相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月20日提交的美国临时专利申请号62/039,584的优先权，该文通过引用纳入本文。
发明背景
2种衍生自相同培养物、品系、物种、生物体、器官或组织的细胞可能在基因型、表型或基因表达方式上不同。这种细胞之间的属性变化可能是生物上或医学上感兴趣的。因此，用于操作和询问个体细胞的方法现在广泛用于生物医学研究和药物开发。微流体装置已经适用于单细胞操作，因为它们允许流体，例如，细胞培养基通过具有与这些单细胞相当的尺寸的通道和腔室。在微流体装置中，细胞可经追踪、分选、表征、经过治疗、或裂解以收获它们含有的物质。在这些装置中单细胞的其他操作是可能的。
对细胞一个接着一个通过微流体装置的通路(例如从贮存储器至分析地点)进行计量在技术上有挑战性，部分是因为细胞粘附。这种现象是一些细胞粘附于相邻表面或互相粘附的趋势。细胞粘附受到单个细胞的细胞壁或血浆膜中粘附蛋白质的控制，并且对于体内组织功能和细胞间相互作用是关键的。然而，在微流体装置中，细胞粘附可能导致细胞不希望地固定在通道和腔室的内表面上。为了检测细胞粘附，这些表面可通过化学治疗或应用微观纹理来钝化。表面钝化可能是昂贵的，并且给定的治疗可能仅在小范围的实验条件下有作用。或者，可通过向细胞施加力或改变其化学环境来逆转细胞在微流体表面上的固定。除非温和进行，这些动作可能扰乱将在下游测量的细胞性质，或者改变待从细胞收获的生物分子的组分。
技术实现要素：
本文提供了将多个细胞运输通过流动腔室的方法，其中细胞初始固定在流动腔室的内表面上。所述方法包括：从流动腔室的内表面选择性释放细胞；并且使液体流动通过流动腔室使得释放的细胞随着液体运行，从而运输细胞通过流动腔室。
在一些实施方式中，该方法还包括在选择性释放细胞之前，将细胞固定在流动腔室的内表面上。固定细胞可包括施加捕集势(trappingpotential)。选择性释放细胞可包括移去该捕集势。
在该方法的一些实施方式中，选择性释放细胞包括施加捕集势。
在一些实施方式中，流动腔室的内表面包括电极并且捕集势从电场梯度产生。该捕集势可产生自介电电泳。电极可以是光电导的并且可通过光电镊子(tweezer)提供捕集势。
在一些实施方式中，捕集势产生自光场梯度。可通过聚焦激光束、光镊子或全息光镊子来提供这种捕集势。
在该方法的一些实施方式中，流动腔室的内表面包括光催化材料，并且选择性释放细胞包括照射该表面。在这些实施方式中，选择性释放细胞也可包括在表面附近诱导ph变化或生成羟基。流动腔室的内表面也可包括含有ph-敏感性或者可与羟基有反应性的试剂的基质层。光催化材料可以是二氧化钛。
在该方法的一些实施方式中，细胞是粘附的。在一些实施方式中，细胞是非粘附的。在一些实施方式中，细胞一次释放一个。在一些实施方式中，同时释放多个细胞中的至多2、5或10个细胞。
在该方法的一些实施方式中，流动腔室包括出口，该液体流向出口，并且释放的细胞一次一个到达出口。在一些实施方式中，流动腔室包括出口，该液体流向出口，并且至多2、5或10个释放的细胞同时到达出口。
在一些实施方式中，流动腔室的内表面是透明的。
在一些实施方式中，该方法还包括检测来自固定在流动腔室的内表面上的一个或多个细胞的信号，其中该细胞基于信号从流动腔室的内表面上选择性释放。该信号可反映一个或多个细胞的细胞周期阶段、活力、或细胞类型。该信号可反映一个或多个细胞中的基因表达。
发明详述
i.综述
入射到流动腔室，如微流体通道上的光可与液体流联用以计量单个细胞通过腔室。通过下述的机制，光可通过将单个细胞固定在腔室表面上或使它们离开该表面来介导它们在腔室中的迁移。光强度或其他参数的变化可从表面上选择性释放细胞并进入平行移向该表面的流体流中。然后细胞可被运载到下游，其中可一次一个或以所需的分组对它们进行分析或观察。由于施加光的结果，细胞经受的力或化学处理是温和的并且最小化对细胞生理的扰乱。从流动腔室的表面上选择性释放细胞可基于在细胞固定在表面上时从它们检测到的信号。
ii.定义
“计量”是指用于控制物体进入液体流或物体在液体流中悬浮时通过结构的手段。计量可涉及例如物体进入流体流的时间或顺序，物体之间的分离，或在一段时间内通过结构中的点的物体的数量。
“固定”是指向物体施加外力，从而限制物体可能作出的运动程度或速率。外力可以是例如，捕集势或流体拖曳力。外力也可以是作用在物体上的回复力、粘附力和/或拉力，如果其锚定于另一个物体，如表面。固定的物体的运动程度或速率可相对于没有外力的情况下中的参数降低。
“选择性释放”是指降低、移去或抵消固定特定物体或物体组的外力同时不显著改变固定其他物体的外力。
“流动腔室”是指一种结构，其中可留下细胞和液体介质，并且细胞和介质可流动通过。该术语包括微流体通道和腔室、显微流动池、血细胞计数器、以及用于观察和分析细胞的类似结构。“内表面”是指(i)物理上由玻璃或其他固体材料与流动腔室的外部空间分离，并且(ii)与细胞和液体介质接触的流动腔室的表面。
“捕集势”是指将物体限制或拉至特定空间区域的力场。当限制到该区域时，该物体被称为“捕集的”。
“介电电泳”是指，当介电颗粒位于不均匀电场中时，施加在该颗粒上的力，和由该力导致的任何运动。
“光电子镊子”或等同的“oet”是指使用介电电泳操纵介电颗粒的系统。该系统包括多个电极，其中的至少一个是光敏的。当在多个电极中的电极之间施加交流电偏压(a.c.bias)并且光入射到光敏电极上时，可在该多个电极中的电极之间生成非均匀电场。
“光阱”是指与聚焦的激光束相关的捕集势。
iii.方法
本发明的方法将多个细胞运输通过流动腔室，其中细胞初始固定在流动腔室的内表面上。该方法包括从流动腔室的内表面选择性释放细胞，并且使液体流过流动腔室使得释放的细胞与液体一起运行的步骤。
该细胞可初始通过任何可行机制固定在流动腔室内。例如，该细胞可通过表面和细胞上的部分之间的静电、范德华力、疏水性或亲水性相互作用粘贴或粘附在流动腔室的内表面。可由细胞表面上的蛋白质、糖蛋白、糖、或脂质，或其任意组合介导固定。在一些实施方式中，固定可在细胞保留或通过流动腔室并与腔室的表面相互作用时随机发生。如果需要，流动腔室内的特定表面可设置成诱导通过细胞的固定，如用细胞对其有亲和性的化学官能团或纹理。可用于该目的的表面微成像技术综述于，例如，kane等，biomaterials20：2363-2376(1999)和el-ali等，nature442：403-411(2006)。固定机制可针对某些细胞类型或细胞表面不同有特异性，或者在另一方面可针对许多细胞类型无特异性且通用。
该方法可包括在选择性释放细胞之前将该细胞固定在表面上的步骤。该步骤可包括使细胞悬液流动通过流动腔室并且允许发生随机固定，如表面粘贴或粘附。或者，该步骤可包括主动诱导固定。例如，化学物可被导入流动腔室以交联流动腔室和细胞表面上的部分。又例如，可以针对细胞表面的蛋白质的配体或光脉冲的形式向细胞施加外部刺激以加速与细胞粘附相关的生理过程。可使用任意所需过程来固定细胞。细胞可在固定期间浸没到液体介质中并且在选择性释放期间保持浸没并运输通过流动腔室。
在一些实施方式中，由于施加捕集势，细胞被初步固定。该势可限制细胞至流动腔室表面附近或与其重合，使得需要力来将细胞从该区域中移去。捕集势优选足够大，使得将细胞从所需区域移去所需的力超过施加势时细胞可能经受的任何其他力。这类其他力包括，例如，从细胞周围的流体流动产生的拖曳力。捕集势可施加足够的时间使细胞粘附或粘贴表面，或直至需要选择性释放细胞之时。捕集势可产生自电场梯度或光场梯度，例如，并且可产生自入射到流动腔室上的光。
在一些实施方式中，捕集势产生自介电电泳。可通过将2个或更多个电极施加在流动腔室内或与之相邻并且在它们之间导入非均匀电场来施加势。优选地，电极之一位于流动腔室表面上，并且介电电泳向该电极拖曳细胞。在细胞暴露于电场之后，在细胞中诱导偶极，并且介电电泳力由于该偶极和电场梯度之间的偶联而作用于细胞上。介电电泳力的幅度和方向取决于细胞的尺寸、渗透性、和可极化性、细胞浸没的介质的可极化性、电场频率、和其他因素。因此，相同的电极可在不同条件下吸引或排斥特定细胞。任何电极，包括固定金属电极或二维电极阵列，可用于生成电场，虽然优选一个电极是光电导的，如下文所述。
在一些实施方式中，光电子镊子(oet)可用于提供介电电泳捕集势。oet技术在例如chiou等，nature436：370-372(2005)；ohta等，ieeejournalofselectedtopicsinquantumelectronics13：235-243(2007)；wu，naturephotonics5：322-324(2011)；和wo2010/115167a2中详细描述。所有这些文献以参考的方式并入本文中。简言之，将光电导电极(在一些情况中包括光电晶体管)和透明电极置于流动腔室的相反侧并且在它们之间施加交流电偏压。光，例如，来自发光二极管的非相干光，然后导到光电导电极上，并且在透明电极和该电极的照射区域之间生成不均匀电场。可使用数字微镜装置(dmd)微显示器来生成任意形状的图案化图像，例如，圆圈或方形，其可用光源透射到光电导电极上。因此，非均匀电场的形状，和由此的捕集势可反映该图像的形状。通过对dmd微显示进行重编程，该图像可动态重新定形以一致地操纵多个细胞。例如，该细胞可被驱赶或移动穿过流动腔室的表面，或者一个细胞可被释放而其他细胞保持固定。另外，可基于其可极化性和克劳休斯-莫索缔因子(clausius-mossottifactor)的偏差区分不同类型的细胞，和不同生理状态的细胞(例如，活和死)。
在一些实施方式中，捕集势产生自光场梯度。可通过入射到流动腔室上并且各自用高数值孔径物镜紧密聚焦的一个或多个激光束来提供这种捕集势。捕集势被称为光学阱。各光束可在聚焦处捕集细胞，部分由于细胞散射和激光折射。激光光学元件和流动腔室可设置成将激光束的焦点置于流动腔室表面附近。因此，当打开激光时，捕集势可将细胞抓出流动腔室中的水性介质并将其固定到表面上。一旦与表面接触，该细胞可粘贴或粘附于该表面，使得同时通过细胞与表面之间的相互作用和捕集势来限制细胞的运动。
光学阱的物理和各种实施方式描述于，例如，neuman和block，reviewofscientificinstruments75：2787-2809(2004)，和grier，nature424：21-27(2003)。使用光学阱来固定在溶液中悬浮的颗粒的方法描述于题为“杂交单分子成像分选器”的共同待审的共同转让的美国专利申请号13/340,504。这些文献通过引用纳入本文。
在本发明的方法中，2个或更多个统称为光学镊子的光学阱可用于独立或一致地操纵流动腔室中的多个细胞。例如，可关闭一个阱使细胞流走，同时可打开另一个阱来固定细胞。或者，可使用2个阱来将2个细胞推向对方或相同方向。单激光束可产生2个或更多个光学阱，例如，通过正交极化将束分成2个路径。该路径可使用镜、透镜、光学调制器、光学偏转器、电机械装置和/或挡板独立地引导和调整。也可使用衍射光学元件或通过从多个位置中的一个或多个激光束对光分时产生光学阱的多重阵列，称为全息光学镊子。本文使用的光学阱可具有任何所需形状或模式结构。也可根据需要控制阱。例如，可通过计算机控制用于生成阱的光学元件，并且可使用照相机或显微镜来监测流动腔室以追踪细胞并且提供用于控制阱的输入。
任意本文所述的捕集势可用于选择性释放以及固定流动腔室的内表面上的细胞。在一些情况中，如当细胞非粘附时，可简单通过移去捕集势从内表面选择性释放细胞。在没有捕集势的情况下，由于布朗运动或液体流动，在细胞和内表面之间保留的任何相互作用可弱于作用于细胞上的力。因此，这些相互作用可被自发打破，并且可将细胞从其捕获的位置处运出并通过流动腔室。当使用光电子镊子提供捕集势时，可通过关闭入射到光电导电极上的光来去除势，从而去除流动腔室内的不均匀电场。或者，透射到光电导电极上的图像可重新成形，使得非均匀电场不再捕获待释放的细胞。当使用一种或多种光学阱形式的激光束提供捕集势时，可通过阻断激光或引导其远离细胞来去除特定细胞周围的势。
也可通过施加捕集势来选择性释放流动腔室表面上固定的细胞，使得该细胞从表面上拖走。当细胞粘贴或粘附表面时，可使用这种释放机制，使得移去用于固定的任何捕集势不足以实现释放。如果需要，针对选择性释放，可在之后使用相同类型的用于固定的捕集势。例如，在oet的情况中，可改变电场频率，使得作用于细胞上的力的方向被逆转。因此，初始被拉向光电导电极的细胞(在“正oet”下)可相反被排斥(在“负oet”下)，并且推离该电极最接近的表面。在光学捕集的情况中，可改变激光束和流动腔室的相对位置，使得光束聚焦移离表面并且移向流动腔室内部。因此，拉掉固定于表面的细胞并插入通过流动腔室的流体流。一旦细胞从表面上解放，可阻断激光束。
设置用于固定和选择性释放的捕集势可以是方便且直接的，并且提供了以高度精确性和控制来操纵单个细胞的方式。然而，会认识到使用捕集势选择性释放细胞不需要通过用相同的捕集势固定该细胞来进行，或完全不需要捕集势来进行。例如，细胞可通过非特异性相互作用或细胞粘附固定在流动腔室的表面上，然后在所需的时间上使用负oet来选择性释放。一般而言，可以任意所需顺序打开或关闭或重新设置本发明的方法使用的捕集势以固定和释放细胞。
可通过以任意方向向该细胞施加力使用捕集势来固定或选择性释放细胞。例如，捕集势可以与细胞固定的表面平行的方向，以及(或者)与该表面垂直的方向上向细胞施加力。用于介电电泳的电极，包括至少一个光敏电极，可互相相邻铺设或集成在流动腔室的内表面上。照射该表面同时在电极之间施加交流电偏压产生与该表面平行的产生，其可向电极附近固定的细胞上施加横向力。用于该过程的系统被称为横向场光电子镊子(loet)，并且在ohta等，ieeejournalofselectedtopicsinquantumelectronics13：235-243(2007)和他处中详细描述。可使用光学阱通过将该阱置于细胞附近或刚好离开流动腔室的表面来向固定的细胞施加横向力。
在本发明方法的一些实施方式中，使用光催化选择性释放细胞，这种现象综述于linsebigler等，chemicalreviews95：735-758(1995)和他处。该细胞首先使用任何所需机制或过程固定在含有光催化材料的流动腔室的内表面上。光催化材料的非限制性示例是二氧化钛(tio2)。为了释放感兴趣的细胞，用短波(即，蓝或近紫外)光照射这些细胞附近的表面部分。合适的波长包括例如388nm或418nm，虽然技术人员将认识到超过400nm的波长对细胞产生较少的损伤。优选地，当内表面出现在流动腔室的壁上时，入射光来源于相对于内表面的壁的相反侧。因此，光在击打光催化材料之前没有通过细胞，并且降低了因直接接触光导致的对细胞的损伤。
短波长光激活了光催化材料，其在感兴趣细胞和表面附近释放羟基和质子。释放的物质可反应并破坏将细胞锚定至表面的化学部分，导致细胞脱离。在一些情况中，光催化材料的激活和细胞脱离伴随着ph变化。流动腔室的内表面也可包括含有ph-敏感性或者可与羟基有反应性的试剂的基质层，并且可通过二次反应破坏锚定部分。光源优选是准直的，并且当射入流动腔室的内表面上时对着该表面的小面积。因此，一次只有少量的细胞暴露于光源，并且通过将光源靶向或扫过感兴趣的细胞来实现选择性释放。
在一些实施方式中，也可使用光催化来选择性杀死细胞。可通过暴露于由激活的光催化材料释放的羟基或这些基团的二次反应的副产物而杀死细胞。细胞可同时杀死并释放，或者出于区分感兴趣细胞和不感兴趣细胞的目的杀死。将认识到需要选择性释放和/或杀死固定的细胞的条件取决于光催化材料、任何基质层、细胞本身、和固定模式的特性。
本发明的方法可使用任何细胞类型。该细胞可以是例如，原核、真核、植物、动物、哺乳动物或人。细胞可以是粘附的或非粘附的。将认识到不同的细胞类型对于操作、培养和接种而言有不同要求，并且可固定在表面上并随后在不同条件下释放。例如，不同细胞类型显示出宽范围的电可极化性，将光反射到不同角度，并且对于流体剪切力和羟基有不同敏感性。因此，本发明方法的详细内容取决于运输通过流动腔室的细胞类型。在一些实施方式中，来自多个细胞的所有细胞衍生自相同的物种、个体、器官、或组织。
在本发明的方法中，可使用任何流体，其允许在流动腔室中固定和选择性释放细胞，并且以下游分析所需的生理状态递送细胞。可使用的流体的示例包括水、盐水、缓冲液、细胞生长或培养基、血浆、或血清。在一些实施方式中，液体经选择与流动腔室中的细胞大致等渗以防止膨胀或收缩。当以电场梯度提供捕集势以固定或选择性释放细胞时，可选择流动腔室中的液体以具有相对于细胞质的所需电导率。例如，液体可含有不带电的渗透物(例如，蔗糖和右旋糖)并且具有比大部分细胞类型低的电导率，使得可使用正oet操纵该细胞。
细胞可在固定、选择性释放和运输通过流动腔室期间浸入相同液体，或者可在不同步骤使用不同液体。例如，当细胞固定在流动腔室表面上时，在选择性释放细胞之前可用新液体置换流动腔室的表面上存在的液体。这种新液体可进而用流过流动腔室以运输释放的细胞的液体置换。因此，使液体流过流动腔室可包括置换或“追加”之前释放的细胞悬液。然而，在其他实施方式中，同时发生选择性释放和流动。液体可根据流动腔室构造的适合和需要导入、移出、和流过流动腔室。
细胞从流动腔室的表面选择性释放可利用上述的任意机制，并且可根据需要计量。例如，细胞可一次释放一个或分组释放。在一些实施方式中，同时释放多个细胞中的至多2、5或10个细胞。可与液体流速一起设置释放时间以实现运输通过流体腔室的细胞的所需频率。在一些实施方式中，频率保持得足够低以使细胞在下游单独观察或分析，并且检测细胞间的差异。在细胞已经运输通过流动腔室并离开流动腔室之后可根据需要处理它们。例如，可用药物裂解、处理，或任选地询问细胞。
流动腔室可以是较大液体操作系统的部分，如微流体装置或流式细胞仪。在一些实施方式中，流动腔室包括内表面下游的出口，所述内表面上固定细胞。液体流过流动腔室并且流向出口，并且将从表面选择性释放的细胞运输至出口。可计量细胞的选择性释放，使得释放的细胞一次一个到达出口。或者，可进行计量，使得至多2、5或10个细胞同时到达出口。
流动腔室可具有任何需要的几何形状或尺寸，并且可由任何方便的材料制成。在一些实施方式中，多个细胞初始固定的内表面，或流动腔室的相反侧上的表面，是透明的。当以光学阱施加捕集势时，需要至少一个透明表面使激光透过流动腔室。透明表面一般也可用于本发明的方法中用于观察固定的细胞。可使用这种观察来选择释放的细胞或确定细胞在表面上的位置，使得可恰当引导用于生成捕集势或诱导光催化的光。任意合适设备，包括但不限于显微镜、照相机、检测器或图像处理器可与流动腔室偶联以便于对表面上细胞的观察。
可使用任何基础或标准来选择释放的细胞。例如，可从表面释放大于特定尺寸的细胞并且可保留较小的细胞。因此可释放初始固定在表面上的所有细胞，或根据需要仅释放亚组。也可以任意顺序释放细胞。例如，确定缺少感兴趣性质的细胞可首先释放并且设置在下游，并且然后具有该性质的细胞可释放并另外分析。或者，确定为最感兴趣的细胞可首先释放，较不感兴趣的细胞之后释放或完全不释放，取决于首先释放的细胞的下游分析结果。
在一些实施方式中，本发明还包括检测来自固定在流动腔室的内表面上的一个或多个细胞的信号，并且基于该信号选择性释放细胞的步骤。该信号可产生自荧光或颜色标签，例如，并且可产生自结合至细胞表面的标签。或者，信号可产生自染料对细胞脂膜的渗透并且反映了膜的完整性。可从单个细胞检测到的其他类型的信号将对于本领域技术人员而言是显而易见的。在各种实施方式中，信号反映了一个或多个细胞的细胞周期阶段、活力、或细胞类型，或一个或多个细胞中的基因表达。可使用任何方便的过程和设备从固定的细胞检测信号。根据需要，这些信号可与释放细胞的装置偶联，如用于施加捕集势或诱导光催化的光源，并且可用于自动化释放。
iv.系统
本文还提供了用于进行上述方法的系统。系统可包括流动腔室以及对于将细胞固定在流动腔室的内表面上、从该表面选择性释放细胞、和使液体流过流动腔室以运输释放的细胞所需或方便的任何装置。这些装置可包括光源和光敏材料(例如，电极)，如上所述，用于施加捕集势或诱导光催化，加上任何相关的光学元件、电子元件、能源、控制器、处理器、硬件、或软件。该系统也可包括与流动腔室连接的液体操作组件，和用于当细胞固定在流动腔室中时或在选择性释放之后观察、分析或检测来自细胞的信号的设备。如果需要，光源和设备可操作地偶联，并且用于固定和选择性释放细胞的过程可自动化。在阅读上述公开之后，本申请范围内的系统的其他特征和着力点将显而易见。
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可获得本发明的多种修改形式和变化形式而不背离本发明的精神和范围，这对于本领域技术人员而言是显见的。本文所述的的具体实施方式仅起示例作用，且不意于构成任何方式的限制。本说明书和实施例应仅视为示例性的，本发明真正的范围和精神由所附权利要求书来说明。