

术语“片段”是指可由较大蛋白质或肽得到的较小蛋白质或肽，其因此包含较大蛋白质或肽的一部分序列。所述片段可由较大蛋白质或肽通过其一个或更多个肽键的皂化得到。

本发明上下文中的术语“水平”涉及从患者样品得到的标志物肽的浓度(优选表示为重量/体积；w/v)。

使用检测方法和/或诊断方法进行本文早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段以及其他基于多肽的生物标志物(如PlGF、PAPP-A、游离β-hCG和sFlt1)的水平的确定。

优选的检测方法包括多种形式的免疫测定，例如放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定和荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫测定(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定、快速测试形式(例如，免疫层析条测试)、和选择/多重反应监测(Selected/Multiple reaction monitoring，SRM/MRM)。

所述测定可以是均相测定或异相测定，竞争性测定和非竞争性测定。在一个特别优选的实施方案中，所述测定为夹心测定的形式，其为一种非竞争性免疫测定，其中待检测和/或量化的分子与第一抗体结合并且与第二抗体结合。第一抗体可结合于固相，例如珠、孔或其他容器的表面、芯片或条，第二抗体是例如经染料、放射性同位素或者反应性或催化活性部分标记的抗体。然后，通过合适的方法测量与分析物结合的经标记抗体的量。涉及“夹心测定”的一般性组合物和程序是公认的并且是技术人员已知的(The Immunoassay Handbook，Ed.David Wild，Elsevier LTD，Oxford；第3版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；HultschigC等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1)：4-10.PMID：16376134，其通过引用并入本文)。

在一个特别优选的实施方案中，所述测定包括两种捕获分子，优选两者均作为液相反应混合物中的分散体存在的抗体，其中第一标记组分与第一捕获分子连接，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光猝灭或放大的标记系统的一部分，所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接，以使得在这两种捕获分子与分析物结合之后，产生可测量的信号，这允许在包含样品的溶液中检测所形成的夹心复合物。

甚至更优选地，所述标记系统包含与荧光或化学发光染料特别是花菁型染料组合的稀土穴状化合物(cryptate)或稀土螯合物。

在本发明上下文中，基于荧光的测定包括使用染料，其可例如选自包括以下的组：FAM(5-羧基荧光素或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、花菁染料(例如，CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7)、Xanthen、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料(例如BODIPY TMR)、俄勒冈绿(Oregon Green)、香豆素类(例如，伞形酮)、苯甲亚胺(Benzimide)(例如Hoechst 33258)；菲啶类，例如德克萨斯红(Texas Red)、Yakima Yellow、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

在本发明上下文中，基于化学发光的测定包括基于以下文献中针对化学发光材料所述的物理原理来使用染料：Kirk-Othmer，Encyclopedia of chemical technology，第4版，执行编辑J.I.Kroschwitz；编辑M.Howe-Grant，JohnWiley&Sons，1993，第15卷，第518-562页，其包括筛551至562页的引用内容在内通过引用并入本文。优选的化学发光染料是吖啶酯类。可例如使用全自动化夹心免疫测定系统在B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS仪器(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上检测pro-EPIL。这种随机存取分析仪采用基于两种荧光团之间的非放射转移的灵敏性时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术。

诊断和/或预后测试的灵敏性和特异性不仅仅取决于该测试的分析“质量”，而且其还取决于什么构成了异常结果的限定。实际上，通常通过绘制“正常”(即，不具有产前疾病或病症的明显健康个体)和“患病”群体中变量值相对其相对频率来计算接受者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curves，ROC曲线)。对于任何具体的标志物，患有疾病和未患疾病之对象的标志物水平的分布将可能重叠。在这种条件下，测试并非绝对100％准确地将正常与患病区别开，并且重叠区域表示该测试不能区别正常和患病的区域。选择这样的阈值，低于该阈值时认为测试异常，而高于该阈值时认为测试正常。ROC曲线下面积是感知的测量值将允许正确鉴定病症的概率的量度。甚至在测试结果不一定给出准确数值时也可以使用ROC曲线。只要可以对结果进行排序，就可以生成ROC曲线。例如，可以根据程度对“患病”样品的测试结果进行排序(例如，1＝低，2＝正常和3＝高)。这种排序可与“正常”群体中的结果相关联，并且生成ROC曲线。这些方法是本领域中公知的。参见，例如，Hanley等，1982.Radiology 143：29-36。优选地，选择提供以下ROC曲线面积的阈值：大于约0.5，更优选大于约0.7，仍更优选大于约0.8，甚至更优选大于约0.85，并且最优选大于约0.9。在上下文中，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

ROC曲线的横轴代表(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。该曲线的纵轴代表灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于选择的具体截断值，可以确定(1-特异性)的值，并且可以获得对应的灵敏度。ROC曲线下面积是所测量标志物水平将允许正确地鉴定疾病或病症概率的量度。因此，ROC曲线下面积可用于确定测试的有效性。

在另一些实施方案中，使用阳性似然比(positive likelihood ratio)、阴性似然比(negative likelihood ratio)、比值比(odds ratio)或风险比(hazard ratio)作为测试预测风险或者诊断疾病或病症(“患病组”)的能力的量度。在阳性似然比的情况下，1的值表示阳性结果在“患病”和“对象”两组中的对象之间同等可能；大于1的值表示阳性结果更可能在患病组中；并且小于1的值表示阳性结果更可能在对照组中。在阴性似然比的情况下，1的值表示阴性结果在“患病”和“对象”两组中的对象之间同等可能；大于1的值表示阴性结果更可能在测试组中；并且小于1的值表示阴性结果更可能在对照组中。

在比值比的情况下，1的值表示阳性结果在“患病”和“对象”两组中的对象之间同等可能；大于1的值表示阳性结果更可能在患病组中；并且小于1的值表示阳性结果更可能在对照组中。

在风险比的情况下，1的值表示终点(例如，死亡)的相对风险在“患病”和“对象”两组中相等；大于1的值表示患病组中的风险更大；并且小于1的值表示对照组中的风险更大。

技术人员将理解，将诊断或预后指标与诊断或未来临床结局的预后风险联系起来是一种统计学分析。例如，如通过统计学显著性水平确定的，与水平大于或等于X的患者相比，低于X的标志物水平可预示患者更可能遭受不良结局。另外地，标志物浓度相对于基线水平的变化可以反映患者的预后，并且标志物水平的变化程度可与不良事件的严重程度相关。通常通过比较两个或更多个群体并确定置信区间和/或p值来确定统计学显著性。参见，例如，Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York，1983。本发明的优选置信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。

在一个特定实施方案中，本发明方法用于怀有具非整倍性(如21三体)的胎儿的妊娠对象的风险评估。可以通过测定pro-EPIL水平以及选自PlGF、PAPP-A和游离人绒毛膜促性腺激素(游离β-hCG)的至少一种另外参数的水平来进行该风险评估。可以包括另外的其他参数，例如母体年龄、颈半透明度(NT)和/或其他另外的生物化学、生物物理学和母体病史参数。

在本发明上下文中，优选不同参数的组合，包括pro-EPIL和其他生物标志物，以及生物物理学标志物(如颈半透明度(NT))和另外的信息如母体年龄。这些参数可以组合于预测妊娠对象或未出生胎儿中产前疾病或病症可能性的评分或算法中。对于使用超过一种生物标志物的风险评估，优选确定每种生物标志物的个体似然比(LR)并且相乘。此外，有利地计算表示参数之间相关性的相关系数(r)。实施例3示出了表示参数之间相关性的r值，其对于非整倍性(如21三体)的风险评估非常有用并且是优选的。同样地，可以计算其他组合和/或疾病/病症的LR和相关系数。

如实施例3的实施方案中所述，临床群体的统计学分析表明，对于怀有具非整倍性胎儿的妊娠对象的风险评估，可优选地进行pro-EPIL、PlGF、PAPP-A、游离β-hCG与母体年龄确定以及使用或不使用额外生物物理学参数(如颈半透明度(NT))的组合测量。下文参照实施例3解释了使用母体年龄、pro-EPIL、PlGF、PAPP-A、游离β-hCG和颈半透明度计算非整倍性(如21三体)的风险评估的一个具体方式：

母体年龄说明了特定患病率和已有风险(Snijders等，1999，Ultrasound Obstet Gynecol 3(3)：167-70)。给定风险表示为几率并且再乘以21三体影响的妊娠和未影响的妊娠中pro-EPIL的LR(来自对数高斯分布)。未受影响的分布参数为SD＝0.2411，而21三体平均值和SD为：平均对数pro-EPIL MoM＝0.229，且SD＝0.177。最终几率转化回风险。对于pro-EPIL与PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的组合检测，计算21三体和未受影响的妊娠中对数MoM值之间的相关系数。对于未受影响的妊娠，相关系数为：与PlGF0.195，与PAPP-A 0.098，与游离β-hCG0.392。对于21三体影响的妊娠，相关系数是与PlGF：-0.091，与PAPP-A0.131，与游离β-hCG-0.090。

对于其他疾病/病症，包括非整倍性如13三体和18三体，可以进行类似计算。

如实施例3中所述以及表1a和1b中所示，临床群体的统计学分析表明，对于怀有具非整倍性胎儿的妊娠对象的风险评估，pro-EPIL、PlGF、PAPP-A、游离β-hCG与母体年龄的确定以及使用或不使用生物物理学参数(如颈半透明度)的组合测量是有意义的工具。例如，母体年龄、游离β-hCG、PlGF、pro-EPIL和颈半透明度(NT)的确定具有100％检出率，假阳性率仅为2.7％(截断值1/250)。不使用生物物理学参数(即，本实施例中的NT)，母体年龄、PAPP-A、游离β-hCG、PlGF和pro-EPIL的确定具有96.3％的检出率，假阳性率为9.6％(截断值1/250)。

在本发明上下文中，术语“检出率”是具有阳性结果的受影响个体的百分比。术语“假阳性率”是具有阳性结果的未受影响个体的百分比。

胎儿生长受限(FGR)的诊断

本发明在一个方面涉及用于诊断妊娠雌性对象中胎儿生长受限(FGR)的方法。因此，本发明在一个优选实施方案中涉及用于诊断妊娠雌性对象中胎儿生长受限(FGR)的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有FGR的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比，来自所述对象的所述样品中水平降低指示FGR。

在本发明的这个方面中，优选地额外测定所述对象的样品中胎盘生长因子(PlGF)的水平。与对照水平相比，样品中低的PlGF水平指示FGR。本发明这个方面中可以测定其水平的另一种额外标志物是sFlt1。与对照水平相比，样品中高的sFlt1水平指示FGR。这个方面的所述方法优选在妊娠的中三月或末三月中进行。

可以在这个方面的所述方法中使用的用于诊断FGR的额外标志物和参数是例如：PAPP-A、母体病史、AFP、游离β-hCG、hCG、抑制素A、激活素A、sEng、耻骨联合-宫底高度(SFH)、胎儿生物计量(股骨长度(FL)、头围(HC)、双顶径(BPD)、腹围(AC))和超声标志物(搏动指数、脐动脉多普勒、大脑中动脉多普勒、静脉导管多普勒)。

妊娠糖尿病(GDM)的诊断

本发明在另一个方面涉及用于诊断妊娠雌性对象中的妊娠糖尿病(GDM)的方法。因此，本发明在一个优选实施方案中涉及用于妊娠雌性对象中妊娠糖尿病(GDM)的诊断、预后、风险评估、风险分级和/或治疗控制的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有GDM的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比来自所述对象的所述样品中水平降低指示GDM。

可以在这个方面的所述方法中使用的用于诊断GDM的额外标志物和参数是例如：卵泡抑素样蛋白3(Follistatin-like 3，FSTL3)、性激素结合球蛋白(SHBG)、脂连蛋白、瘦蛋白、抵抗素、糖基化纤连蛋白、胎盘催乳激素、C反应蛋白(CRP)、激活素、肌抑素(myostatin)、特定细胞因子、sFlt-1和/或PlGF。特定细胞因子可以是例如免疫/血细胞生成素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)相关分子或趋化因子。实例包括白介素(IL)-6、IL-8、IL-lβ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-I或TNF-α、或其任意组合。

非整倍性的诊断

本发明在另一个方面涉及用于妊娠雌性对象的未出生胎儿中非整倍性如13三体、18三体和21三体(优选21三体)的诊断和/或风险分级的方法。因此，本发明在一个优选实施方案中涉及用于所述对象的未出生胎儿中非整倍性，优选13三体、18三体和21三体，最优选21三体的诊断和/或风险分级的方法，其包括以下步骤：

i)提供所述对象的体液样品，

ii)测定所述样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)或其片段的水平，

iii)将在所述样品中测定的水平与来自不具有所述非整倍性的对象的对照水平相比较；

其中与所述对照水平相比来自所述对象的所述样品中水平提高指示非整倍性。

在这个方面的所述方法中，对象优选处于妊娠的首三月或中三月期，最优选处于首三月。在这个方面，中三月也非常优选。此外，在本发明的这个方面中，优选地评估中包括母体年龄。已知母体年龄是胎儿非整倍性(尤其是21三体)的风险因素。妊娠雌性越老，其胎儿中非整倍性(尤其是21三体)的可能性越大(Snijders等，1999，Ultrasound Obstet Gynecol3(3)：167-70)。

本发明这个方面中还优选的是除了其他生物化学和/或生物物理学标志物之外测定pro-EPIL。例如，测定所述对象的样品中选自以下的一种或更多种生物标志物的水平：胎盘生长因子(PlGF)、PAPP-A、sFlt1、AFP、游离β-hCG、抑制素A，激活素A、sEng、hCG、非缀合雌三醇3和无细胞胎儿DNA。优选地，除了pro-EPIL水平之外，另外测定所述对象的样品中选自胎盘生长因子(PlGF)、PAPP-A和游离β-hCG的一种或更多种生物标志物的水平，更优选地另外测定所述对象的样品中选自胎盘生长因子(PlGF)、PAPP-A和游离β-hCG的两种或全部生物标志物的水平。因此，涉及的标志物组包括：

a)PAPP-A和pro-EPIL

b)游离β-hCG和pro-EPIL

c)PlGF和pro-EPIL

d)PAPP-A和游离β-hCG和pro-EPIL

e)PAPP-A和PlGF和pro-EPIL

f)游离β-hCG和PlGF和pro-EPIL

g)PAPP-A和游离β-hCG和PlGF和pro-EPIL。优选PAPP-A和游离β-hCG和PlGF和pro-EPIL的组合。在21三体中，与对照水平相比pro-EPIL和游离β-hCG提高，而与对照水平相比PAPP-A和PlGF降低。

除了pro-EPIL(以及优选额外的母体年龄)或上述标志物组(以及优选额外的母体年龄)之外，在诊断/风险评估中包括生物物理学参数，优选超声标志物，例如颈半透明度(NT)。胎儿NT厚度与21三体和其他胎儿非整倍性的风险有关(Nicolaides K.2011，Prenat Diagn 31：7-15)。在本发明这个方面一个特别优选的实施方案中，测定PAPP-A和游离β-hCG和PlGF和pro-EPIL的水平并且与对照水平相比较，并且在非整倍性(优选21三体)的诊断/评估中包括来自母体年龄和胎儿NT厚度的信息。

优选地，在这个方面的所述方法中，至少测定以下的水平：

i)proEPIL、游离β-hCG和PlGF的水平，或

ii)proEPIL、游离β-hCG、PAPP-A和PlGF的水平，或

iii)proEPIL、游离β-hCG、PlGF和超声标志物(优选颈半透明度)的水平，或

iv)proEPIL、游离β-hCG、PAPP-A、PlGF和超声标志物(优选颈半透明度)的水平。

在这个方面的上下文中，优选地确定基于生物标志物和/或超声标志物水平的似然比组。优选地，进行高斯分析以确定似然比。

此外，可以基于以下来确定最终风险(final risk)：

a)妊娠雌性对于胎儿中的13三体、18三体和21三体的已有风险，以及

b)所述似然比组。

已有风险可以基于母体病史信息，例如母体年龄。因此，已有风险(例如，表示为几率)可例如来源于母体年龄特异性患病率，并且乘以受影响妊娠和未受影响妊娠中生物化学标志物(以及根据情况的其他标志物)之对数高斯分布的似然比(LR)。

本发明在一个方面中还涉及用于确定胎儿中染色体异常，优选非整倍性，更优选21三体、18三体、13三体，最优选21三体的风险方法，其包括：

a)测定从妊娠雌性对象采集的一个或更多个血液样品中早期胎盘胰岛素样肽(pro-EPIL)、胎盘生长因子(PlGF)(和任选的妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A))和游离人绒毛膜促性腺激素(游离β-hCG)的水平；

b)任选地测定所述胎儿的超声标志物，并且

c)使用pro-EPIL、PlGF、(任选的PAPP-A)和游离β-hCG的测量水平确定所述胎儿中染色体异常的风险。

优选地，另外测定胎儿的一种或更多种超声标志物，并且使用胎儿中pro-EPIL、PlGF、(任选的PAPP-A)、游离β-hCG和一种或更多种超声标志物的水平确定所述胎儿中染色体异常的风险。超声标志物优选颈半透明度。在这种情况下优选另外测定PAPP-A。

在这个方面的所述方法中，可以测定选自甲胎蛋白(AFP)、抑制素A、hCG、非缀合雌三醇3和无细胞胎儿DNA的至少一种额外生物化学标志物的水平，并且可使用pro-EPIL、PlGF、PAPP-A、游离β-hCG和所述至少一种额外的生物化学标志物的水平确定胎儿中染色体异常的风险。

优选地在这个方面中，优选地从处于妊娠的首三月或中三月(优选首三月)的妊娠对象采集一个或更多个生物样品，优选地从妊娠的第10周至19周，更优选妊娠的第11周至13周的妊娠个体采集一个或更多个生物样品。

在这个方面的一个实施方案中，确定风险包括基于在胎儿中发生染色体异常的雌性对象已有风险和基于pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的量的似然比组计算最终风险。优选地，进行多元高斯分析以确定似然比。所述方法还可包括使用一种或更多种母体病史参数(至少优选母体年龄)的似然比。

如上所述，本发明的方法可用于基于生物化学标志物和生物物理学标志物的水平确定妊娠个体怀有具有染色体异常胎儿的风险。

本发明还涉及用于确定妊娠雌性对象或所述对象的未出生胎儿中的产前疾病或病症，优选胎儿中的染色体异常的风险的设备，所述设备包含：

用于输入从妊娠个体获得的一个或更多个血液样品中pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的量的数据输入装置；以及用于使用pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的量确定胎儿中染色体异常风险的计算装置。

优选地，所述设备还包含用于输入从妊娠个体获得的一个或更多个血液样品中甲胎蛋白(AFP)、抑制素A、hCG、非缀合雌三醇3和无细胞胎儿DNA中的至少一种的量的数据输入装置；以及使用甲胎蛋白(AFP)、抑制素A、hCG、非缀合雌三醇3和无细胞胎儿DNA中的至少一种的量以及pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的量确定胎儿中染色体异常的风险。

本发明还涉及基于本发明方法的妊娠个体的医学概况(medical profile)。例如，本发明涉及用于妊娠雌性对象的医学概况，其包含用于确定胎儿中染色体异常风险的信息，其中所述信息包括来自妊娠个体的一个或更多个血液样品中pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和游离β-hCG的水平，并且其中所述医学概况存储在计算机可读介质上。

本发明还涉及在根据本发明的任何方法中使用抗pro-EPIL抗体。

所附实施例和附图用于更详细解释本发明，而不是将本发明限制于所述实施例和附图。

本文引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用整体并入本文。

序列

SEQ-ID No.1：pro-EPIL序列(UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q14641)。

实施例

抗体的标记

在本测定中，分别使针对EPIL C链98-108区域的单克隆抗体EPIL15(WO 2009/133088 A1)和针对EPIL A链125-137区域的单克隆抗体EPIL02(WO 2009/133088 A1)偶联至花菁5.5(GE Healthcare UK Limited)和-Tb(Lumiphore，Inc.，Richmond，Canada)。根据制造商描述的偶联方案进行偶联反应。

实施例1：使用两种单克隆抗体开发pro-EPIL测定

开发使用时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术(Mathis，1993.Clin Chem 39(9)：1953-9)的均相夹心荧光免疫测定用于检测pro-EPIL。

在使用前，将-Tb缀合抗体和花菁5.5缀合抗体的储液用测定缓冲液(100mmol/L磷酸钠pH 7，不含蛋白酶的0.1％牛血清白蛋白，0.2mg/mL小鼠IgG)分别稀释为0.3μg/mL和5μg/mL。将重组人pro-EPIL(Abnova，Taiwan，Ref.No：H00003641-P01)在正常人血清中稀释以提供pro-EPIL标准物。通过将50μL样品/校准物、50μL花菁5.5缀合抗体溶液和50μL-Tb缀合抗体溶液在B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS仪器(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上根据制造商说明书于下37℃孵育来进行免疫测定。该测定的反应时间为59分钟。通过使用B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS仪器在707和620nm下进行同时双波长测量来测量特异性荧光(RFU)。

实施例2：测定的剂量响应曲线

可以在上述单克隆免疫测定中使用重组pro-EPIL作为标准材料来生成剂量响应曲线。图1中示出了一个典型的剂量响应曲线。

实施例3：产前疾病中的pro-EPIL

研究群体

为了确定pro-EPIL是否是病理性妊娠的可用标志物，将上述pro-EPIL的均相夹心荧光免疫测定用于评价经历正常妊娠的198位妇女(首三月、中三月和末三月)、受妊娠糖尿病(GDM)影响的11个妊娠、受21三体影响的27个妊娠以及受宫内生长受限影响的43个妊娠(首三月、中三月和末三月)的血清样品中的pro-EPIL。用重组人pro-EPIL校准特异性pro-EPIL测定。

在常规首三月、中三月和末三月的医院访问中采集样品。所有孕妇签署知情同意书，并且由不同的医院实验室伦理委员会(Hospital labs Ethics Committee)批准。

测量

使用全自动化夹心免疫测定系统在B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS仪器(Thermo Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上检测pro-EPIL。这种随机存取分析仪采用基于两种荧光团之间的非放射性转移的灵敏性时间分辨放大穴状化合物发射(TRACE)技术。用于检测pro-EPIL的自动化测定基本上基于使用上述与EPIL C链和EPILA链特异性结合的两种单克隆抗体的夹心免疫测定。用重组人pro-EPIL校准特异性pro-EPIL测定。BRAHMS pro-EPIL KRYPTOR测定的测量范围为2至835ng/mL(图1)。定量限(功能灵敏度)是4ng/mL。在pro-EPIL浓度为25.5ng/mL时，测定内和测定间变异分别为1.2％和5.7％。

为了确定妊娠糖尿病的风险，测量在首三月和中三月期间从孕妇采集的样品中的pro-EPIL。

为了确定胎儿中染色体异常的风险，测量在首三月期间从孕妇采集的样品中的以下参数：i)PAPP-A、游离β-hCG，ii)PAPP-A、游离β-hCG、PlGF，iii)PAPP-A、游离β-hCG、pro-EPIL。使用组合这些生物标志物的算法确定检出率和假阳性率。

对于孕妇中发生胎儿生长受限的风险评估分析，测量在首三月、中三月和末三月期间从所述对象采集的样品中的以下参数：PlGF和pro-EPIL。使用组合这些生物标志物的算法确定检出率和假阳性率。

统计学分析

通过确定正常群体和各胎儿非整倍性群体的中位数来计算确定胎儿非整倍性风险的数学算法。PAPP-A、游离β-hCG、PlGF和pro-EPIL表示为MoM以标准化结果。生成病例和对照的pro-EPIL MoM的箱线图。然后使用回归分析来确定pro-EPIL MoM与游离β-hCG MoM、PAPP-A MoM和PlGF MoM之间的关联的显著性。类似地，测量的NT表示为与妊娠的预期正态均值的差(Δ值)，然后使用回归分析来确定pro-EPIL MoM与ΔNT之间的关联的显著性。

可通过将生物化学标志物(例如，pro-EPIL、PlGF、PAPP-A或游离β-hCG)的MoM测量值除以从相同种族孕妇之具有未受影响妊娠的孕妇组获得的各中位数来校正种族的pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和/或游离β-hCG的MoM测量值。需要时，通过将生物化学标志物(例如，pro-EPIL、PlGF、PAPP-A或游离β-hCG)的MoM测量值除以从具有未受影响的妊娠的抽烟孕妇组中获得的各中位数来校正抽烟的pro-EPIL、PlGF、PAPP-A和/或游离β-hCG的MoM测量值。

已有风险(表示为几率)来自母体年龄特异性患病率，并且乘以受影响的妊娠和未受影响的妊娠中生物标志物的对数高斯分布的似然比(LR)。对于PAPP-A、游离β-hCG、PlGF和pro-EPIL的组合，确定受影响的妊娠和未受影响的妊娠中对数MoM值之间的相关系数。

通过确定未受影响的妊娠以及GDM和FGR组的中位数来计算用于进行风险估计的统计过程。对于每一生物化学物，计算MoM。然后进行多元高斯分析以确定似然比。

应用Mann-Whitney U检验来确定每个结局组中的中位数MoM值与对照中的差异的显著性。

结果

正常妊娠妇女中的pro-EPIL浓度与孕龄之间具有相关性(r＝0.81；p＜0.0001)。首三月、中三月和末三月时测量的中位数血清pro-EPIL浓度分别为16.2、32.4和76.2ng/ml(图2)。

在正常组中，平均对数pro-EPIL MoM为-0.001，标准差(SD)为0.241。对数pro-EPIL MoM和对数游离β-hCG MoM之间具有显著相关性(r＝0.392，p＜0.0006)，但是与对数PAPP-A MoM(p＝0.407)、对数PlGF MoM(p＝0.099)和Δ NT(p＝0.855)则没有。

在21三体组中，pro-EPIL的中位数MoM(1.71MoM)显著高于(p＜0.0001)对照组(图3)。

在21三体妊娠中，平均对数pro-EPIL MoM为0.229，SD为0.177。对数pro-EPIL MoM与对数游离β-hCG MoM(p＝0.623)、与对数PAPP-A MoM(p＝0.490)、与对数PlGF MoM(p＝0.652)和Δ NT(p＝0.081)之间没有显著相关性。

表1a和1b中给出了用于21三体的风险评估的多参数分析(风险截断值1/250)。在风险计算中包括pro-EPIL影响检出率和假阳性率两者。当向首三月生物化学添加pro-EPIL时，FPR具有改善(FPR：9.6％和DR：96.3％)(表1a)。此外，当将组合测试中的PAPP-A替换成pro-EPIL时，达到了百分之百的DR(FPR：2.7％和DR：100％)(表1b)。

在GDM组中，在首三月和中三月，pro-EPIL的中位数MoM(分别为0.31和0.22MoM)显著低于(p＝0.0017和p＝0.0005)正常妊娠组(0.95和1.07MoM)(图4)。

在FGR组中，在中三月和末三月，pro-EPIL的中位数MoM(分别为0.66和0.63MoM)显著低于(p＝0.0018和p＝0.0028)对照组(1.07和1.05MoM)(图5)。

用于FGR的风险评估的多参数分析示出(表2)，与PlGF测量后的DR(DR：33％和47％)或pro-EPIL测量后的DR(DR：38％和33％)相比，在中三月和末三月测定PIGF和pro-EPIL的特征在于具有分别为57％和67％的最高检出率(DR)。

表1(a，b)：用不同算法使用多参数分析的非整倍性风险评估的检出率(DR)和假阳性率(FPR)(生物化学风险：表1a；组合风险：表1b)。首三月时21三体的实验结果。

表1a

表1b

表2：用不同算法使用多参数分析的具有胎儿生长受限的妊娠风险评估的检出率(DR)

实施例4：产前疾病中的pro-EPIL

如下延续实施例3的研究：

研究群体

为了确定pro-EPIL是否是病理性妊娠的可用标志物，将上述pro-EPIL的均相夹心荧光免疫测定用于评价经历正常妊娠的267位妇女(首三月、中三月和末三月)、受妊娠糖尿病(GDM)影响的11个妊娠(首三月和中三月)、受21三体影响的27个妊娠(首三月和中三月)以及受宫内生长受限影响的43个妊娠(首三月、中三月和末三月)的血清样品中的pro-EPIL。用重组人pro-EPIL校准特异性pro-EPIL测定。

结果

正常妊娠妇女中的pro-EPIL浓度与孕龄之间具有相关性(r＝0.81；p＜0.0001)。首三月、中三月和末三月时测量的中位数血清pro-EPIL浓度分别为16.2、32.4和76.2ng/ml(图2)。

在正常组中，在首三月，平均对数pro-EPIL MoM为-0.001，标准差(SD)为0.241。对数pro-EPIL MoM和对数游离β-hCG MoM之间具有显著相关性(r＝0.392，p＜0.0006)，但是与对数PAPP-A MoM(p＝0.407)、对数PlGF MoM(p＝0.099)和Δ NT(p＝0.855)则没有。

在21三体组中，在首三月，pro-EPIL的中位数MoM(1.71MoM)显著高于(p＜0.0001)对照组(图3)。

在21三体妊娠中，平均对数pro-EPIL MoM为0.229，SD为0.177。对数pro-EPIL MoM与对数游离β-hCG MoM(p＝0.623)、与对数PAPP-A MoM(p＝0.490)、与对数PlGF MoM(p＝0.652)和ΔNT(p＝0.081)之间没有显著相关性。

表1a和1b中给出了用于21三体风险评估的多参数分析(风险截断值1/250)。在风险计算中包括pro-EPIL影响检出率和假阳性率两者。当向首三月生物化学添加pro-EPIL时，FPR具有改善(FPR：9.6％和DR：96.3％)(表1a)。此外，当将组合测试中的PAPP-A替换成pro-EPIL时，达到了百分之百的DR(FPR：2.7％和DR：100％)(表1b)。

在21三体组中，在中三月，pro-EPIL的中位数MoM(1.62MoM)显著高于(p＝0.0007)正常妊娠组(1.07MoM)(图6)。

在GDM组中，在首三月和中三月，pro-EPIL的中位数MoM(分别为0.31和0.22MoM)显著低于(p＝0.0017和p＝0.0005)正常妊娠组(0.95和1.07MoM)(图4)。

在FGR组中，在中三月和末三月，pro-EPIL的中位数MoM(分别为0.66和0.63MoM)显著低于(p＝0.0018和p＝0.0028)对照组(1.07和1.05MoM)(图5)。

用于FGR风险评估的多参数分析示出(表2)，与PlGF测量后的DR(DR：33％和47％)或pro-EPIL测量后的DR(DR：38％和33％)相比，在中三月和末三月时测定PlGF和pro-EPIL的特征在于具有分别为57％和67％的最高检出率(DR)。