技术领域本发明涉及养殖技术领域，尤其涉及一种模式生物藻测定农药水分散粒剂毒性的方法。
背景技术：
藻类是一种用于生态系统中重要的初级生长者研究的重要模式生物。作为水生生态系统初级生产者的藻类，占据着重要的位置，其种类的多样性和数量会直接影响水生态系统的结构功能，很多研究都利用一些敏感藻种作为指示生物，且这些藻种对毒物敏感、易获得、个体小、繁殖快，在较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价，是一种良好的试验生物。广泛应用于生命科学、毒理学、环境科学和农业科学等领域。藻常被用于新化学物质登记中的藻类生长抑制毒性试验研究和农药登记藻类生长抑制毒性试验研究。目前，采用藻类进行农药水分散粒剂毒性筛选的研究报道较少，即使有部分报道和相关的研究性模型，但是缺乏相关的研究数据评估该模型的适宜性和可靠性，尚未成为成熟和被认可的毒性筛选模型。因此，提供一种易操作、实用性强的藻类筛选农药水分散粒剂毒性的方法尤其重要。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种易操作、实用性强的模式生物藻测定农药水分散粒剂毒性的方法。为解决上述技术问题，提供了一种模式生物藻测定农药水分散粒剂毒性的方法，包括以下步骤：S1、将农药水分散粒剂配制成梯度浓度的试验药液；S2、将生物藻原液用无菌水稀配制成藻稀释液；S3、将所述试验药液与所述藻稀释液混合，密封条件下培养72h，每隔24h对藻细胞计数，并记录藻细胞的生物效应和试验液的理化参数；S4、根据藻细胞的生物效应参数计算农药水分散颗粒剂对藻细胞的半数效应浓度EC50，判断农药水分散颗粒剂的毒性。上述的方法，优选的，所述S1步骤具体为：将农药水分散颗粒剂与培养基稀释液混合，配制成梯度浓度的试验药液；所述培养基稀释液为将BG11培养基稀释10倍后的溶液。上述的方法，优选的，所述步骤S2中所述生物藻原液为处于对数生长期的纯种藻。上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述，试验药液与所述藻稀释液的体积比为1∶1，所述藻稀释液中藻细胞的浓度为1.0×104～1.0×105个/mL。上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述培养的条件为：温度为21℃～24℃、光照强度为4440Lux～8880Lux、光照比为16h/8h。上述的方法，优选的，培养期间，每隔24h将所述试验药液与所述藻稀释液的混合液摇动5次以上。上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述藻细胞的生物效应包括藻细胞的抑制率和藻细胞的中毒情况；所述藻细胞的中毒情况包括：藻细胞畸形、藻液变白、藻细胞体积变小、藻细胞粘连或聚结。上述的方法，优选的，所述步骤S3中所述试验液的理化参数包括：试验液的水温、pH值和光照强度。上述的方法，优选的，所述步骤S4中采用统计软件SPSS，以农药水分散颗粒剂浓度的对数值为自变量x，以抑制率的机率值(抑制机率值即藻细胞的浓度变化值)为因变量y，建立毒力回归方程，计算受试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC50。上述的方法，优选的，所述步骤S4中所述农药毒级判断标准为EC50≤0.3mga.i./L，高毒；0.300＜EC50≤3.00mga.i./L，中毒；EC50＞3.0mga.i./L，低毒。上述的方法，优选的，所述模式生物藻测定农药水分散颗粒剂毒性的方法还设有空白对照组，所述空白对照组以藻稀释液与培养基的混合物培养生物藻。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种操作简便、实用性强的模式生物藻类筛选农药水分散粒剂毒性的方法；该方法可初步判断出农药水分散粒剂的毒性，速度快，精确度高。(2)本发明提供了一种模式生物藻类测定农药杀菌剂毒性的方法，急性毒性试验周期短，评价终点容易判断，具有简单、易操作的优势。具体实施方式以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1：一种本发明的模式生物藻测定农药杀菌剂毒性的方法，包括以下步骤：S1、试验药液的配制：BG11培养基稀释液：按照表1的配方配制BG11培养基配方，其制备方法为：将表1中的成分配制成相应母液浓度，并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至1000mL，在121℃下高压灭菌15min，密封并贴好标签，4℃冰箱保存，有效期2个月。将BG11培养基用蒸馏水稀释10倍后即为BG11培养基稀释液。表1：BG11培养基配方称取75％多菌灵水分散粒剂0.6667g，用BG11培养基稀释液溶解并定容至100mL容量瓶中，配制成浓度为5.00×103mga.i./L的储备液。依次移取上述储备液0.100、0.300、0.900、2.700、8.10mL，分别用BG11培养基稀释液定容至250mL容量瓶中，配制成浓度为2.00、6.00、18.0、54.0、162mga.i./L的试验药液。S2、藻稀释液的配制：用血球计数法测定藻原液(斜生栅列藻)的细胞浓度为3.25×106，并用无菌水稀释100倍，细胞浓度为3.25×104个/mL。S3、染毒：实验组：取步骤S1中配制的梯度浓度的实验药液50mL分别加入步骤S2中50mL的藻稀释液，得到梯度浓度的生物藻用培养基。试验中藻起始浓度为1.62×104个/mL。空白对照组：取50mL藻稀释液与50mLBG11培养基稀释液混匀得到生物藻用培养基。分别将实验组和空白对照组的生物藻用培养基装入三角瓶中，用锡箔纸封口，并置于智能人工气候箱中培养，控制在光照条件下放置16h，黑暗环境下放置8h；每天白天每隔2小时摇动1次，共摇动5次。S4、试验数据记录：测得试验期间各浓度组的水温为22.1℃～23.2℃，pH值为6.84～7.22，培养箱中的光照强度为5200Lx～5650Lx。染毒后48h、72h受抑制藻液细胞体积变小，观察并记录染毒后0h、24h、48h、72h藻细胞浓度(具体数据见表1)。表2：75％多菌灵水分散粒剂对斜生栅列藻生长抑制试验数据记录表注：表示藻细胞平均浓度(个/mL)S5、数据处理：采用统计软件SPSS12.0，以药剂浓度的对数值为自变量x，以(校正)抑制率的机率值为因变量y，建立毒力回归方程。计算该供试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC50和95％置信限，计算结果列于表3中。表3：75％多菌灵水分散粒剂对斜生栅列藻生长抑制试验结果表通过上述方法计算得到75％多菌灵水分散粒剂对斜生栅列藻生长抑制的EC50(72h)为10.5mga.i./L，95％置信限为8.38～13.1mga.i./L。S6、结果评价：根据EC50值判断农药毒级。农药对藻类的生长抑制毒性按EC50(72h)的大小划分为三个等级：高毒(EC50≤0.300mga.i./L)；中毒(0.300mga.i./L＜EC50≤3.00mga.i./L)；低毒(EC50＞3.00mga.i./L)。在本试验条件下，75％多菌灵水分散粒剂对斜生栅列藻生长抑制的EC50(72h)为10.5mga.i./L，大于3.00mga.i./L，毒性等级为“低毒”。实施例2S1、试验药液的配制：称取30％茚虫威水分散粒剂0.1667g，以BG11培养基稀释液(BG11培养基稀释液与实施例1相同)溶解并定容至100mL容量瓶，得到浓度为500mga.i./L的储备液，依次移取储备液0.960、2.400、6.00、15.00、37.50mL，分别用BG11培养基稀释液定容至250mL容量瓶中，配制成浓度为1.92、4.80、12.0、30.0、75.0mga.i./L的2倍药液。S2、藻稀释液的配制：用血球计数法测定藻原液(羊角月芽藻)的细胞浓度为4.00×106，并用无菌水稀释100倍，细胞浓度为4.00×104个/mL。S3、染毒：实验组：取步骤S1中配制的梯度浓度的实验药液50mL分别加入步骤S2中50mL的藻稀释液，得到梯度浓度的生物藻用培养基。试验中藻起始浓度为2.00×104个/mL。空白对照组：取50mL藻稀释液与50mLBG11培养基稀释液混匀。分别将实验组和空白对照组的生物藻用培养基装入三角瓶中，用锡箔纸封口，并置于智能人工气候箱中培养，控制在光照条件下放置16h，黑暗环境下放置8h；每天白天每隔2小时摇动1次，共摇动5次。S4、试验数据记录：测得试验期间各浓度组的水温为21.9℃～22.8℃，pH值为6.86～7.20，培养箱中的光照强度为5000Lx～6100Lx。染毒后48h、72h受抑制藻液细胞体积变小，观察并记录染毒后0h、24h、48h、72h藻细胞浓度(具体数据见表4)。表4：30％茚虫威水分散粒剂对羊角月芽藻生长抑制试验数据记录表注：表示藻细胞平均浓度(个/mL)S5、数据处理：采用统计软件SPSS12.0，以药剂浓度的对数值为自变量x，以(校正)抑制率的机率值为因变量y，建立毒力回归方程。计算该供试物对藻类生长抑制的半数效应浓度EC50和95％置信限，计算结果列于表5中。表5：30％茚虫威水分散粒剂对羊角月芽藻生长抑制试验结果表通过上述方法计算得到30％茚虫威水分散粒剂对羊角月芽藻生长抑制的EC50(72h)为5.35mga.i./L，95％置信限为4.28～6.66mga.i./L。(具体试验数据及结果见表2)。S6、结果评价：根据EC50值判断农药毒级。农药对藻类的生长抑制毒性按EC50(72h)的大小划分为三个等级：高毒(EC50≤0.300mga.i./L)；中毒(0.300mga.i./L＜EC50≤3.00mga.i./L)；低毒(EC50＞3.00mga.i./L)。在本试验条件下，30％茚虫威水分散粒剂对羊角月芽藻生长抑制的EC50(72h)为5.35mga.i./L，大于3.00mga.i./L，毒性等级为“低毒”。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。