肺炎支原体检测试剂及其用途的制作方法

本发明涉及一种肺炎支原体检测试剂及其用途(免疫层析法试验设备、肺炎支原体感染检查法)等。本申请基于2014年7月30日所申请的日本国专利申请第2014-155388号主张优先权，该专利申请的全部内容通过参照而被引用。
背景技术：
：与细菌性的典型肺炎不同，在胸部X射线照片中呈现肺浸润像的非细菌性肺炎的30～40％的原因为肺炎支原体。从人体分离的支原体中，病原性明显的物质为肺炎支原体。支原体肺炎多见于幼儿、学童。潜伏期间平均为14天。有多种多样的并发症的报道，在小儿中，脑炎、格林巴利综合征、皮疹等的皮肤炎等的并发症多。细菌性肺炎虽急剧减少，但肺炎整体中支原体肺炎的比率升高。肺炎支原体作为社区获得性肺炎的原因菌，其数量仅次于肺炎球菌。支原体为可自增殖的最小的微生物，难以用光学显微镜进行观察。与其它细菌不同的是其不具有细胞壁，因此，在青霉素及头孢烯类抗生素中不显示感受性，在治疗中通常使用四环素系或大环内酯类的抗生素。为了诊断肺炎支原体感染，可利用如下的各种方法。来自咽拭子、咳痰的分离培养法用于确定诊断，但由于需要特殊的培养基及长的天数(2～4周)，因此不能应用于迅速诊断。在由肺炎支原体感染所产生的抗体的检测法中，例如利用粒子凝集法(PA)、红细胞凝集反应(IHA)等检测血清抗体。但是，均不能应用于急性期的诊断。在利用了咽拭子、咳痰等检体中的肺炎支原体核酸的基因扩增技术的检测法中，聚合酶连锁反应(PCR)引起的判断与作为确定诊断的分离培养法的结果非常相关。另外，作为与PCR相比简便的手段，也报道有LAMP(Loop-MediatedIsothermalAmplification)法的利用。但是，均需要复杂的操作，在测定中需要很多的劳动力，不能应用于迅速的诊断。在支原体肺炎中，由于有效的抗生素受到限制，因此，在医疗现场高度需要在感染初期即判定肺炎支原体感染的有无。一般而言，如果可得到特异性抗体，则可以利用ELISA法等酶免疫测定法(EIA)。另外，可以应用于化学发光法、色素法、荧光法等各种测定法。但是，任一种方法都需要各自专用的测定装置，在这点上不能说抓住医疗现场的需求。另一方面，免疫层析法(以下，称为免疫层析法)的操作简便，不需要特别的装置，进而可以在短时间(例如10～20分钟)内测定。但是，可用EIA法检测的抗体不一定可以应用于免疫层析法，大多需要更高的特异性及高灵敏度的抗体。关于肺炎支原体感染，目前，市售有抗P1蛋白质单克隆抗体(专利文献1)或使用了抗RibosomalProteinL7/L12蛋白质特异性抗体的免疫层析用试剂(专利文献2)并应用于诊断，但不能说灵敏度高，难以说显示与临床现场中的需求相应的充分的性能。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2013-72663号公报专利文献2：日本特开2012-6968号公报非专利文献非专利文献1：VarshneyAKetal.,ClinVaccineImmunol.Feb2008；15(2):215-220.技术实现要素：发明所要解决的课题因此，本发明的课题在于，提供一种可适用于利用免疫层析法的肺炎支原体感染的检测的特异性抗体及使用其的检测试剂等。用于解决课题的技术方案在为了解决上述课题而进行的研究中，本发明人等关注于作为与P1蛋白质相比能够以高灵敏度检测肺炎支原体感染的目标蛋白质的P30蛋白质。P30为富含脯氨酸(20.7％)的分子量29,743的粘接蛋白质。迄今为止，P30分子已被鉴定，也取得针对P30的抗体。另外，作为利用了该抗体的测定法，有ELISA法的报道(非专利文献1)，但没有报道该抗体的向免疫层析法的应用。这次，重新尝试了适于免疫层析法的抗体的制作，结果可得到显示优异的性能的抗体。使用该抗体的免疫层析法与使用针对P1蛋白质的抗体的情况相比，可进行明显地高灵敏度的检测。以下的发明基于上述的成果。[1]一种肺炎支原体检测试剂，其含有针对肺炎支原体的P30蛋白质的特异性抗体。[2]根据[1]所述的检测试剂，其用于免疫层析法。[3]根据[1]或[2]所述的检测试剂，其中，所述特异性抗体为单克隆抗体。[4]根据[3]所述的检测试剂，其中，所述单克隆抗体为由保藏号NITEBP-01880的杂交瘤或保藏号NITEBP-01881的杂交瘤所产生的抗体。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的检测试剂，其中，所述特异性抗体为将除去了从N末端至95号氨基酸的重组P30蛋白质作为抗原所制备的抗体。[6]根据[5]所述的检测试剂，其中，所述重组P30蛋白质由序列号2的氨基酸序列构成。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的检测试剂，其中，所述特异性抗体用着色合成高分子粒子或金属胶体粒子进行标记。[8]根据[7]所述的检测试剂，其中，所述金属胶体粒子为金胶体粒子。[9]一种肺炎支原体检测试剂盒，其含有[1]～[8]中任一项所述的检测试剂。[10]一种免疫层析试验设备，其具备针对肺炎支原体的P30蛋白质的第1特异性抗体、针对肺炎支原体的P30蛋白质的第2特异性抗体及膜载体，其中所述第1特异性抗体固定化于所述膜载体而构成检测部，所述第2特异性抗体被标记物质所标记，且担载于离开所述检测部的位置。[11]根据[10]所述的试验设备，其中，所述第1特异性抗体为由保藏号NITEBP-01881的杂交瘤所产生的抗体，所述2特异性抗体为由保藏号NITEBP-01880的杂交瘤所产生的抗体。[12]根据[10]或[11]所述的试验设备，其中，所述标记物质为着色合成高分子粒子或金属胶体粒子。[13]根据[12]所述的试验设备，其中，所述金属胶体粒子为金胶体粒子。[14]一种肺炎支原体感染检查法，其使用了[10]～[13]中任一项所述的免疫层析试验设备。[15]根据[14]所述的检查法，其中，将源自生物体的材料用于检体。[16]根据[15]所述的检查法，其中，所述生物体材料为咽拭子或鼻腔抽吸液。[17]一种针对肺炎支原体的P30蛋白质的特异性单克隆抗体，其是由保藏号为NITEBP-01880或NITEBP-01881的杂交瘤产生的。[18]一种标记化抗体，其是用金属胶体粒子标记[17]所述的特异性单克隆抗体而得到的。[19]根据[18]所述的标记化抗体，其中，所述金属胶体粒子为金胶体粒子。[20]一种保藏号为NITEBP-01880或NITEBP-01881的杂交瘤。附图说明图1是测试条的构成的一例。具体实施方式本发明提供一种对肺炎支原体的检测有用的试剂(肺炎支原体检测试剂)及试剂盒。本发明的肺炎支原体检测试剂的特征在于，也可适用于免疫层析法(并不妨碍适用于EIA法或蛋白质印迹法等)。即，本发明的试剂可以进行利用了免疫层析法的高灵敏度的肺炎支原体感染的检测。本发明的试剂盒含有本发明的试剂作为主要构成要素。可以将在实施检测法时使用的其它的试剂(展开用溶剂、缓冲液等)和/或装置或器具(容器、反应装置等)包含在试剂盒中。另外，也可以将抗原(P30蛋白质或其一部分)包含在试剂盒中。另外，通常，在本发明的试剂盒中付加操作说明书。本发明的试剂的有效成分为针对肺炎支原体的P30蛋白质的特异性抗体。构成本发明的试剂的抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体的任一种，从灵敏度的方面考虑，特别优选为单克隆抗体。针对P30蛋白质为特异性的多克隆抗体可以按照常规方法制作。例如，将根据需要与适当的佐剂混合的P30蛋白质给药于适当的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔)的皮下或腹腔内。初次免疫后，在第2～3周按照常规方法进行追加免疫时，可得到效价高的抗血清。例如在最终免疫1周后采取血液并将血清分离，通过与利用硫酸铵的盐析、离子色谱等通常的抗体的精制同样的方法取得免疫球蛋白分离。另一方面，P30蛋白质单克隆抗体如果参考本说明书的信息，则可以由按照常规方法制作的杂交瘤得到。例如，用根据需要与适当的佐剂混合的P30蛋白质将适当的哺乳动物(例如小鼠、大鼠等)进行免疫。而且，通过使该动物的脾脏细胞、B淋巴细胞等抗体产生细胞与源自适当的动物(例如小鼠、大鼠等)的骨髄瘤细胞融合，可以得到杂交瘤。细胞融合例如可以通过以下方法来进行：在适当的培养基中使抗体产生细胞和骨髄瘤细胞在聚乙二醇等存在下融合的聚乙二醇(PEG)法等。细胞融合后，利用HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸甙的培养基)等选择培养基选别杂交瘤，对于产生辨识P30蛋白质的抗体的杂交瘤的能力，按照常规方法(例如EIA法)进行筛选。接着，将产生所期望的抗体的杂交瘤按照常规方法(例如有限稀释法)进行克隆，选择产生单克隆抗体的杂交瘤。抗体制作时用于免疫的P30蛋白质(抗原)可以通过基因重组由大肠杆菌大量生产。P30为由274个氨基酸构成的蛋白质，但在从N末端至第95号的序列中存在2个疏水性的跨膜区。因此，由大肠杆菌生产P30蛋白质全长时，溶解性差且难以处理。因此，优选使将第95号之前的氨基酸序列除去的重组P30蛋白质(将氨基酸序列示于序列号2。)表达而制备，作为抗原蛋白质利用。如后述的实施例所示，本发明人等成功取得特异性地辨识P30蛋白质的多个单克隆抗体。为了识别，对这些抗体赋予#1～#19的克隆号。产生这些抗体中在免疫层析法中显示高的灵敏度的抗体#3的杂交瘤克隆#3、及产生抗体#9的杂交瘤克隆#9如下所述，被保藏于所规定的保藏机构。＜杂交瘤克隆#3＞保藏机构：日本国家技术评价研究所专利微生物保藏中心(邮编292-0818)日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室保藏日：2014年6月23日保藏号：NITEBP-01880＜杂交瘤克隆#9＞保藏机关：日本国家技术评价研究所专利微生物保藏中心(邮编292-0818)日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室保藏日：2014年6月23日保藏号：NITEBP-01881抗P30蛋白质抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)根据需要进行标记化。标记化按照常规方法进行即可。作为用于标记化的标记物质，优选不溶性粒状物质。作为不溶性粒状物质，可列举将胶乳、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等合成高分子利用色素分子标记而得到的着色合成高分子粒子、金属胶体粒子(金、银、铜、铁、铂、钯、它们的混合物(例如金和铂的混合物、金和银的混合物、钯和铂的混合物)的胶体粒子)、红细胞等。优选可以通过目视简便且迅速地观察变化的粒子，采用着色合成高分子粒子或金属胶体粒子即可。粒子的粒径例如为15～100nm，优选为30～80nm。金属胶体粒子既可以使用市售品，也可以利用常规方法制备。金属胶体粒子中，从容易利用等理由出发，优选金胶体粒子。以金属胶体粒子的情况为例对标记化的方法进行说明时，相对于金属胶体粒子溶液(通常540nm中的吸光度约为2.0)1L，通常添加0.1～100mg、优选0.5～20mg的抗P30蛋白质抗体，在冷藏或室温下搅拌5分钟～24小时。接着，用牛血清白蛋白(BSA)(通常为0.01～10g，优选0.1～2g)等封闭，作为离心分离后的沉淀，可以得到用金属胶体粒子标记的抗P30蛋白质抗体。作为缓冲液，可以使用通常用于免疫学的试验的缓冲液，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。缓冲液的pH通常为4.5～9.5，优选为5.5～8.5的范围。可以使用抗P30蛋白质抗体构建肺炎支原体感染检测用的试验器具(免疫层析试验设备)。即，本发明也提供一种使用抗P30蛋白质抗体的免疫层析试验设备。在本发明的设备中，具备针对肺炎支原体的P30蛋白质的第1特异性抗体(第1抗P30蛋白质抗体)及针对肺炎支原体的P30蛋白质的第2特异性抗体(第2抗P30蛋白质抗体)及膜载体。因此，第1抗P30蛋白质抗体固定化于膜载体而构成检测部。另一方面，第2特异性抗体被标记物质所标记，担载于离开检测部的位置。本说明书中，“固定”是指以抗体不移动的方式配置于膜等载体。“担载”是指在载体中或表面可移动地配置。以下，一边参照图1(作为具体例的测试条)，一边说明试验设备的构成。第1特异性抗体和第2特异性抗体均对于P30蛋白质为特异性。第1特异性抗体和第2特异性抗体优选对于P30蛋白质为特异性不同的抗体，例如独立的抗P30蛋白质抗体。第1特异性抗体为捕捉抗体，其固定于载体而构成检测部。“检测部”是指捕捉通过抗原抗体反应而形成的检体中的抗原和第1特异性抗体的复合体，从而检测抗原的存在的部位。载体可使用能够通过静电作用或疏水相互作用等物理的作用而结合蛋白质、且能够展开检体中的成分、抗原-第1特异性抗体复合体、对照用标记物质等的材质的物质。作为膜载体的材质，可以列举硝基纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸纤维素。优选载体为膜状(膜载体)。除检测部之外，优选载体具备用于确认检体是否适当地被展开的对照部。对照部中，固定有可与对照用标准物质结合的物质。优选检测部和对照部在将展开方向横断的方向以线状设置在载体上(也分别称为“测试线”及“对照线”)。载体上的检测部及对照部的位置关系没有限定，但通常在比检测部更靠下游侧形成对照部。补充抗体及可与对照用标记物质结合的物质的固定方法可以根据载体的种类，按照常规方法进行。例如，可以通过使用市售的抗体涂布机将适当稀释的抗体溶液涂布并进行干燥而固定。固定于检测部位的捕捉抗体的量优选为0.05～10μg，更优选为0.1～3μg。第2特异性抗体为用标记物质标记的抗体，即“标记抗体”，在离开检测部位的位置担载于膜等载体。典型而言，担载标记抗体的载体为与将捕捉抗体固定化的载体不同的部件。但是，可以使标记抗体担载于将捕捉抗体固定化的载体。担载第2特异性抗体(标记抗体)的标记抗体担载部件配置于比检测部更靠上游侧。标记抗体担载部件在干燥状态下担载标记抗体，在液体中浸润时释放标记抗体。作为标记抗体担载部件的材质，可列举玻璃纤维、纤维素纤维、塑料纤维等。通过在含有标记抗体的适当的缓冲液中含浸标记抗体担载部件、或将含有标记抗体的适当的缓冲液添加于标记抗体担载部件并进行干燥，可以使标记抗体担载于标记抗体担载部件。担载于标记抗体担载部件的标记抗体的量优选为0.01～1μg，更优选为0.03～0.3μg。检体添加部件配置于标记抗体担载部件的上游侧，优选检体添加部件中的至少下游侧区域的下面与标记抗体担载部件中的上游侧的区域的上面接触。优选标记抗体担载部件的一部分夹入检体担载部件的下面和载体的上游侧的区域的上面之间。优选具备配置于载体的下游的吸收部件。吸收部件以其上游侧区域的下面与存在于比载体的检测部更靠下游侧的区域的上面接触的方式被配置。在本发明的试验设备中，将根据需要进行了前处理的液体状的检体滴加于检体添加部件时，检体浸润于标记抗体担载部件，检体和标记抗体的混合物在载体(典型而言为膜载体)上移动，在载体中向着检测部位展开。在检体中含有P30蛋白质(抗原)的情况(即肺炎支原体感染病例的情况)下，该抗原和标记抗体形成免疫复合体。而且，在检测部通过抗原抗体反应，该复合体被捕捉抗体捕捉，从而聚集并显色。因此，可以通过目视观察检测部中的呈色的程度，来判定检体中的抗原的有无。在载体具备对照部的情况下，从标记抗体担载部件释放的对照用标记物质被对照部的可与对照用标记物质结合的物质捕捉，从而聚集并显色。在将标记抗体也用作对照用标记物质的情况下，不与检体中的抗原形成复合体而残留的标记抗体穿过检测部位，被固定于下游的对照部的可与标记抗体结合的物质捕捉，从而聚集并显色。供至本发明的试验设备的检体为有可能含有肺炎支原体的检体。作为可用作检体的源自生物体的材料，可列举咽拭子、鼻拭子、鼻腔抽吸液、鼻腔清洗液、咳痰、肺胞清洗液等，但并不限定于这些。作为检体的前处理，可列举将从疑似感染了肺炎支原体的被检体中采取的源自生物体的材料溶解于前处理试剂，制备用于滴加于试验设备的液体。这种前处理为了可以展开检体、或者为了可以进行检体的良好的展开而进行。前处理试剂可以使用各种缓冲液。作为缓冲液，可以使用通常用于免疫学试验的缓冲液，例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、Good’s缓冲液等。也可以为了使非特异性结合反应降低而在前处理试剂中含有表面活性剂。作为表面活性剂，可以使用TritonX-100(商品名，聚乙二醇单-对-异辛基苯基醚)、Tween20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)、Tween80(聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基胺基]丙磺酸)、SDS(十二烷基硫酸钠)等。也可以并用2种以上的表面活性剂。以下，利用实施例更详细地说明本发明，但本发明并不由实施例所限定。实施例1.对肺炎支原体P30蛋白质特异性的单克隆抗体的制作1-1.抗原蛋白质的制备在P30蛋白质(序列号1)中，从N末端至第95号的序列中存在2个疏水性的跨膜区。使除去了从N末端至95号氨基酸的重组P30蛋白质(将氨基酸序列示于序列号2。)由大肠杆菌表达，作为抗原蛋白质利用。以下，示出制备抗原蛋白质的步骤的概要。首先，以肺炎支原体(M.Pneumoniae)M129株的基因组DNA为模板，通过PCR法将P30基因的片段进行扩增。作为PCR的引物序列，使用AGGCATATGGGACTGCCAATTGTGAAGCG(序列号3)和CAGGTCGACTTAGCGTTTTGGTGGAAAAC(序列号4)(划线部分别为通过限制酶NdeI和SalI切断的部位)。将进行了扩增的P30基因片段嵌入于TaKaRaBio社的pcoldProS2表达载体的NdeI-SalI部位，制成重组P30表达载体。将P30表达载体导入大肠杆菌BL21株，通过添加1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)并在15℃下低温培养，使重组P30蛋白质表达。将由大肠杆菌表达的重组P30蛋白质通过His-tag精制柱和凝胶过滤进行精制。将精制的重组P30蛋白质进行定量，将适当的量作为免疫用抗原使用。1-2.免疫及抗体的精制用以下的方法尝试取得对于抗原蛋白质为特异性的单克隆抗体。＜材料＞(1)抗原重组P30精制蛋白质(2)免疫动物BALB/cA小鼠6周龄雌性(日本クレア株式会社)3只(3)佐剂TiterMaxGold(G-3フナコシ)(4)小鼠骨髓瘤细胞P3U1(5)培养基、器材、试剂RPMI-1640培养基(11875-119GIBCO)丙酮酸钠溶液(11360-070GIBCO)青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液(10378-016GIBCO)HAT添加剂(21060-017GIBCO)HT添加剂(11067-030GIBCO)FBS(S1560BWT社)PEG1500(783641ロッシュ)DMS0(D2650SIGMA)96孔培养板(92696TPP)24孔培养板(92424TPP)灭菌培养皿(34153ニプロ)冻结用管(MS-4503住友ベークライト)(6)抗体筛选器材、试剂ELISA微板(442404nunc)抗小鼠IgG标记抗体(1030-04コスモバイオ)单克隆抗体分型试剂盒(1493027ロッシュ)(7)小鼠腹水化、抗体精制BALB/cA小鼠退役雌性(日本クレア株式会社)姥鲛烷(42-002コスモバイオ)HiTrapProteinG(17-0404-03GEヘルスケア)＜方法＞(1)对小鼠的免疫敏化将调整为1.6mg/ml的P30蛋白质和TiterMaxGold进行等量混合，使用玻璃注射器制备乳液。相隔2周分2次向BALB/cA小鼠的皮下给药相当于100μg的抗原，在其1～2周后皮下给药仅P30抗原溶液40μg，3天后，在麻醉下进行全采血，采取脾脏及各种淋巴节。(2)骨髓瘤细胞的培养对于小鼠骨髓瘤细胞(P3U1)，在于RPMI1640培养基中添加了丙酮酸和谷氨酸以及青霉素-链霉素的培养基(RPMI培养基)中加入FBS使其成为10％并进行继代培养。细胞融合使用对数增殖期的形态稳定的物质。(3)细胞融合将从被敏化的小鼠中采取的各淋巴组织在#200网眼上细切，用安装有硅栓的玻璃棒轻轻地按压，一边加入培养基，一边过滤、采取淋巴细胞。通过1200rpm10分钟的离心处理清洗细胞，计数细胞数。将骨髓瘤细胞移至50ml锥形管，计数细胞数，通过1000rpm5分钟的离心处理进行清洗。其后，以淋巴细胞和骨髓瘤细胞的比率成为5:1～10:1的范围的方式调整细胞数并混合，通过进行离心(1200rpm10分钟)而得到细胞沉淀。就细胞融合而言，用1分钟将1ml的PEG液一边缓慢地混合一边加入到细胞沉淀，其后一边搅拌2分钟，一边使其反应。其后，用1分钟加入RPMI1640液1ml，进行3次同样的操作，进一步用3分钟添加12ml的RPMI1640液。在37℃的培养箱中静置10分钟后，通过1000rpm5分钟的离心而采集细胞，并使其悬浮于添加了HAT添加剂的含有15％FBS的RPMI培养基，并接种于10张96孔培养板。此时，作为饲养细胞，使用小鼠胸腺细胞。在CO2培养箱中培养1周，使杂交瘤选择增殖。(4)抗体筛选向ELISA用96孔微板中放入用PBS稀释至1μ/ml的P30蛋白质50μl，在室温下反应2小时或在冷藏下反应一夜，其后，加入0.5％的脱脂牛奶100μl，进行封闭，制成抗原结合板。在细胞融合后的第1周，从各自的培养板无菌地采取培养上清液大约50μl，放入于抗原结合板，在室温下反应1小时。其后，用生理食盐水进行3次的板清洗，接着，使由0.5％脱脂牛奶稀释为2500倍的酶标记抗小鼠IgG抗体在室温下反应1小时。同样地在进行清洗之后，在酶基质液中显色，选择与抗原结合的单克隆抗体阳性孔。(5)克隆对于以ELISA选择的杂交瘤利用有限稀释法进行克隆。即，以每1孔具有1个杂交瘤细胞的方式制备细胞悬浮液并接种于预先接种有饲养细胞的96孔培养板。1周后确认增殖的菌落，进行同样的抗体筛选。进行2次克隆，确认完全为单一的细胞。另外，培养基使用加入有15％FBS和HT添加剂的RPMI培养基。(6)克隆建立、细胞冻结对成为单一细胞的杂交瘤进行从24孔培养板至培养皿的扩大培养，以2～5×108个/管进行冻结保存。冻结培养基使用在含有15％FBS和HT添加剂的RPMI培养基中以成为10％的方式加入DMSO的培养基，将其包入纸巾并保管于-85℃的超低温冷库。(7)亚类测定亚类的测定使用充分地进行了克隆的培养上清液、通过市售的免疫层析法如手册那样进行。(8)小鼠腹水化、抗体精制向在1周以上前腹腔内给药有姥鲛烷0.5ml的BALB/cA退役小鼠的腹腔接种0.5～1×107个的杂交瘤细胞，在大约7～10天后得到贮存的腹水。使腹水充分地凝固，通过3000rpm15分钟的离心处理使固体物沉淀，分离上清液。在上清液中作为防腐剂以0.1％添加叠氮化钠，在冷藏下保存至精制。在来自腹水的抗体精制中，使用HiTrapProteinG柱，在向蛋白质G柱的抗体结合和清洗中使用PBS，在清洗后的抗体溶出中使用0.1M甘氨酸盐酸BufferpH2.8，在溶出的IgG的中和中使用1MTris。溶出的抗体用50％饱和硫酸铵进行浓缩并在PBS中充分地透析，加入0.05％叠氮化钠并进行冷藏保存。在精制抗体的纯度检定中进行醋酸纤维素膜电泳，确认γ区域为单一的带。＜结果＞使用3只小鼠进行了细胞融合实验。其结果，从No.1小鼠中通过1次筛选选择14克隆，从No.2小鼠中通过1次筛选选择1克隆，从No.3小鼠中通过1次筛选选择14克隆。其后，研究非特异性反应或菌落增殖，对合计19克隆进行克隆，建立单克隆抗体产生杂交瘤(克隆#1～#19)。对于所建立的杂交瘤，进行小鼠腹水化，得到2～7ml的腹水。关于得到的腹水，通过醋酸纤维素膜电泳确认抗体含量，其后用HiTrapProteinG精制为IgG。各精制抗体用免疫层析法进行评价。在19克隆中，通过克隆#3和#9的组合可得到良好的结果，可以用于测定体系。就亚类而言，#3、#9均为IgG1κ。杂交瘤克隆#3及#9如以下那样保藏。＜杂交瘤克隆#3＞保藏机构：日本国家技术评价研究所专利微生物保藏中心(邮编292-0818)日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室保藏日：2014年6月23日保藏号：NITEBP-01880＜杂交瘤克隆#9＞保藏机关：日本国家技术评价研究所专利微生物保藏中心(邮编292-0818)日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室保藏日：2014年6月23日保藏号：NITEBP-018812.免疫层析试验设备的制作2-1.标记抗体担载部件的制备鉴于以上的结果，将杂交瘤克隆#3产生的抗P30单克隆抗体(P30-3)用于标记抗体。将抗P30单克隆抗体(P30-3)用5mM磷酸缓冲液(pH7.4)稀释为0.05mg/ml的浓度。在金胶体悬浮液(BBI：平均粒子60nm)0.5ml中加入0.1ml的50mM磷酸缓冲液(pH7.4)并混合之后，进一步加入上述稀释的抗P30单克隆抗体溶液0.1ml，在室温下放置10分钟。在静置后的溶液中加入用10mM磷酸缓冲液进行了稀释的10质量％的牛血清白蛋白(BSA)溶液0.1ml，充分搅拌之后，以8,000xg离心分离15分钟。再次除去上清液，在残渣中加入pH7.4的10mM磷酸缓冲液，用超声波破碎机充分地分散，制成标记抗体溶液。将该标记抗体溶液均匀地添加于宽度16mm×长度100mm的玻璃纤维制垫(ミリポア社制：GFCP203000)之后，用真空干燥机进行干燥，得到标记抗体担载部件。2-2.具备检测部及对照部的硝基纤维素膜载体的制备将与上述2-1的标记抗体不同的抗P30单克隆抗体(杂交瘤克隆#9产生的单克隆抗体P30-9)用含有5质量％的异丙醇的磷酸缓冲液(pH7.4)稀释为1.3mg/ml的浓度，制备为检测部固定用抗体(捕捉抗体)溶液。在距离长度25cm×宽度2.5cm的硝基纤维素膜(ミリポア社制：HF120)的长轴侧的一端(将该端设为展开方向的上游侧端，将相反侧设为下游侧端)1cm的位置使用抗体涂布机(BioDot社制)以1μl/cm的涂布量以线状涂布该检测部固定用抗体溶液。进而，在距离硝基纤维素膜的上游侧端1.5cm的位置以1mg/ml的涂布量以线状涂布抗小鼠IgG抗体。涂布后，在42℃下干燥60分钟，得到具备检测部及对照部的硝基纤维素膜载体。2-3.免疫层析试验设备的制作在上述2-2的硝基纤维素膜载体的抗体涂布面(将该面设为上面)的相反侧(将该面设为下面)上粘接塑料制底板。接着，将上述2-1的标记抗体担载部件以硝基纤维素膜的上游侧端重叠2mm的方式配置并贴附在硝基纤维素膜载体的上面，进一步将宽度5mm×长度23mm的玻璃纤维制样品垫(ポール社制：8000006801)以在标记抗体担载部件的上面重叠2mm的方式配置而贴附。另一方面，将宽度5mm×长度25mm的吸收垫(ポール社制)在硝基纤维素膜载体的上面以硝基纤维素膜载体的下游侧端重叠15mm的方式贴附。最后，沿长轴方向每5mm切断，得到免疫层析试验设备。3.肺炎支原体检测灵敏度的比较使用Chanock培养基将肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia)FH株(ATCC)在37℃下培养7天。将该培养液用作检体，将使用抗P30单克隆抗体的免疫层析法(使用上述免疫层析试验设备)和使用抗P1单克隆抗体的免疫层析法的灵敏度进行比较。使用的单克隆抗体如下所述。另外，后者的方法中使用的试验设备使用抗P1单克隆抗体(P1-4及P1-115：富山研究所)并按照上述的方法制作。＜P30免疫层析法＞标记抗体(金胶体敏化用)：P30-3捕捉抗体(隔膜敏化用)：P30-9＜P1免疫层析法＞标记抗体(金胶体敏化用)：P1-4捕捉抗体(隔膜敏化用)：P1-115将实验结果示于以下的表。[表1]培养稀释倍数P30免疫层析法P1免疫层析法1∶100++++1∶200+++-1∶400++-1∶800+-1∶1600--对照（培养基）--如表所示，使用抗P30单克隆抗体的免疫层析法的检测灵敏度远远地超过使用抗P1单克隆抗体的免疫层析法的检测灵敏度。如上所述，可成功取得具有优异的特性的抗P30单克隆抗体，可以实现与现存的方法相比能够以相当高的灵敏度检测肺炎支原体的免疫层析法。工业实用性本发明提供一种可适用于免疫层析法的抗P30单克隆抗体。根据使用该单克隆抗体的免疫层析法，可以进行肺炎支原体感染的简便、迅速且高灵敏度的检测。该发明并不受上述发明的实施方式及实施例的说明任何限定。不脱离专利权利要求的记载，在本领域技术人员可以容易地想到的范围内各种变形方式也包含在该发明中。在本说明书中明示的论文、公开专利公报及专利公报等内容通过援用而引用其全部的内容。序列表<110>田中贵金属工业株式会社<120>肺炎支原体检测试剂及其用途<130>TY14001P<150>JP2014-155388<151>2014-07-30<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>274<212>PRT<213>肺炎支原体<400>1MetLysLeuProProArgArgLysLeuLysLeuPheLeuLeuAlaTrp151015MetLeuValLeuPheSerAlaLeuIleValLeuAlaThrLeuIleLeu202530ValGlnHisAsnAsnThrGluLeuThrGluValLysSerGluLeuSer354045ProLeuAsnValValLeuHisAlaGluGluAspThrValGlnIleGln505560GlyLysProIleThrGluGlnAlaTrpPheIleProThrValAlaGly65707580CysPheGlyPheSerAlaLeuAlaIleIleLeuGlyLeuAlaIleGly859095LeuProIleValLysArgLysGluLysArgLeuLeuGluGluLysGlu100105110ArgGlnGluGlnLeuAlaGluGlnLeuGlnArgIleSerAlaGlnGln115120125GluGluGlnGlnAlaLeuGluGlnGlnAlaAlaAlaGluAlaHisAla130135140GluAlaGluValGluProAlaProGlnProValProValProProGln145150155160ProGlnValGlnIleAsnPheGlyProArgThrGlyPheProProGln165170175ProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMetAla180185190ProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgProGly195200205MetProProHisProGlyMetAlaProArgProGlyPheProProGln210215220ProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMetAla225230235240ProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgProGly245250255MetGlnProProArgProGlyMetProProGlnProGlyPheProPro260265270LysArg<210>2<211>179<212>PRT<213>肺炎支原体<400>2GlyLeuProIleValLysArgLysGluLysArgLeuLeuGluGluLys151015GluArgGlnGluGlnLeuAlaGluGlnLeuGlnArgIleSerAlaGln202530GlnGluGluGlnGlnAlaLeuGluGlnGlnAlaAlaAlaGluAlaHis354045AlaGluAlaGluValGluProAlaProGlnProValProValProPro505560GlnProGlnValGlnIleAsnPheGlyProArgThrGlyPheProPro65707580GlnProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMet859095AlaProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgPro100105110GlyMetProProHisProGlyMetAlaProArgProGlyPheProPro115120125GlnProGlyMetAlaProArgProGlyMetProProHisProGlyMet130135140AlaProArgProGlyPheProProGlnProGlyMetAlaProArgPro145150155160GlyMetGlnProProArgProGlyMetProProGlnProGlyPhePro165170175ProLysArg<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3aggcatatgggactgccaattgtgaagcg29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4caggtcgacttagcgttttggtggaaaac29当前第1页1 2 3