一种快速便隐血双联检试纸条及其制备方法与流程

一种快速便隐血双联检试纸条及其制备方法，涉及便隐血标志物转铁蛋白和血红蛋白检测技术领域。

背景技术：

便隐血试验是指消化道出血量少，肉眼不见血色，少量红细胞被消化分解，以至在显微镜下也无从发现的出血，为检测这种出血而进行的试验。正常人的便隐血试验为阴性，而阳性结果常见于肠癌、消化道炎症或出血性疾病等患者粪便检测。因而便隐血检测试验对诊断消化道出血具有重要意义，也是目前进行消化道肿瘤普查、初筛和监测的有效手段，便隐血诊断试验结果已是临床上诊断消化道出血的常测指标。

便隐血诊断常用的普查方法有化学法和胶体金法两种，但化学法与胶体金法相比检测结果更易受到饮食和药物的干扰导致结果出现假阳性，而胶体金法采用单克隆抗体基于抗原抗体的免疫反应进行检测，在检测灵敏度和特异性等方面提高了检测的准确性，在临床上应用越来越广泛。其中便隐血检测观察的标志物为转铁蛋白(tf)和血红蛋白(hb)两种，目前在临床上使用的胶体金法一般只针对两种标志物其中的一种进行检测，这种检测具有快捷、高效和成本低的特点。两种蛋白相比各自具有独特优异的性质，如胃肠道中转铁蛋白相比于血红蛋白抗菌能力更强，性质更稳定不易分解，可降低检测样本需求，是肠癌蛋白表达的标志物，有助于提高检测的特异性；在血液中血红蛋白和转铁蛋白的比例为51.2∶1.0，粪便中比例为5.4∶1.0，血红蛋白可被成功检测的概率更高，有助于检测灵敏度的提升。但单一蛋白检测带来了一定的局限性主要表现在以下几个方面。单一进行血红蛋白检测会由于受到肠内细菌的作用及大肠粘膜产生的黏液成分影响而变性或者分解带来检测出现假阴性的情况；转铁蛋白在体内可能会因为遗传性无转铁蛋白血症、恶性疾病、手术等炎症为主的疾病导致含量偏低导致单一检测结果出现假阴性。

基于以上血红蛋白和转铁蛋白特性和检测局限性的分析，将两种标志蛋白单一检测合二为一，在一根试纸条一次检测中同时进行两种蛋白的检测，既可简化检测操作丰富检测输出数据，也能够降低假阴性的出现可能性，使检测结果更全面，为疾病的诊断分析提供更为真实有效的结果，提高消化道疾病的检出率。目前这种在一根试纸条一次检测中同时进行便隐血两种标志物转铁蛋白和血红蛋白的检测方法尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的：针对现有检测转铁蛋白tf和血红蛋白hb的技术的不足和缺陷，提供一种基于胶体金免疫层析技术，具有灵敏度高、反应时间短、不需要仪器设备和低 廉高效的特点，可同时实现转铁蛋白tf和血红蛋白hb的快速检测的方法，便于更加快速、灵敏和简便地检测人体中潜在直肠病变。

本发明的技术方案：一种快速同时便隐血双联检的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，其中试纸条由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、双联检金标结合垫、包被膜、吸水垫组成，双联检金标结合垫为吸附转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体的玻璃纤维膜，在包被膜上包被有分别用于检测的由转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体溶液印制的直线式隐形检测线t1和t2线，用羊抗鼠igg溶液印制的直线式隐形对照线c线1条，总共3条线：

所述的衬板为不吸水的硬质塑胶条；样品垫为玻璃纤维膜；包被膜为硝酸纤维素膜；吸水垫为吸水滤纸；

所述的转铁蛋白金标抗体为胶体金标记的转铁蛋白的单克隆抗体；

所述的血红蛋白金标抗体为胶体金标记的血红蛋白的单克隆抗体；

所述的胶体金为使用柠檬酸三钠还原的金纳米粒子；

所述的用于检测的转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体分别为：特异性识别转铁蛋白和血红蛋白的单克隆抗体。

所述快速同时检测转铁蛋白和血红蛋白的胶体金免疫层析试纸条的制备方法：

1)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；

2)双联检金标抗体的制备：用0.1mol/lk2co3调节胶体金溶液为ph8.5，将1ml胶体金溶液加入1.5ml离心管中，逐滴加入8μltf抗体溶液(浓度为1mg/ml)，25℃室温温和震荡1h，逐滴加入10％bsa，使bsa的终浓度为1％，持续搅拌30min，再将金标抗体溶液常温9600rpm离心8min，溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2-4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得转铁蛋白tf胶体金标记抗体；

所述重悬液为含1％蔗糖的5％bsa溶液；

用0.1mol/lk2co3调节胶体金溶液为ph8.5，将1ml胶体金溶液加入1.5ml离心管中，逐滴加入8μlhb抗体溶液(浓度为1mg/ml)，25℃室温温和震荡1h，逐滴加入0.5％casein，使casein的终浓度为0.05％，持续搅拌30min，再将金标抗体溶液常温9600rpm离心8min，溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2-4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得血红蛋白hb胶体金标记抗体；

所述重悬液为含1％蔗糖的0.25％casein溶液；

将两种完成标记的金标抗体混合，完成双联检金标抗体的制备；

3)将制备好的双联检金标抗体涂抹吸附于玻璃纤维膜中，26℃干燥，制备双联检金标结合垫；

4)包被转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体及羊抗鼠igg至包被膜：用喷膜仪分别将选定浓度的转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体喷载于包被膜的t1和t2线，以及羊抗鼠igg喷载于包被膜的c线上，37℃烘箱干燥4h备用；

5)检测试纸条的制作：将样品垫、双联检金标结合垫、包被有转铁蛋白抗体和血红蛋白抗体及羊抗鼠igg的包被膜、吸水垫依次衔接在衬板上，组成快速同时检测转铁蛋白和血红蛋白的胶体金免疫层析试纸条；

6)胶体金层析试纸条检测反应原理：本发明采用双抗夹心法，即样品中的转铁蛋白或者血红蛋白同时被固定在包被膜上的转铁蛋白抗体或者血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的转铁蛋白或者血红蛋白单克隆抗体捕获实现目标物检测。

当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中存在两种目标物，则两种目标物分别与相对应的金标抗体识别结合，继续泳动到t1和t2检测线和硝酸纤维膜上的抗体发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成两条红色的线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与控制线上的羊抗鼠二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有t1、t2和c线三条红色线条，表示样品两种目标物均为阳性。若待测样品中存在一种目标物，则该目标物与相对应金标抗体，与目标物识别的金标抗体继续泳动与检测线相应抗体结合，从而只一条检测线有红色线条出现，继续泳动与控制线上的羊抗鼠二抗发生免疫反应，形成红色线条，这样包被膜上会有两条红色线条，表示样品为一种目标物测试呈阳性。若待测样品中不存在目标物，则金标抗体不会与检测线抗体结合，从而检测线就不会有红色线条出现，继续泳动与控制线上的羊抗鼠二抗发生免疫反应，形成红色线条，这样包被膜上会有一条红色线条，表示样品为阴性。控制线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在目标物，控制线都应该显现，如果控制线不显色，则说明试纸条失效。

本发明的有益效果：本发明的检测试纸条具有下列优点：

1)特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性。

2)简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。

3)结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线t线和c线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线c线时，表示在被检样品中不含有目标物；显示t线和c线两条红色线条时，表示在被检样品只含有一种目检物；显示t1、t2线和c线三条红色线条时，表示在被检样品两种目检物都含有。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。

4)节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和elisa试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

本发明的有益效果：本发明是基于胶体金免疫层析技术进行转铁蛋白和血红蛋白双联检测方法，它具有灵敏度高、反应时间短、仪器设备便宜、方便易用和输出结果丰富等特点。

附图说明

图1、便隐血双联检胶体金层析检测试纸条侧面结构示意图。

图2、便隐血双联检胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。

具体实施方式

要制成便隐血双联检的胶体金免疫层析检测试纸条，首先需要制备胶体金，用于标记制备金标抗体；另外需要羊抗鼠igg抗体，用于制备对照线(c线)。

1)双联检金标抗体和金标物结合垫的制备：柠檬酸三钠还原法制备胶体金：由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将1g的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10ml，配制成浓度为0.1g/l的氯金酸溶液。取0.1g/l氯金酸溶液50ml放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min，在1400r/min磁力搅拌下，加入1％柠檬酸三钠水溶液0.8ml，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4℃保存备用。获得直径为20nm的胶体金溶液。

2)用0.1mol/lk2co3调节胶体金溶液为ph8.5，将1ml胶体金溶液加入1.5ml离心管中，逐滴加入8μltf抗体溶液(浓度为1mg/ml)，25℃室温温和震荡1h，逐滴加入10％bsa，使bsa的终浓度为1％，持续搅拌30min，再将金标抗体溶 液常温9600rpm离心8min，溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心：重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得转铁蛋白tf胶体金标记抗体；

所述重悬液为含1％蔗糖的5％bsa溶液；

用0.1mol/lk2co3调节胶体金溶液为ph8.5，将1ml胶体金溶液加入1.5ml离心管中，逐滴加入8μlhb抗体溶液(浓度为1mg/ml)，25℃室温温和震荡1h，逐滴加入0.5％casein，使casein的终浓度为0.05％，持续搅拌30min，再将金标抗体溶液常温9600rpm离心8min，溶液分为二层：透明上清，管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2-4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得血红蛋白hb胶体金标记抗体；

所述重悬液为含1％蔗糖的0.25％casein溶液；

将两种完成标记的金标抗体混合，完成双联检金标抗体的制备；

将制备好的双联检金标抗体涂抹吸附于玻璃纤维膜中，26℃干燥，制备双联检金标结合垫；

实施例1：把1.0mg/ml的转铁蛋白和血红蛋白包被抗体及羊抗鼠igg喷在包被膜上，分别作为检测线t1、t2和控制线c，在37℃烘箱干燥4h。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成4mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

实施例1：把1.5mg/ml的转铁蛋白和血红蛋白包被抗体及羊抗鼠igg喷在包被膜上，分别作为检测线t1、t2和控制线c，在37℃烘箱干燥4h。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成4mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

实施例1：把2.0mg/ml的转铁蛋白和血红蛋白包被抗体及羊抗鼠igg喷在包被膜上，分别作为检测线t1、t2和控制线c，在37℃烘箱干燥4h。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成4mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

检测操作方法：将便隐血双联检胶体金免疫层析检测试纸条样品端插入待测样 品液中，插入深度不超过标记线，约10-20秒钟取出检测试纸条，水平放置，15分钟左右肉眼观察判定检测结果。

结果判定：如果在包被膜上仅有c线一条红线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中不含有转铁蛋白和血红蛋白；如果在包被膜上c线和t1线两条红线都显现，说明在待测样品中含有转铁蛋白；如果在包被膜上c线和t2线两条红线都显现，说明在待测样品中含有血红蛋白；如果在包被膜上c线、t1线和t2线三条红线都显现，说明在待测样品中含有转铁蛋白和血红蛋白，表示消化道已有隐性出血；如果在包被膜上c线红线不显现，则表明试纸条已失效。

通过采用前述使用方法对本发明的隐血双联检测试纸进行了200例临床样本的验证试验，本试验结果显示，粪便隐血总阳性检出率双联法高于单克隆抗体法；在上消化道病变样本中阳性检出率双联法高于单克隆抗体法；双联法检测tf的阳性率高于单克隆抗体法检测hb的阳性率；在下消化道病变样本中，双联法与单克隆抗体法的阳性检出率无显著差异。表明检测粪便中人tf可以克服样本中hb或红细胞被分解变性而出现的假阴性结果，从而提高粪便隐血试验的准确性。结果显示试验产品与对照组无显著性差异，试验产品达到临床诊断金标准结果。

200例样本两种方法检测结果统计：

双联法是利用抗人tf抗体和抗人hb抗体进行隐血检测，特异性地针对粪便中人tf和人hb。灵敏度高，特异性强。双联法将抗人tf抗体和抗人hb抗体整合在同一试剂盒内，可同步检测tf与hb，互不干扰，二者优势互补。国外学者对hb以外的血液成分如tf、结合血红蛋白，纤维蛋白原等作为消化道出血指标进行了深入研究，结果发现tf具有消化道出血的特异性和对抗细菌分解的稳定性，且稳定性明显高于hb，经56℃30min处理，抗原活性无变化，而hb抗原活性大部分丧失，tf/hb双联胶体金诊断试纸可同时检测tf与hb，能大大减少假阴性反应的出现，提高临床诊断准确率。筛检方法效率评价结果表明，双联法的灵敏度高于单克隆抗体法组，但两种方法的特异度差异无统计学意义。因此，作为筛检方法应首选双联法，尤其对于上消化道出血显著提高了检出阳性率和准确率，真正意义上实现了全消化道出血性疾病的定性筛查。

综上所述，双联法灵敏度较高，特异性强，可同步检测tf与hb，优于粪便隐 血单克隆抗体法单纯检测hb，并有效地提高了真阳性率，确保了隐血检测的准确性，是消化道出血性疾病辅助诊断的可靠依据，值得广泛用于临床。

尽管上文对本发明的具体实施方式给予了详细描述和说明，但是应该指明的是，我们可以依据本发明的构想对上述实施方式进行各种等效改变和修改，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围之内。