一种肉质评定的代谢组学方法与流程

本发明属于代谢组学技术领域。具体涉及一种肉质评定的代谢组学方法。

背景技术：
我国人均肉的食用量从1978年的9公斤增至2014年的66公斤，增加了7倍以上。2014年我国猪肉总产量达5671万吨，占肉类总产量的65％，占全球猪肉总产量的50％左右，为国民经济增长和人民生活水平的提高做出了重要贡献。经过畜牧业30多年的蓬勃发展，我国在猪肉供应方面基本解决了吃肉难的问题。但随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉品质的要求越来越高，养猪业经历着从数量增长向数量和质量并重发展的转变。然而，长期以来对“快长”和“高产”的盲目追求导致猪肉品质的显著下降。系水力降低，嫩度、风味下降，严重影响冷鲜肉的货架期以及肉的加工性能，不仅引起广大消费者的抱怨，还造成巨大的经济损失。目前我国猪肉出口占总产量的比重不到3％，而且猪肉进口量远远超过出口量，这与世界第一养猪大国的地位极不相称。由此，在保障猪肉数量稳步增加的同时，提高猪肉品质，是满足人民日益增长的对优质猪肉的需求、增强我国猪肉产品在国际市场的竞争力和确保养猪业可持续发展的关键。与肉质相关的成分分析研究中，最为普遍的方法是氨基酸和短链脂肪酸的检测方法。由于进行氨基酸检测时，需要高温(110℃)和强酸条件下消解2，无法保留肌肉代谢物的原貌，比如肌糖原。特别是长链、中链和短链脂肪酸，而脂肪酸的检测方法也不能同时检测氨基酸等其他的代谢物。在肉质的评定中，甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸是十分重要的风味物质。随着代谢组学研究的不断深入和研究领域的不断拓展，组织代谢组学研究也成为了目前代谢组学的热点应用领域之一。代谢组的研究方法，不仅可以对肌肉中肌酸和氨基酸等主要组成成分进行表征，也能对肌间脂肪中含有的短链脂肪酸等风味物质进行表征，还能对影响肉质的乳酸等物质进行表征。通过代谢组学的方法对肉质进行评定，一方面可以对代谢物进行定性定量，另一方面，也为肉质的指纹图谱建立提供了新的可利用途径。目前关于肉质代谢组的研究刚刚起步，尚有诸多方法学问题有待解决。一方面，肉质的评定的指标很多，传统指标包括肉色、肌肉系水力、风味、肌肉pH值、滴水损失、大理石纹、嫩度、风味、多汁性等，肌肉代谢组学分析结果与这些传统指标之间是什么样的关系？代谢物是否能够提取完全就会对代谢组学技术用于肉质评定产生较大的影响，这就要找到适用于肉质代谢组学分析的提取方法。另一方面，还要建立不同部位和不同等级肉质的代谢组学指纹图谱。这需要找到适合于不同部位和不同肉质等级的肌肉进行提取的方法。由于代谢组学分析需要保持代谢物的原貌而且力图检测到尽量多的代谢物，这就需要对目前存在的提取方法进行筛选和优化，避免过于剧烈(高温、强酸、强碱等)、操作过于繁琐和提取效率较低的提取方法，进而找到适合于肉质评定代谢组学分析的提取方法。所以，对于基于NMR的代谢组学研究中，找到针对于肉质分析的提取方法是十分必要的。现有陆宽等采用的肌肉中氨基酸提取方法。具体方法如下：称取新鲜鸡肉0.5g置于安培瓶中，加入6mol/L盐酸10ml后混匀，密封。110℃消化24h，采用去离子水定容至10mL，吸取1mL于5mL容量瓶内，40-50℃真空干燥，残留物用1mL水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用pH值2.2的缓冲液1mL溶解，经0.25m微孔滤膜过滤，用L-8800型全自动氨基酸分析仪测定16种氨基酸(Phe、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val、Met、Leu、Ile、Tyr、Asp、His、Lys和Arg)的含量，然后乘以稀释倍数换算成肉中氨基酸的含量。但采用浓盐酸高温消解肌肉中蛋白质和氨基酸，具有耗时，环境污染大等缺点。现有肉和肉制品脂肪酸提取方法。郭建凤等取肌肉样品100g，置于50mL烧瓶中，加入2％氢氧化钠甲醇溶液4mL，然后将冷凝管固定于烧瓶上，水浴上回流，直至没有脂肪滴下。再加15％三氟化硼甲醇溶液5mL到沸腾的溶液中，加庚烷2mL，继续沸腾1min后，停止加热。冷却至室温后，移去冷凝管，加入少量饱和氯化钠溶液并轻摇烧瓶数次，继续加入饱和氯化钠溶液至烧瓶颈部。吸取上层庚烷溶液约1mL于试管中，加适量无水硫酸钠脱水。此溶液含脂肪酸甲酯约100mg/mL，取0.1mL立即采用气相色谱仪(VARIANCP-3800，美国)测定脂肪酸甲酯的浓度，最后经过换算得到棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸浓度。但采用三氟化硼和甲醇提取脂肪酸，操作较为繁琐，具有毒性大、耗时较长，环境污染大等缺点。虽然可以同时测定棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的浓度，但不能同时检测甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸，也不能同时检测氨基酸以及其他的化合物。现有技术包括氨基酸提取工艺、脂肪酸提取工艺等，提取操作程序复杂，耗时较长，由于使用大量有毒试剂和有机溶剂，成本高，环境污染较大，也无法实现肌肉所有组分的同时检测。

技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种肉质评定的代谢组学方法。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述肉质评定的代谢组学方法包括如下步骤：(1)将肉样品加入提取溶液中，液氮速冻后超声处理，解冻后进行肉样品破碎，得破碎后的肉样品；将破碎后的肉样品再重复进行液氮速冻、超声处理、解冻和破碎过程，重复1—5次，优选3次，得肉样品液；所述肉样品与提取溶液的质量体积比为(2—20):1，质量体积比中质量单位为g，体积单位为mL；所述提取溶液为氯仿、乙腈和水的混合液，乙腈和水的混合液，氯仿、甲醇和水的混合液，或者甲醇和水的混合液中的一种；所述氯仿、乙腈和水的混合液中，氯仿、乙腈和水的体积比为1:(0.8—1.2):(0.8—1.2)；所述乙腈和水的混合液中，乙腈和水的体积比为1:(0.8—1.2)；所述氯仿、甲醇和水的混合液中，氯仿、甲醇和水的体积比为1:(0.8—1.2):(0.8—1.2)；所述甲醇和水的混合液中，甲醇和水的体积比为1:(0.8—1.2)；(2)收集肉样品液中的水相，将水相于液氮速冻、干燥后，与磷酸盐缓冲液混合，然后离心，取上清液进行核磁共振检测或高效液相-质谱联用检测，以评定肉质；所述磷酸盐缓冲液体积与水相被收集初始体积之比为1：(0.4—0.7)。优选地，步骤(1)中所述氯仿、乙腈和水的混合液中，氯仿、乙腈和水的体积比为1:1:1；所述乙腈和水的混合液中，乙腈和水的体积比为1:1；所述氯仿、甲醇和水的混合液中，氯仿、甲醇和水的体积比为1:1:1；所述甲醇和水的混合液中，甲醇和水的体积比为1:1。优选地，步骤(1)中所述提取溶液为氯仿、乙腈和水的混合液。优选地，步骤(1)中所述肉样品与提取溶液的质量体积比为10:1。优选地，步骤(1)中超声处理条件为20—22KHz，2—5min。优选地，步骤(2)所述磷酸盐缓冲液(pH值7.0—8.0，优选pH值7.6；0.005—0.1％TSP，优选0.01％TSP；10—100％重水，优选100％重水)浓度为0.1M或1M。本发明所述的核磁共振检测为常规方法。本发明采用氯仿、乙腈和水混合液提取，采用核磁共振分析的代谢组学新方法，不仅保证了肉质代谢物组成的原貌，将核磁谱峰漂移减小到最低程度，提高了核磁谱图的质量，同时简化了提取工艺流程，并通过代谢组学分析很好对不同肉质进行了区分。可检测代谢物42种，其中氨基酸19种，短链脂肪酸3种，味觉相关代代谢物7种，三羧酸循环代谢物5种，脂质代谢物8种。整个提取过程仅需24h，谱峰漂移受pH值影响很小。采用此提取方法，对背最长肌、腰大肌和股大肌的组成进行了全谱分析，很好地进行了代谢组学区分，建立了相应的代谢指纹图谱。采用主成分分析技术，对不同肉质进行了很好的区分，该提取方法不仅提高了代谢物的提取率，提高了核磁谱图的质量，而且简化了提取流程，实现了肉质的代谢组学评定。总之，本发明为了在既保证肌肉代谢物提取率的前提下，又最大程度的简化提取工艺，降低提取成本。本发明采用氯仿、乙腈和水混合液的提取法替代盐酸消解和脂肪酸提取法，同时简化提取流程，尽量减少操作对实验结果的影响，保持肌肉代谢物组成的原貌。并在样品冻干后采用磷酸缓冲液溶解后进行核磁共振测定，以保证核磁谱峰漂移最小，最终达到既保证水溶性代谢物的提取效率最高，又能够很好对不同肉质进行区分，为肉质的评定提供一种新的代谢组学分析方案。附图说明图1为NMR谱积分后主成分分析的得分图(pH值7.0(■）、7.2(▲)、7.4(●)、7.6(◇)、7.8(○)、8.0(□))，从三维空间的分布来看，pH值从7.0到8.0，在7.4、7.6和7.8出现了明显的聚类；图2为提取磷酸盐缓冲液中重水含量为5％、10％、50％和100％的压水峰核磁谱图(1为5％重水，2为10％重水，3为50％重水，4为100％重水)；图3为提取缓冲液中TSP浓度为0.01％、0.05％和0.1％的谱峰；图4为猪背最长肌一维NMR标准图谱，检测到代谢物包括：1，Isoleucine；2，Leucine；3，Valine；4，Lysine；5，Alanine；6，Arginine；7，Methionine；8，Glutamate；9，Glutamine；10，Proline；11，Threonine；12，Glycine；13，Tyrosine；14，1-methylhistidine；15，Phenylalanine；16，Creatine；17，Creatinine；18，Lactate；19，Pyruvate；20，Succinate；21，Fumarate；22，β-Glucose；23，α-Glucose；24，Acetate；25，β-Hydroxyisobutyrate；26，Formate；27，Trimethylamine；28，TMAO；29，myo-Inositol；30，Histidine；31，Choline；32，GPC；33，Lipids(triglyceridesandfattyacids)；34，Unsaturatedlipids；35，LDL；36，VLDL；37，Dimethylamine；38，Albumin；39，α-Ketoglutarate；40，Aspartate；41，Guanine；42，Adenosine；图5为猪背最长肌(■)、腰大肌(▲)和股大肌(●)代谢组分析的得分图。具体实施方式1实验方法1.1肉样品猪背最长肌、腰大肌、股大肌1.2实验设备分析天平(SartoriusBS110S)，德国Sartorius公司；微量加样器，美国Thermo公司；酸度计(HANNApH211型)，意大利HANNA公司；漩涡振荡器(SI-Vortex-Genie2型)，美国ScientificIndustries公司；低温冷冻大容量离心机(AnkeDL-4000B型)，上海安亭科学仪器厂；超低温冰箱(SANYOUltralowfreezer)，日本SANYO公司；BrukerAvanceDRX-600高分辨核磁共振谱仪，德国BrukerBiospin公司。1.3本发明样品提取方法如下：称量新鲜(或-80℃冷冻储存后解冻)的肉样0.1g，加入到2mL离心管中，加入氯仿、乙腈和水(1：1：1)混合溶液1mL，液氮速冻后，超声(20KHz，2min)，解冻后，置于组织破碎仪中(20Hz，30s)，如此反复冻融、超声和破碎处理3个循环。分别收集水相和油相至2mL离心管中，水相采用液氮速冻后，置于冷冻干燥机(-40℃)12h，在冻干的离心管中加入0.1M磷酸盐缓冲液(pH值7.6，0.01％TSP，100％重水)1.0mL。最后，4℃，12000rpm离心10min，取上清液0.8mL加入5mm核磁管经核磁共振检测。1.4本发明核磁共振检测方法如下：在BrukerAvanceDRX-600高分辨核磁共振谱仪(BrukerBiospin,Rheinstetten,Germany)上进行NMR检测，1H频率为600.11MHz，配备三共振高分辨探头。采样温度为298K，采样次数为128次，谱宽20ppm。每个样品采样前控温至少5分钟，每个样品的90°脉冲宽度调整为10μs左右，等待时间(Recycledelay，RD)为2s(期间进行预饱和压水)。每个样品分别进行预饱和压水峰的NOESYPR1D(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)实验，其中脉冲延迟时间t1为3μs，混合时间tm为100ms，在tm和弛豫延迟期间进行预饱和压水。采用Amix(V3.9.15,BrukerBiospin,Germany)软件对肉提取液的1HNOESY谱进行自动积分。为了消除残余水峰对分析造成的影响，将水峰所在的δ4.55-5.16区间的积分值去掉。将NMR谱的δ0.5-4.55和δ5.16-8.5ppm区间的积分值进行归一化处理(每个区间的积分值与总积分值的比值)，积分间隔0.002ppm。随后将归一化的数据导入SIMCA-P+11.0软件包(Umetrics,Sweden)进行多变量分析。首先通过主成分分析法对样品的群体聚类情况进行分析，PCA结果用得分图来表示。1.5pH值对肉中主要代谢物化学位移的影响评价采用TopSpin3.2软件观察并记录肉提取液中的主要代谢物，如，氨基酸类(亮氨酸、丙氨酸、组氨酸、甘氨酸等)、有机酸(甲酸、乙酸、丁酸和乳酸等)、葡萄糖(α-葡萄糖和β-葡萄糖)的化学位移，研究它们随着pH变化时的变化幅度。PCA的得分图如图1所示，由于培养上清的成分基本一致，导致样品之间的不同聚类主要来至pH值的变化，样品点之间的距离也就代表了pH值对肉提取物中代谢物化学位移的影响，距离近则影响小，距离远则影响大。从图1中可知，随着pH值从7.0变化到8.0，样品在得分图的PC1维、PC2维和PC3维表现为分布的连续变化。如果以得分图上点的距离代表pH值对代谢物化学位移的影响，则可发现如下变化：从pH值7.0到pH值7.4，样品点分布的变化较大，而从pH值7.4到pH值7.8，则变化相对较小。而且，在得分图上明显出现一个聚类，即pH值7.4到pH值7.8(如图1所示，●、◇和○所在的聚类)。这可能与肉组成中主要以氨基酸和有机酸等偏酸性化合物为主有关，偏酸性化合物在中性和碱性环境中，其核磁波谱化学位移会比较稳定。因此，本方法中所述的磷酸盐缓冲液pH值条件为7.0-8.0，更优选7.6。1.6不同提取方法之间的提取效率比较1.6.1提取溶液与样品比例的优化由于提取溶液与肉样的比例越大，提取代谢物的效率会越高，但是会增加提取液的体积从而影响冷冻干燥的时间，也会影响批量操作的便利性和导致试剂的浪费。通过比较实际批量操作过程中的速度和便利性(提取溶液与肉比例为20：1、10：1、5：1和2：1)之间的信噪比。结果表明，提取溶液与肉比例最优为10：1。1.6.2提取溶液组成的优化(见表1)常见组织提取液为氯仿、乙腈和水的混合物或者氯仿、甲醇和水的混合物。在溶液与样品比例为10：1的基础上，进一步优化提取溶液的组成。去除谱图中的4.55-5.16ppm水峰后，以0.002ppm的积分区间采用Amix(Bruker,Germany)软件对压水的NOESY1H谱的8.5-5.16ppm和4.55-0.5ppm以进行自动积分(绝对值)，并以TSP的积分值(0.018ppm至-0.018ppm)为1进行归一化，以不同混合提取溶液的归一化积分值之和评价提取效率。不同混合提取溶液的产量如表1所示，氯仿、乙腈和水(1：1：1)的产量最高。因此，所述的提取溶液组成为氯仿、乙腈和水(1：1：1)、乙腈和水(1：1)、氯仿、甲醇和水(1：1：1)、甲醇和水(1：1)，更优选氯仿、乙腈和水(1：1：1)。表1不同混合提取溶液之间的产量比较注：ab，代表不同混合提取溶液之间的积分值的差异显著性(P<0.05)*以氯仿、乙腈和水(1：1：1)提取积分值为100％换算得到的提取率。1.6.3破碎处理方式的优化(见表2)在氯仿、乙腈和水(1：1：1)提取液的基础上，进一步优化破碎处理方式。去除谱图中的4.55-5.16ppm水峰后，以0.002ppm的积分区间采用Amix(Bruker,Germany)软件对压水的NOESY1H谱的8.5-5.16ppm和4.55-0.5ppm以进行自动积分(绝对值)，并以TSP的积分值(0.018ppm至-0.018ppm)为1进行归一化，以不同提取方法的归一化积分值之和评价提取效率。冻融、超声和破碎循环次数不同的产量如表2所示，随着循环次数从高至低依次为：循环4次>循环3次>循环2次>循环1次，说明随着循环次数的增加，提取效率会增加，循环次数从1次增加到3次，提取效率有显著提高(P<0.05)，而循环次数从3次增加到4次，没有明显差异(P>0.05)。说明循环3次可以达到最优化循环次数。因此，所述的破碎处理方式为冻融、超声和破碎1-4个循环，更优选3个循环。表2冻融、超声和破碎循环次数不同之间的产量比较注：abc，代表不同提取次数之间的积分值的差异显著性(P<0.05)1.6.4重复提取次数的优化(见表3)在溶液与肉样破碎处理方式为冻融、超声和破碎循环3次的基础上，进一步破碎提取处理次数。去除谱图中的4.55-5.16ppm水峰后，以0.002ppm的积分区间采用Amix(Bruker,Germany)软件对压水的NOESY1H谱的8.5-5.16ppm和4.55-0.5ppm以进行自动积分(绝对值)，并以TSP的积分值(0.018ppm至-0.018ppm)为1进行归一化，以不同提取次数合并收集水相核磁谱图的归一化积分值之和评价提取效率。提取次数不同的产量如表3所示，随着提取次数从高至低依次为：5次>4次>3次>2次>1次，说明随着提取次数的增加，提取效率会增加，提取次数从1次增加到3次，提取效率有显著提高(P<0.05)，达到了95％以上，而提取次数从3次增加到5次，没有明显差异(P>0.05)。说明提取液收集3次可以达到最优化提取次数。因此，所述的提取次数为1-5次，更优选3次。表3不同提取次数之间的产量比较注：abc，代表不同提取次数之间的积分值的差异显著性(P<0.05)*以第5次提取积分值为100％换算得到的提取率。1.6.5重水含量的优化提取磷酸盐缓冲溶液中重水的含量直接与核磁检测过程中的压水的难易程度相关，水峰面积小时，核磁谱图的质量较高。如图2所示，重水含量为10％和20％时压水峰面积较大，重水含量为50％时压水峰面积较小，100％时面积最小。因此，提取缓冲溶液中重水的含量最优选为100％。1.6.6TSP内标含量的优化TSP作为核磁检测过程中的内标物质，其浓度应该与提取液所含物质的浓度相匹配。如图3所示，采样次数为128次，从TSP浓度0.01、0.05到0.1％，峰面积成比例增加。TSP浓度为0.1％时，其谱峰远远高于样品中的其他物质峰强度。因此，综合以上实验数据，更优选的TSP内标浓度应为0.01％。1.7在上述最优化提取方法下的肉核磁共振谱图结果猪背最长肌一维NMR标准图谱见图4所示，从猪背最长肌核磁谱图中指认大约42种代谢物，其中氨基酸19种，短链脂肪酸3种，味觉相关代代谢物7种，三羧酸循环代谢物5种，脂质代谢物8种。由此建立了猪背最长肌的代谢指纹图谱。1.8在上述最优化提取方法下的肌肉核磁共振谱图结果采用以上方法提取方法对猪背最长肌、腰大肌和股大肌提取后，测得的代谢物数据进行代谢组学分析，得分图见图5所示，三种不同肉质的肉明显分为三个聚类，从PC1维上，股大肌与背最长肌和腰大肌明显分开，说明在成分上差别相对较大，而背最长肌和腰大肌相对股大肌较为接近。